大孔吸附树脂分离纯化迷迭香中迷迭香酸的研究.docx
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大孔吸附树脂分离纯化迷迭香中迷迭香酸的研究
大孔吸附树脂分离纯化迷迭香中迷迭香酸的研究
【摘要】目的考察大孔吸附树脂对迷迭香酸的吸附性能和纯化效果，寻找从迷迭香中分离纯化迷迭香酸的较优工艺。
方法以迷迭香酸的吸附量、解吸率和所得粉末中迷迭香酸的含量为指标，从4种大孔吸附树脂中筛选出较好的D101树脂。
通过静态和动态实验，对迷迭香酸在D101树脂上吸附和解吸的条件进行考察和优化。
结果采用D101树脂从迷迭香中分离纯化迷迭香酸的较优工艺参数为：
上柱液pH3～4，速度2BV/h，溶液处理量9BV，洗脱剂为40%乙醇，洗脱速度1BV/h，收集洗脱液3BV。
按此工艺条件，迷迭香酸的解吸率为%，3BV洗脱液浓缩干燥后，所得粉末中迷迭香酸含量为%，树脂经8次重复使用，吸附量和分离效果无明显下降，可以重复使用。
结论D101树脂可从迷迭香中较好的分离纯化迷迭香酸，具有潜在的工业应用价值。
【关键词】迷迭香酸；大孔吸附树脂；迷迭香；分离；纯化
ChinaAbstract:
ObjectiveToevaluatetheabsorptioncapabilityandpurificationeffectofrosmarinicacidonmacroporousabsorptionresin,andtofindabettermethodtoseparateandpurifyrosmarinicacidfromRosmarinusofficinalisL..MethodsMacroporousresinD101wasmoresuitablefortheseparationandpurificationofrosmarinicacidamongfourkindsofresinsselectedwithabsorptioncapacity,desorptionratioandthecontentofrosmarinicacidinthepowderobtainedascriteria．Optimalconditionsforabsorptionandelutionofrosmarinicacidwereperformedwithstaticanddynamicresultshowedthattheoptimumtechnologyparameterswereasfollows：
thepHvalueofsolution3to4,flowrate2BV/h,solutiontreatmentcapacity9BV,androsmarinicacidabsorbedcanbedesorbedby40%alcoholatflowrate1BV/h,andcollected3BVeluent.Thedesorptionratioofrosmarinicacidwas%accordingtotheabsorptionanddesorptionconditionsabove,andthecontentofrosmarinicacidinpowderobtainedfrom3BVeluentthroughconcentrationanddrywas%.Aftereighttimesofrepeateduse,theabsorptioncapabilityandseparationeffectofthemacroporousresinwasnotdecreasedobviously,andthemacroporousresincouldbeacidinRosmarinusofficinalisL.canbeeffectivelyseparatedandpurifiedwiththemacroporousabsorptionresinD101,andhasthepotentialapplicationvalueinindustry.
Keywords:
Rosmarinicacid；Macroporousabsorptionresin；RosmarinusofficinalisL.；Separation；Purification
迷迭香RosmarinusofficinalisL.系唇形科迷迭香属植物，为多年生常绿小灌木，原产于地中海地区，国内近年来大面积的引种栽培。
该植物具有抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等活性，广泛应用于医药、食品和饮料等行业。
研究发现［1～4］：
该植物所含的水溶性酚酸成分—迷迭香酸具有明显的抗氧化、抗炎、免疫抑制、抗血栓、抗菌、抗病毒等生物活性。
迷迭香酸不仅迷迭香植物含有，也存在于其他唇形科植物如紫苏、丹参，但近年来国外市场对从迷迭香中提取的不同含量的迷迭香酸粗品比从其他植物中提取更为关注。
