石墨烯基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对小分子的分析.docx

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石墨烯基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对小分子的分析

石墨烯作为一种新型的基质采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对小分子的分析

XiaoliDong,JinshengCheng,JinghongLi,andYinshengWang

DepartmentofChemistry,UniversityofCalifornia,Riverside,California92521-0403,andDepartmentofChemistry,KeyLaboratoryofBioorganicPhosphorusChemistryandChemicalBiology,TsinghuaUniversity,Beijing,China100084

采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）方法，石墨烯被首次用于作为分析低分子量化合物的基质。

极性化合物包括氨基酸，多胺，抗癌药物，核苷被成功地进行了分析。

此外，包括类固醇在内的非极性化合物，可检测到具有较高的分辨率和灵敏度。

与传统的基质相比，石墨表现出对非极性化合物的解吸/电离效率高。

石墨烯作为基质的使用避免了分析物的破碎并提供了好的重现性以及高的耐盐性，强调了石墨烯作为基质对实际样品在复杂样品基质中基质辅助激光解吸质谱分析的潜在应用。

我们也论证了石墨烯在鲨烯的固相萃取中作为吸附剂可以显著提高检出限。

这项工作不仅打了石墨烯应用的新领域，而且提供了小分子量化合物在如新陈代谢研究和天然产品特性等领域高速率分析的一项新技术。

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）1提供了对高分子量种类的一个简单分析方法，如蛋白质，DNA/RNA，多糖，合成高分子等等。

2-6连同TOF-TOF质谱仪的使用，它也提供了具有高速，准确度和灵敏度分子的结构信息。

对于低分子量分析物（相对分子质量＜500Da，基质离子干扰和检测器饱和度在（MALDI-TOFMS）中是不可避免的，这提出了模糊和困难小分子的描述。

目前，已经做出了很多努力来消除基质离子干扰，通过使用不同基质物质，如解析/电离多孔硅，10-13高分子量的基质，17,18等等。

不同种类的碳材料，包括石墨颗粒，19石墨板，17在不同溶剂中的石墨悬浮物，17,20有机硅聚合物中包裹的石墨，21活性炭粉末，18和最近的铅笔芯，22,23已经被建议作为MALDI-TOFMS的替代基质。

石墨烯本质上是石墨的单层原子平面。

在2004年，Chernogolovka24通过使用透明胶带发现了石墨烯平面并提高了它的电导性。

后来，石墨烯激发了人们强烈的兴趣，在理论上和实验上被广泛地研究，石墨烯也许具有单分子传感器的潜在应用，25弹道晶体管，24透明导电电极26和在多巴胺的选择性检测。

27然而，石墨烯从未作为基质在MALDI-TOFMS使用。

在这项研究中，石墨烯在小分子的MALDI-TOFMS分析被用作一个新型基质。

石墨烯捕获分析物分子的作用和在激光辐射担当能量插座。

由于它的纳米层片结构大的表面积，它可以紧紧地依附于样品目标物上。

这阻止了在真空下石墨烯从样品目标物上解析，这也避免了离子源和真空系统的污染，另一方面，由于它的简单单层结构和独特的电学特性，分析物在石墨烯基质层片上解吸/电离效率可以被提高。

已经被发现对小分子分析石墨烯作为基质的使用可以显著地简化样品处理和消除北京机制离子的干扰。

这个新基质已经被测试并证明了在氨基酸，多胺，抗癌药，核苷和类固醇的浅显分析上有用。

实验部分

化学品和材料。

三氟乙酸（TFA）和α—氰基—4—羟基肉桂酸（CHCA）从Fluka（St.Louis,MO）购买。

胆固醇，鲨烯，环磷酰胺，胞嘧啶β—D—阿糖，谷氨酸，组氨酸，色氨酸，精素的多胺，亚精胺，丁二胺从Sigma（St.Louis,MO）获得。

其它的试剂除了乙醇和乙腈为色谱纯外都是分析纯。

所有试验中用的水都是从超纯水净化系统得到（Millipore,Milford,MA）。

石墨烯的准备。

石墨烯用先前描述的程序制备。

28得到的石墨烯由透射电子显微镜（TEM）分析表征，使用JEM-2010投射扫描电子显微镜（JEOL,Tokyo,Japan），在100kV的加速电压下，在BrukerD8—推进X射线粉末衍射上粉末X—射线衍射（Madison,WI）。

