蛋白质与酶工程实训报告.docx

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蛋白质与酶工程实训报告蛋白质与酶工程实训报告2014-2015学年第二实践学期蛋白质与酶工程综合实训报告专业：

生物技术班级：

B1204*学号：

*06*二一五年七月六日姓名李佳俊性别男专业生物技术班级B1204日程和实训地点实训内容简介：

蛋白质工程和酶工程是继基因工程之后发展起来的生物学技术，它们是基因工程的一个重要组成部分，或者说是新一代的基因工程。

蛋白质工程是指按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。

包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等，为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。

酶工程属于蛋白质工程的一部分，酶制剂在工业上的大规模应用，主要由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。

本次实训有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶、脲酶活力的测定（纳氏试剂比色法）、脲酶Km值简易测定、双酶法制备淀粉糖以及不同浓度果胶酶对澄清果汁收得率的影响等，我们希望通过此次实训可以增强自己的动手的能力，使理论和实践相结合，并且可以巩固在课堂上学习的理论知识。

本次实训主要分为三个部分：

1.实训一有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶以及脲酶的Km值和活力测定2.实训二双酶法制备淀粉糖3.实训三不同浓度果胶酶对澄清果汁收得率的影响实训报告实训一有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶以及脲酶的Km值和活力测定所需药品与仪器：

药品：

2%冰醋酸、64%和32%的丙酮、3%尿素底物溶液、磷酸盐缓冲液、1mol/lH2SO4溶液、硫酸铵标准溶液、纳氏试剂、脲酶液、30%酒精、0.1mol/L脲液、100g/l硫酸锌、100g/l酒石酸钾钠、0.5mol/lNaOH、显色液、新鲜大豆粉。

仪器：

恒温水浴锅、72型分光光度计、小漏斗、滤纸、移液器等。

（一）制备大豆脲酶一、实验原理：

脲酶广泛存在于微生物和动、植物组织中,1926年,SumnerJ曾用32%的丙酮溶液从刀豆粉中提取脲酶，并得到了结晶。

该酶相对分子质量为483000，由6个亚基组成，等电点4.9，溶于水和稀缓冲液,粗酶较稳定、纯酶不太稳定，结晶酶在低温下可稳定1年以上。

本实验用乙醇或丙酮从大豆中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点结合法制备该酶。

二、实验步骤：

1.称取10g黄豆粉和黑豆粉分别加入50ml32%丙酮溶液中。

2.在冰浴中持续摇动4-5min，4层纱布过滤，收集滤液。

3.将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10ml32%丙酮，再提取一次，4层纱布过滤，滤液在4，3500r/min条件下离心8min-10min，计量体积，取1ml酶液保存，供测酶活力和蛋白质用。

4.将提取的酶液置冰浴中，在缓慢搅拌下，用滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密PH试纸检测PH变化，观察产生浑浊的现象，直至PH4.9左右。

5.置4低温下过夜，可吸出沉淀。

6.将沉淀物仔细转入预冷的离心管，在4，3500r/min离心10min，上清液回收丙酮，沉淀即为脲酶粗品，风干后，称重，计算酶的收得率。

7.将所得粗酶溶于少许蒸馏水中，吸取适宜量用于测定酶活力和蛋白质，此即粗酶活力，酶溶液在冰浴中冷至2-4，搅拌下缓慢滴入等体积64%的预冷丙酮溶液，保持低温条件下让其缓慢析出结晶。

三、实验结果：

黄豆：

0.2462g黑豆:

0.0126g黄豆酶的收得率为：

0.2462g/10g=0.02426=2.426%黑豆酶的收得率为：

0.0126/10g=0.00126=0.126%结果分析：

酶的收得率比较低可能原因：

1.大豆粉在过滤是过滤不充分，有一部分在滤网上。

2.对沉淀的风干不彻底。

3.实验过程中操作造成酶液损失等。

（二）脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理：

脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH7.0。

氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可以测定脲酶活力的大小。

二、实验步骤：

按以下步骤操作：

取3支洁净干燥试管，编号：

1.空白；2.标准；3.样品。

按下表步骤加入实验制备的酶液及试剂：

1231）适当稀释的黄豆待测酶液（ml）001.002）标准硫酸铵溶液（ml）00.3003）蒸馏水（ml）2.001.701.004）1mol/L硫酸（ml）1.001.0005）25恒温水浴中平衡5min。

6）3%尿素（ml）1.001.001.007）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min，立即向样品管（3号管）加1mol/L硫酸1.00ml，终止反应。