关于从迷迭香中提取迷迭香酸的研究有文献报道［5］，但未见提取后纯化工艺的研究，更未见采用大孔吸附树脂分离纯化迷迭香中迷迭香酸的报道。
近年来，随着大孔吸附树脂在天然产物活性成分分离方面应用的日益广泛［6，7］，其优良的分离纯化效果，可反复再生使用和低成本的应用特点，非常适合于大生产的要求。
为此，采用大孔吸附树脂法，对迷迭香中迷迭香酸的分离纯化工艺进行研究。
现报道如下。
1
仪器与材料
仪器LC-10AVP高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；METTLERTOLEDOAL204电子天平，瑞士梅特勒公司产品；R-205B旋转蒸发仪，上海申胜生物技术有限公司产品；PHB-5型笔试pH计，上海康仪仪器有限公司产品。
试剂大孔吸附树脂：
D101，天津农药股份有限公司产品；AB-8，南开大学化工厂产品；XAD-2，美国罗门哈斯公司产品；HP-20，日本三菱化学公司产品；迷迭香酸对照品，天津尖峰天然产物公司产品；甲醇为色谱纯，美国Dima公司产品；其他试剂均为分析纯，广州化学试剂厂产品。
药品迷迭香粉末：
迷迭香海南舒普生物科技有限公司提供，经该公司鉴定为唇形科植物迷迭香RosmarinusofficinalisL.的干燥地上部分，粉碎成粗粉，备用。
2方法与结果
迷迭香酸的含量测定［8］
色谱条件色谱柱：
Shim-packVP-ODS（mm×150mm，μm），流动相：
甲醇－％甲酸溶液（45∶55，V/V），柱温：
30℃，检测波长：
330nm，流速：
ml/min。
迷迭香酸标准曲线的测定精密称取迷迭香酸mg，置25ml容量瓶中，用稀乙醇溶解后，定容，混匀，得mg/ml对照品溶液。
再精密量取ml该对照品溶液，置100ml的容量瓶中，用稀乙醇定容，得mg/ml的迷迭香酸对照品溶液。
分别吸取mg/ml迷迭香酸对照品溶液5，10，20μl以及mg/ml迷迭香酸对照品溶液5，10，20μl，按上述色谱条件分别进样测定，记录迷迭香酸对应的色谱峰面积。
以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，线性回归得回归方程：
Y=3455+2188，r=6。
表明迷迭香酸在～μg范围内进样量与色谱峰面积具有良好的线性关系。
样品溶液的制备及测定称定迷迭香水提物mg或迷迭香提取物mg，置100ml容量瓶中，加稀乙醇约50ml，超声10min，冷却后用稀乙醇定容，混匀，μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为样品溶液。
树脂静态和动态实验中的溶液样品，根据样品中迷迭香酸可能的含量，直接混匀或加入一定量的稀乙醇稀释混匀，μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为样品溶液。
取上述各种样品溶液适量，进样20μl，采用外标法测定迷迭香酸的含量。
吸附原液的制备称取迷迭香粉约20kg，依次加入160，120L纯水，90～95℃提取2次，过滤，合并两次提取液，减压浓缩，喷雾干燥，混匀，得迷迭香水提物kg，经测定，迷迭香酸的含量为%，冷藏备用。
临用前，取上述迷迭香水提物适量，加纯水，根据需要制成至固体含量1%～10%的水溶液，作为吸附原液。
吸附树脂的预处理树脂先用乙醇浸泡溶胀24h，湿法装柱，用95％乙醇洗脱，至流出液加5倍量的纯水不变白色浑浊为止。
再用大量的纯水洗尽柱内乙醇，然后依次用3倍树脂体积的5%盐酸、纯水、4％氢氧化钠浸泡、流过树脂柱，最后用大量纯水洗至流出的水近中性，作为湿树脂，备用。
吸附量和解吸率的计算试验中的吸附量、吸附率和解析率的计算公式如下：
Q=/V式①
A=/C0V0×100%式②
D=CDVD/式③
式①、②、③中：
Q为吸附量；A为吸附率；D为解吸率；C0为吸附原液中迷迭香酸的浓度；V0为吸附原液体积；Ce为迷迭香酸的平衡浓度，或上柱和水洗时流出液合并后溶液中迷迭香酸的浓度；CD为解吸液中迷迭香酸的浓度；Ve为吸附原液体积，或上柱和水洗时流出液合并混匀后的体积；V为湿树脂体积；VD为解吸液体积。
吸附树脂的筛选准确量取经预处理的4种湿树脂各300ml，分别装入直径为40mm的玻璃柱，各上样2000ml8%吸附原液，速度～ml/min，然后用600ml纯水以相同的速度洗脱，上样和水洗时流出液合并，分别混匀，测定其迷迭香酸的浓度，计算4种树脂对迷迭香酸的吸附量。
然后分别依次用750ml70%乙醇洗脱，洗脱速度～ml/min，得70%乙醇洗脱液，混匀，测定其迷迭香酸的浓度，计算4种树脂的解吸率。
将70%洗脱液浓缩，冻干，得固体粉末，测定迷迭香酸的含量。
筛选实验的结果见表1。
表1不同树脂对迷迭香酸的吸附和解吸效果