分析溶剂的制备。

精胺，亚精胺，丁二胺，环磷酰胺，胞嘧啶β—D—阿糖，2’—脱氧核苷（dA，dG，dC，dT），谷氨酸，组氨酸，色氨酸被溶解在水中在10mM浓度作为储备液，混合溶液通过用水稀释储备液至分析物的浓度达到0.5-1.0mM制得。

胆固醇和鲨烯被溶解在乙醇中，形成10mM的原液，样品溶液在其他浓度通过逐步稀释获得。

所有的储备溶液均保存在∼4°C以备使用。

MALDI-TOFMS制备样品。

CHCA基质作为一个饱和溶液在0.1%TFA在水/乙腈（2/1，v/v）被准备。

石墨烯（1mg）被分散在1mL乙醇溶液中并进行3min声处理，用移液管迅速移取1μL悬浮液在样品目标物上。

室温放置5-10min后形成一个薄层，用移液管移取0.5μL分析物溶液到基质薄层上，放置5-10min把溶剂蒸发掉，通过MALDI-TOFMS进一步分析。

石墨烯作为吸附剂和基质固相萃取（SPE）优先于MALDI-TOFMS分析。

2mg石墨烯样品用乙腈和水冲洗两次并悬浮于0.3mL50%（v/v）甲醇中。

声波降解3min后，移取10μL悬浮液到100μL分析液中。

混合物声波降解10min。

以13000rpm离心分离10min，取走上清液，分析物被富集的石墨烯颗粒被再次悬浮于5μL甲醇水（1/1，v/v）溶液中。

最后，移取石墨烯1μL的悬浮液于样品目标物上，样品目标物被再次室温放置10-15min，把溶剂蒸发掉，用MALDI-TOFMS进一步分析。

质谱分析。

激光解吸/电离和基质辅助激光解吸/电离质谱在VoyagerDESTRMALDI-TOF质谱分析仪上以正面反射模式得到（AppliedBiosystems,Framingham,MA）。