8）另取三只洁净试管，分别对应于上面各反应液进行显色。

反应液（ml）0.200.200.20蒸馏水（ml）4.304.304.30纳氏试剂（ml）0.500.500.509）各管混匀后，30min内，用分光光度计测试：

比色记录A480nmA1A2A3A1:

0.487A2:

0.514A3:

1.716三、实验结果:

脲酶活力=（A3-A1）*标准管中的NH3微摩尔数/（A2-A1）*5min*酶样品毫升数*nn为酶样品稀释倍数测得数据：

吸光值吸光值吸光值平均值1空白00002标准0.6220.5860.5950.6013样品0.2340.1970.2130.214脲酶活力为：

11.67U/ml结果分析：

脲酶活力偏低的原因可能：

1.提取时遭到有机溶剂丙酮破坏。

2.提取时温度没有掌握好导致酶失活。

3.纳氏试剂的保存和浓度带来的影响。

（三）脲酶Km值简易测定一、实验原理：

尿素被脲酶催化水解产生碳酸铵。

碳酸铵在碱性的溶液内与纳氏试剂作用产生橙黄色碘化双汞铵，在一定范围内颜色深浅与碳酸铵多少成正比，故借比色法可测定单位时间所产生碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。

在保持恒温的合适条件（时间、温度、pH）下，以同一浓度的脲酶催化不同浓度的尿素分解，于一定浓度范围内与酶促反应成正比，因此用酶促反应速度倒数（1/v）为纵坐标，脲酶浓度倒数（1/c）为横坐标，依LK法作图，即可求得脲酶的Km值。

二、实验步骤：

取试管5支，编号,依下表加入试剂：

管号12345尿素稀释液浓度（mol/L）1/201/301/401/501/50尿素稀释液加入体积（mL）0.20.20.20.20.2尿素终浓度（mol/L）1/1001/1501/2001/2501/2501/15mol/LPB（PH7.0）0.60.60.60.60.6适当稀释的黄豆酶液（mL）0.20.20.20.2煮沸脲酶液（mL）-0.2摇匀37水浴15min100g/LZnSO40.50.50.50.50.5蒸馏水333330.5mol/LNaOH0.50.50.50.50.5充分摇匀，室温下静放5min，过滤，另取5支中试管，同上编号，按下表加入试剂滤液（mL）11111蒸馏水（mL）22222显色液（mL）0.750.750.750.750.75迅速摇匀，用分光光度计在420nm下测定各管A值。

5支试管在420nm下各管A值分别为0.294、0.278、0.254、0.243、0.180三、实验结果:

以尿素终浓度1/C为横坐标，1/A（1/v）为纵坐标作图，然后依1/C找出对应1/A点，将各点连线并延长与1/C轴相交，得-1/Km，计算出Km（以x10-nmolL-1表示）。

1/C1001502002501/A1.011.021.081.12Km值代表酶的亲和力，km值越大亲和力越小，反之则越大。

实训二双酶法制备淀粉糖所需药品与仪器：

药品：

可溶性淀粉、-淀粉酶、糖化酶、0.1molL-1HCl、无水CaCl2、碘液、活性炭。

仪器：

恒温水浴锅、烧杯、玻璃棒、天平、量筒等。

一、实验原理：

目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。

双酶法生产淀粉糖是以淀粉为原料，先经a-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成淀粉糖浆，a-淀粉酶它作用于淀粉时，使淀粉水解成糊精和一些还原糖。

糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶它作用于淀粉时，从淀粉分子的非还原端开始逐个地水解，生成葡萄糖和一些低聚糖。

二、实验步骤：

l.液化：

（1）准确称取100g淀粉.

（2）加250mL酸化水（pH6.06.4）配制成40的淀粉浆。

（3）加入0.2g氯化钙，加入lg-淀粉酶，在8590温度下保温45min左右，使淀粉液化成糊精。

（4）液化反应过程中用碘反应检测，至颜色变为黄棕色时还原糖值大约在15左右，即为终点。

升温至100并保温10min，使酶失活。

2.糖化：

（1）将液化淀粉液冷却至5560。

（2）用0.1mol/L盐酸调pH值至4.55.0，加入0.4g糖化酶。

（3）将水浴槽温度升至602，保温糖化20h，使糊精转变为葡萄糖和低聚糖（淀粉糖浆）。

3.脱色：

在80下搅拌30min后直至水分蒸干，得无色透明糖液。

工艺流程图:

淀粉淀粉浆淀粉液化成糊精碘反应检测糖化使糊精转变为葡萄糖和低聚糖脱水脱色干燥淀粉成品三、实验结果：

测得糖浆液重：

45.5g实训三、不同浓度果胶酶对澄清果汁收得率的影响所需药品与仪器：

药品：

桃子、果胶酶溶液、抗坏血酸溶液、明胶、活性炭。

仪器：

榨汁机、水果刀、PH试纸、温度计、定性滤纸、量筒、烧杯、刻度试管、恒温水浴器等。

一、实验原理桃汁中存在的果胶，有很强的保护胶体的作用，能保持稳定的浑浊度，同时，果胶溶液粘度大，如果不加处理，过滤是困难的，而且即使过滤之后，在果汁中所存在的果胶和其它高分子物质，在贮藏中，由于分解、与金属离子结合及其他作用，也会产生凝固沉淀，因此，在过滤之前，必须先进行澄清，常用的澄清方法主要有自然澄清法和热处理法、冷冻法、酶法、加澄清剂法、离心分离法、超滤法等。

酶法同其他方法比较，具有用量少、作用时间短、澄清效果好等诸多特点，且酶法的作用机制是生物降解。

二、实验步骤三、1、桃汁的制备将桃清洗后，去皮，去核，切成小块放入榨汁机。

榨汁时190g桃质量放入0.19g抗坏血酸溶液护色或不护色，将榨出的桃汁用滤布过滤数次，得到桃汁。

2、果胶酶澄清桃汁的工艺条件优化根据果胶酶对果胶等大分子物质的生物降解特性，本实验着重考察果胶酶用量（0.10%0.2%0.3），酶作用温度（305070）和时间（0.5h，1h，1.5h）3个主要影响因素，在单因素实验基础上，选用正交实验设计对酶法澄清熬制的工艺条件进行优化，从而确定果胶酶澄清桃汁的最佳工艺条件。

3、果汁澄清度的测定采用可见分光光度法，以蒸馏水作参比，在波长660nm下，测定桃汁的透光率，用透光率表示桃汁的澄清度4.沉淀向上述桃汁中均添加明胶0.02g，活性炭0.05g处理充分混匀后静置1h，使其充分沉淀，然后分别过滤，计量滤液体积。

5.列表记录结果用量筒测量澄清滤液（即桃汁）的体积，将结果填入下表。

L（33）正交实验结果第一组实验数据果胶酶温度时间660nm透光率V1（ml）V2（ml）R0.1700.51.8063050600.2300.51.7942450400.3500.51.8021250240.13011.55428.25056.4第二组实验数据果胶酶温度时间660nm透光率V1（ml）V2（ml）R10.2701.86536507210.3501.37034506810.1301.4153250640.50.3701.522365072第三组实验数据果胶酶温度时间660nm透光率V1（ml）V2（ml）R0.3%501h1.556183060%0.2%701h1.8762306%0.3%301.5h1.55853016%0.2%501.5h1.555163053%0.1%701.5h1.5576.83022%第四组实验数据果胶酶温度时间660nm透光率V1（ml）V2（ml）R0.50.1501.8063250640.50.3701.80732.5506510.1301.79141.5508310.2701.84034.550690.50.1501.806325064由以上四组实验数据得到L9（34）正交实验表试验号因素660nm吸收值V1（ml）V2（ml）实验结果（澄清率%）A（时间）B（温度）C（酶量）10.5300.21.79424504020.5500.11.80632506430.5700.31.80732.5506541300.11.79141.5508351500.31.55618306061700.21.876230671.5300.31.5585301681.5500.21.55516305391.5700.11.5576.8302256.349.730.346.3593156.33347Rj262823.3主次顺序B-A-C最优水平A1B2C1即温度影响最大，其次是酶解时间，而加酶量的影响较小。

最优条件是0.5h,500.1%。

6、实验结果计算：

澄清桃汁收得率（R）：

R=V1/V2100%式中：

V1为澄清桃汁体积，V2为处理前桃汁体积。

分别为：

24%、12%、30%、48%在一定范围内，澄清果汁的收得率随着果胶酶浓度的增大而增大，但当果胶酶浓度为6g/L时，澄清果汁的收得率达到最大值，此时，澄清果汁的收得率不会再随着果胶酶的浓度增大而增大，因此使果汁收得率达到最高时所需的果胶酶浓度为6g/L.【总结体会】时光荏苒，眨眼间我们就结束了蛋白质实训。

在这次实训中，我学到了很多。

指导教师评语：

实训报告成绩：

指导教师（签字）：

年月日