表1可知，D101树脂虽在吸附量和解吸率上和XAD-2、HP-202种树脂没有明显差别，但其洗脱液浓缩、干燥所得粉末中迷迭香酸的含量明显大于其余树脂，故选用D101树脂对迷迭香酸的分离纯化工艺进行研究。
静态实验
吸附的动力学过程准确量取ml经预处理的D101湿树脂，置250ml三角瓶中，环境温度30℃左右，加入100ml8%吸附原液，分别在设定的时间点取样，测定D101树脂静态吸附的动力学过程。
。
图1可知，开始40min内，树脂对迷迭香酸的吸附很快，随后变慢，而在60～90min之间又突然变快，150min后吸附增加缓慢，300min以后吸附基本达到动态平衡。
温度对吸附性能的影响准确量取ml经预处理的D101湿树脂，置250ml三角瓶中，加入100ml8%吸附原液，共6份，分别置于10，20，30，40，50，60℃的环境下，静态吸附24h。
以吸附率作为吸附性能的评价指标，考察温度对D101树脂吸附性能的影响。
结果表明，10～40℃之间D101树脂的吸附性能较稳定，当温度超过50℃时，吸附率明显下降。
故在正常的工作环境下，温度对树脂吸附迷迭香酸的性能无明显影响。
pH值对吸附性能的影响准确量取ml经预处理的D101树脂，加入到250ml的三角瓶中，共6份，分别加入100mlpH值为3，4，5，6，7，8的8%吸附原液，静态吸附24h。
考察吸附原液pH值对D101树脂吸附性能的影响。
结果见表2。
表2可知，吸附原液的pH3～4时吸附量较大，随着pH值的增加，迷迭香酸的吸附量减少，尤其是pH大于后，所以吸附原液宜调pH3～4。
不同乙醇浓度的静态解吸效果准确量取ml在8%吸附原液中饱和吸附的D101树脂，加入到250ml的三角瓶中，共6份，分别加入20%，30%，40%，50%，60%，70%不同浓度的乙醇静态解吸24h，以考察迷迭香酸解吸的较佳乙醇浓度，结果见表3。
表2不同pH值条件下的吸附量表3不同乙醇浓度的解析效果
表3可知，50%以上的乙醇浓度即可将迷迭香酸完全解吸，40%乙醇的解吸率为%，略小于50%乙醇的解吸率，但解吸时洗脱物中迷迭香酸的含量也是要考虑的重要因素。
故最佳乙醇解吸浓度有待动态实验的进一步考察。
动态实验
不同上样速度对树脂动态吸附性能的影响将500ml经预处理的D101湿树脂湿法装柱，环境温度30℃下，用配制的8%迷迭香水提液作为吸附原液上柱，在相同的实验条件下，加液量分别为3,6，9，12，15，18BV，分别以1，2，3，4BV/h的流速在同一试验条件下进行动态吸附性能的考察，结果见图2。
图2可知，上样量最大为9BV，而此时上样速度超过2BV/h时即有泄漏。
故以2BV/h的速度上样9BV的8%吸附原液较好。
树脂动态解吸曲线的考察取500ml经预处理的D101湿树脂湿法装柱，环境温度30℃下，以2BV/h的速度上样4500ml吸附原液，然后用大量的纯水冲洗至基本无色，分别用40%乙醇、50%乙醇洗脱，洗脱速度1BV/h，洗脱液流出125ml时，开始收集洗脱液，每份125ml，分别测定每份洗脱液中迷迭香酸的浓度，据此绘制洗脱曲线，结果见图3。
从图3可知，用40%乙醇和50%乙醇洗脱，解吸峰均集中、较高。
按接收1500ml的洗脱液计算，40%乙醇、50%乙醇洗脱的解吸率分别为%，%。
将合并后的1500ml40%乙醇洗脱液和1500ml50%乙醇洗脱液，分别浓缩、冻干，得淡黄色粉末，测定粉末中迷迭香酸的含量，分别为%，%。
结合“”项的实验结果，优先选用40%乙醇进行解吸。
3讨论与结论
随着pH值的增加，迷迭香酸的吸附量减少，尤其是pH大于后，说明吸附原液的pH对树脂的吸附性能影响很大，这可能与迷迭香酸含有羧基有关，于随着pH值的增加，迷迭香酸解离的程度增加，解离程度越大，水溶性和极性越大，而D101为非极性吸附树脂，故吸附性能降低。
于pH过小有引起迷迭香酸消旋和聚合的可能，故在考察pH对吸附性能的影响时，未考察pH小于3的情况。
选用40%乙醇解吸迷迭香酸，往往不能解吸迷迭香水提液中极性较小的成分，这些成分如果不解吸，树脂的性能会很快下降，故为了保持D101树脂良好的吸附和分离效果，每次用40%乙醇解吸后，都要再用3BV的90%乙醇解吸吸附在树脂上的极性较小的成分，再用大量的纯水洗柱，方可重新上样。
经预处理的D101树脂，按上述上样、解析、再生的工艺，测定8次重复使用中每次树脂的吸附量和解吸率，表明树脂的吸附性能和分离效果无明显下降，可以循环使用。
D101树脂可从迷迭香中较好的分离纯化迷迭香酸，具有潜在的工业应用价值。
其较优的工艺路线为：
迷迭香经水提后，浓缩，调节pH3～4，上D101大孔吸附树脂吸附，上样量9BV，上样速度2BV/h，水洗至基本无色后后，用40%乙醇洗脱，解吸速度1BV/h，收集洗脱液3BV，解吸率%，洗脱液浓缩、冷冻干燥，得淡黄色粉末，迷迭香酸的含量为%，产品淡黄色，水溶性好，可满足市场对迷迭香酸含量的要求。
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