质谱分析仪被装备有在337nm以3ns持续脉冲的脉冲氮激光器。

加速电压，栅极电压，延迟提取时间被分别设置为20kV，65%，和190ns。

每个质谱随着100激光射击得到。

结果和讨论

在这项工作中，石墨烯被首次用作基质进行MALDI-TOFMS分析。

石墨烯是一个只有一个原子厚度的二维碳晶体。

由于它的独特结构和电学特性，24石墨烯已经被越来越多的使用并且吸引了越来越多的注意。

石墨烯在荧光传感技术上的应用由于它的优异的荧光共振能量转移能力已经被取得。

28石墨烯表现出在270nm最大紫外（UV）吸附29并且波长的吸附范围250-350nm。

这样，我们推断到它或许可以充当用典型工具装备的N2激光提供的337nm灯的MALDI-TOFMS分析的基质。

石墨烯的表征。

我们首次表征石墨烯的性能被用在这个研究中。

图S1a（提供信息）现实的是石墨烯的TEM图像。

可以看到，石墨烯几乎透明的薄片形状像褶皱的丝绸波纹。

28纳米层片结构被进一步通过XRD确认表征（图S1b；峰在2θ=24.7°显示了石墨烯纳米层片的存在30）。

明显地，当它被用于MALDI-TOFMS分析，这些特殊的单层特性可以为石墨烯提供一些独特的性能。

首先，石墨烯声处理后可以被均与的分散在乙醇中。

因此，在样品目标物上，它可以形成一个均匀基质层片。

此外，这个层片可以紧紧地吸附到样品目标物上并且不容易被水或乙醇冲洗掉。

另外，单层结构可以提供一个大的比表面积，它提高了分析物对基质层的吸附能力，从而加强MS信号。

单层形态的其它优点可以包括优异的能量转移能力并且由于这些材料的简单结构，相关的基质离子有较少的干扰。

这些特性表明石墨烯可以充当MALDI质谱一个好的基质。

用石墨烯对氨基酸分析。

氨基酸被首次选为代表性的小分子，使用石墨烯作为基质进行MALDI-TOFMS分析。

图1展示了氨基酸混合物包括谷氨酸，组氨酸，色氨酸在激光直接成像（LDI）模式没有其它基质（图1a）和用CHCA（图1b）或石墨烯（图1c）作为基质的质谱。

每个化合物的浓度为0.5mM。

毫不吃惊的是，在没有基质的LDI模式下分析物没有信号（图1a）。

三种氨基酸在[M+H]+离子（谷氨酸,m/z147；组氨酸,m/z156；色氨酸,m/z205）用常规的CHCA基质被捕捉（图1b）。

然而，当CHCA被用作基质，强的背景干扰是存在的，这可以极大地掩盖低分子量化合物的检测。

使用石墨烯，三种氨基酸在[M+Na]+离子被检测到高峰（图1c），更重要的，基质离子干扰完全被消除，另外，分析物很少或没有碎片离子峰被观察到，这表明石墨烯对MALDI-TOFMS分析是一个温和的基质。

激光功率的影响也被研究，当激光功率被设置为1500（任意单位），石墨烯和CHCA产生的质谱都有好的信噪比（S/N）。

当激光功率设置降为1300，对三种氨基酸中任一种采用CHCA作为基质几乎没有信号。

然而，用石墨烯做基质可以获得一个好的信号。

明显地，当石墨烯被用作基质进行解吸/电离小分子是需要低的激光功率。

这可能由于它的纳米层片结构，这促进了分析物的有力吸附和对分析物的有效能量转移。

明显地，在适当条件下，小分子混合物的分析使用MALDI-TOFMS采用一个有机基质可以获得，但是基质干扰存在一个真正的问题（图1b）。

然而，这个问题可以通过解吸/电离质谱用石墨烯作为基质被避免。

此外，成功的MALDI实验分析不同级别小分子强烈取决于基质的选择和样品制备方法，但是这仍旧为一个经验思考。

这项工作使用石墨烯，分析物溶液被放置在探针上的石墨烯层片上，石墨烯充当基质介质捕捉分析物分子。

因此，石墨烯作为基质的使用消除了不同分析物和简化样品准备的优化溶剂条件。

Figure1.MALDI-TOFmassspectraofasolutioncontainingGlu（m/z147,[M+H]+;m/z169,[M+Na]+）,His（m/z156,[M+H]+;m/z178,[M+Na]+）,andTrp（m/z205,[M+H]+;m/z227,[M+Na]+;m/z249,[M+2Na-H]+）intheLDImodewithoutamatrix（a）andwithamatrixofCHCA（b）orgraphene（c）.A0.5µLsamplesolutionwasdepositedonthetargetspots,andtheconcentrationsofallanalyteswereat0.5mMeach.

小分子其它类型的分析。

在分析物的解吸/电离石墨烯的使用被使用其它类型的分析物进一步研究。

多胺在DNA合成和基因表达上充当着重要的角色，31-33在植物和动物中它们参与了细胞的迁移，增殖，变异。

34精胺，亚精胺，丁二胺是细胞中三种主要的多胺。

我们使用石墨烯辅助的LDI-TOFMS进一步分析多胺。

相似地，在混合物中从石墨烯和钠加合物（i.e.,[M+Na]+离子）所有的成分被释放，当亚精胺可以被电离为[M+H]+离子（图2）。

有趣的是，金属离子是氨基酸和多胺主要的化学加合物，使用石墨烯作为基质，用MALDI分析，这些化合物中大多数的[M+H]+峰在质谱中观察不到。

这令人想起用氧化的碳纳米管作为基质氨基酸分析得到的结果。

35石墨烯辅助LDI可以建立一个简便的方法进一步分析从组织或细胞中提取的多胺。

我们也使用石墨烯辅助LDIMS分析抗癌药物。

图3a显示了环磷酰胺和胞嘧啶β—D—阿糖的质谱。

m/z在胞嘧啶β—D—阿糖和环磷酰胺[M+Na]+离子在266和283被分别分配。

环磷酰胺包含两种氯化物原子，同位素峰被分配到283和285。

我们接着研究这些药物在高盐溶液的检测，因为这些药物经常被用于补充氯化钠注射到人体，它的新陈代谢的研究可以包含分析物存在于富含盐的基质中（例如，尿和血浆样品）。

图3b显示了被准备在500mMNaCl溶液中两种药物的分析。

尽管信号强度轻微减小，但它们可以被持续地检测到，这说明了这项新技术对药物新陈代谢研究的潜能。

Figure3.MALDI-TOFmassspectraofcyclophosphamideandcytosine-D-arabinofuranosideongraphene.Thepeaksatm/z283and266

correspondtothe[M+Na]+ionsofcyclophosphamideandcytosine-D-arabinofuranoside,respectively:

（a）sampleinawatersolution;（b）sampleina500mMNaClsolution.

四种核苷的混合物也被成功地用石墨烯作为基质进行MALDI-TOFMS分析。

在图4中描述，dC，dT，dA，dG的[M+Na]+离子m/z被分配到250,265，274和290。

背景非常干净，没有其它碎片峰被观测到。

非极性化合物的分析。

其它例子是胆固醇和鲨烯的分析，后者是胆固醇合成的前导。

这两种化合物都是高度疏水性并且不容易被质子化和电离。

胆固醇先前用一个传统的基质如2,5-二羟基苯甲酸（DHB）分析，但是基质的干扰极大地掩盖他的检测。

36当使用石墨烯作为基质，这两种化合物在高信噪比时可以被同时解吸和电离。

如图5b显示的，两者的[M+Na]+离子在高强度被电离，由于没有基质干扰有清晰的背景。

鲨烯的峰强度几乎高于胆固醇的三倍，这可能是由于从石墨烯基质上鲨烯和胆固醇不同解吸/电离过程。

相比较之下，CHCA被用作基质分析这两种化合物。

分配胆固醇的峰（m/z369）显示缺乏水，

分配给在m/z378和338的峰显示基质相关的离子（图5a）。

然而，胆固醇在石墨烯作为基质被作为完整的钠加合物离子（m/z409）被检测（见上），显示了石墨烯在MALDIMS是温和的基质。

有趣地，用CHCA作为基质在一样的实验条件的其它方面，鲨烯没有信号被检测到，这可能归于非极性化合物用CHCA作为基质弱的电离；非极性化合物难以被电离。

37

银离子被加入到非极性化合物溶液中辅助它们的电离，37但是它将导致目标化合物的两个同位素峰（由于Ag+的引入）和样品制备的复杂化。

在我们的工作中，鲨烯溶液用乙醇制备，仅仅存放在目标物的石墨烯层面上，石墨烯担当者基质媒介捕捉分析物分子。

如图5b描述的，使用石墨烯作为基质，鲨烯即使在低的激光能量（1450）可以容易地被检测到，不用另外的其它辅助溶剂。

详细的原理还不是很清楚，但是我们可以质疑有助于鲨烯在石墨烯上简单解吸/电离的两个因素。

一个是通过在石墨烯和非极性化合物疏水性/疏水性的相互作用，另一个与石墨烯的电学性能相关，28在石墨烯纳米层片上共轭电子对的涌出可以作用于做紫外激光辐射能量容器和促进分析物的解吸/电离能量输送器。

因此，石墨烯在能量传送上的能力通过作为各种类型的小分子激光感应解吸/电离基质的有用性得到证明。

固相萃取中石墨烯作为吸附剂。

石墨烯是具有大的比表面积的富电子疏水性材料。

因此，它担当着固相萃取合适的材料，为了测试这个，我们用石墨烯从20μL溶液中固相萃取鲨烯。

富集完后，使用MALDI-TOFMS石墨烯被直接分析，得到一个好的信号（图5c）。

我们进一步降低鲨烯的浓度至0.2μM，这证明了分析物使用石墨烯固相吸附后用MALDIMS可以很容易地检测到（图5d）。

对于样品富集和污染物的移除非常有用。

因此，石墨烯作为SPE吸附剂和MALDI基质的双重能力为小分子在复杂样品基质中检测提供了强大和快速的技术。

明显地，MALDI-TOFMS是用石墨烯作为基质当简化样品制备时检测多种小分子物质应用上有很大潜力。

Figure5.MALDI-TOFmassspectraof（a）cholesterol（m/z369,[M-H2O+H]+）andsqualene（m/z433,[MNa]）withtheuseofCHCAasthematrix,（b）cholesterol（m/z409,[M+Na]+）andsqualene（m/z433,[M+Na]+）withtheuseofgrapheneasthematrix,（c）grapheneastheadsorbentforSPEofsqualeneat20µM,and（d）grapheneasthematrixforSPEofsqualeneat0.2µM.

当使用石墨烯作为基质分析物的重现性。

我们比较使用CHCA和石墨烯基质时精胺离子峰的再现性。

从离散位置的探头以及采用10个激光投射获得的每个质谱的十大质谱连续记录。

比CHCA基质，石墨烯基质产生精胺高的信号强度和更好射击重现性。

在一个样品点精胺峰值强度相对标准偏差（RSD）为40%，10光谱CHCA基质，然而石墨烯基质RSD值低至14%。

这可能是由于分析物分子在石墨烯层片上的单一分布，这与分析物分子和常规有机基质形成的异构晶体形成对比。

这样用石墨烯作为基质的MALDI可以为在很干净光谱背景下提高小分子的定量分析提供一个固体基础。

以上结果清晰地证明石墨烯可作为小分子高速MALDIMS分析的一种新基质。

如果激光灯在能量被设为1400-1800辐射在没有任何样品分子的石墨烯上没有获得明显的峰值信号，这和样品分子直接放置在金属目标物的结果相似，表明了石墨烯在激光辐射条件下的稳定性。

此外，石墨烯表面活性可以通过衍生其它官能团修饰，这扩大了在质谱分析它的应用。

然而，小分子在石墨烯基质上的解吸电离原理还不是很清楚，尽管从激光辐射能量通过石墨烯转移到样品分子应该是最重要的过程之一。

结论

在这项工作中，石墨烯被用作新颖基质使用MALDI-TOFMS分析小分子化合物。

与传统基质如CHCA比较，石墨烯有几个优点，包括简单样品制备，在分析物解吸/电离高效率，提高分析物峰值强度的重现性等等。

基质被成功用于分析氨基酸，多胺，类固醇，抗癌药物，核苷。

高耐盐性显示了它在分析存在于复杂样品基质中小分子的潜在用途。

它也展示了在分析无机化合物的优点。

另外，我们观测到如果石墨烯在进行MS分析之前用固相萃取，分析物的检出限可以被提高。

另外，石墨烯作为基质为解吸/电离提供了一个低的激光能力阈值和比有机物基质具有高的小分子信号，使用石墨烯作为基质可以显著地简化样品制备，消除基质背景离子的干扰，提高射击重现性。

然而测量的灵敏度一直不是太高，它可以通过石墨烯的化学衍生在未来的研究中潜在提高。

合起来，我们的工作为石墨烯的应用开劈了新领域，它为快速MALDIMS分析小分子化合物在新陈代谢研究和自然产物特性等方面提供了一项新基质。

鸣谢

这项工作得到了国家卫生研究院（GrantR01CA116522toY.W.），国家自然科学基金（Grant20975060toJ.L.），中国基础研究项目（Grant2007CB310500toJ.L.）的支持。

支持信息

石墨烯的TEM和XRD表征。

这些材料从http:

//pubs.acs.org查得。

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