二代测序NGS实验方案和应用.docx
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二代测序NGS实验方案和应用
二代测序NGS实验方案和应用
这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。
随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。
这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：
∙全基因组从头测序或者重测序
∙目标序列重测序
∙转录组分析
∙微生物组研究
∙基因调控研究
NGS序列
二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。
从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。
台式测序仪使得任何实验室都能够像使用real-timePCR一样，自己进行测序。
这些仪器能够和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：
选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。
当前，这些仪器的通量在10Mb到7.5Gb之间，可是随着硬件，软件和试剂的持续改进，通量也在稳步增加。
高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600Gb的序列。
一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。
与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500bp），可是其精度和测序能力（90Mb）要低很多。
还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800bp，700Mb）。
因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。
有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。
这种技术中，根据一个DNA链经过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，能够确定经过这个孔道的碱基。
这理论上能够仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。
DNA测序
二代DNA测序的工作流程如下：
∙DNA样本制备
∙文库构建和验证
∙文库分子大规模平行克隆扩增
∙测序
二代测序DNA样本的质量控制
首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。
凝胶电泳法
基因组DNA的完整性和大小，能够用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳（PFGE）来检测。
常规的凝胶电泳的精确度不高，这是因为大的DNA分子在凝胶中移动的时候，本质上是用一种与尺寸无关的方式一起移动的。
可是，它依然能够提供完整性（大小范围）和纯度（RNA污染物在凝胶底部形成脱尾条带）方面的有效信息。
因此，它依然是评价基因组DNA质量的有效方法之一。
注：
RNA污染会导致DNA浓度高估，而且抑制一些下游步骤。
如果能肯定有RNA污染，则可使用去DNase的RNaseI处理样本。
分光光度测定法
分光光度仪在260nm和280nm处读数的比例（A260/A280）能够用来估计DNA相对于一些吸收紫外光的杂质（比如蛋白）的纯度。
纯净的DNA的A260/A280比例大约为1.7–1.9。
注：
想要获得精确的A260/A280值，需要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度（比如,10mMTris•Cl,pH7.5）。
第二个步骤是测定基因组DNA的浓度。
分光光度法
DNA的浓度能够经过使用分光光度仪测定其在260nm波长的吸光度来确定。
Nanodrop当前被广泛使用，因为它需要的样本量少（1µl），而且使用方便（不需要比色皿）。
为了确保结果的可靠性，读数应该在0.1到1.0之间。
注：
吸光度测定不能区别DNA和RNA。
RNA污染物会导致DNA浓度高估。
可是，纯净RNA的A260/A280比值在2.0左右，而纯净的DNA大约为1.8。
因此，如果这个值为1.95，那么说明样本里面有RNA杂质。
注：
苯酚在270–275nm的波长范围内有最大的吸光度，非常接近于DNA。
因此苯酚能提高样本在260nm附近的吸光度，从而导致高估DNA的产量和纯度。
荧光法
荧光法使用荧光染料测定DNA的浓度，具有特异性和灵敏性。
Hoechst33258结合到DNA上后，能增大458nm波长附近的发光强度，除此之外，也能够使用一些更加灵敏的荧光染料，比如PicoGreen染料。
基于PicoGreen染料的实验，比紫外吸光光度法灵敏10，000倍，而比使用Hoechst33258染料的方法至少灵敏400倍。
和紫外吸光光度法不同，PicoGreen实验对双链DNA的选择性要远高于RNA和单链DNA。
DNA标准品和样本与荧光染料混合，而且使用荧光计检测。
将样本的测定结果与标准品的测定结果相比较，以确定DNA的浓度。
Real-timePCR
能够使用real-timePCR技术来测定DNA样本的数量和质量。
多重PCR技术使用引物集在多个位点扩增不同大小的片段，是检测DNA损伤和片段化的有效质控手段。
此类技术试验专门测定可经PCR扩增，适于二代测序的DNA分子。
上述提到的这些常规方法，一般不能测定的样本中扩增得到的DNA的量，或者会高估了DNA的量。
与它们相比，real-timePCR更加适用于预测DNA样本是否适合于二代测序。
文库制备
对于大多数商业化的二代测序平台，使用诸如桥式扩增或者乳液PCR方法，对文库中的DNA片段进行克隆扩增，以产生足够拷贝数量的测序模板非常必要。
经过将平台特异性的适配子与感兴趣的DNA源（比如基因组DNA、双链cDNA或者PCR扩增子等所产生的DNA片段）退火，得到片段文库。
适配子序列的存在，使得我们能够对文库分子进行选择性的克隆扩增。
因此，这种方法不需要像传统的方法那样，在微生物中间体中，对基因组片段进行微生物克隆。
另外，适配子序列中，还含有平台特异性的测序引物的结合位点。
一般情况下，一个常规的DNA文库构建方案包含四步：
∙片段化DNA
∙对DNA片段进行末端修复
∙连接适配子序列（不适用于单分子测序）
∙对可选的文库进行扩增
当前有四种方法用于产生基因组DNA碎片：
酶消化法、超声波法、喷雾法和水动力剪切法。
这四种方法都能够用于文库构建，可是每一种方法都有其优点和局限性。
核酸内切酶消化的方法快速而且容易，可是难以精确的控制片段长度的分布。
另外这种方法可能会对基因组DNA的呈递引入偏倚。
另外三种技术使用物理的方法将DNA的双链打断，这种断裂是随机的，因此能在文库中对DNA进行无偏的呈递。
能够使用琼脂糖凝胶电泳或者自动化的DNA分析方法，对DNA片段的尺寸分布进行控制。
片段化DNA之后，需要将DNA修复，产生5’磷酸化的平末端DNA，以便能够和测序平台特异性的适配子相连接。
文库构建的效率直接依赖于DNA末端修复的效率和准确性。
末端修复混合溶液将5’或者3’的粘性末端转变成5’磷酸化的平末端DNA。
在大多数情况下，末端修复经过T4DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性和3’—5’的核酸外切酶活性完成。
而T4多聚核苷酸激酶确保平末端的DNA片段5’端的磷酸化，以便进行后续的适配子连接。
根据所使用的测序平台，平末端DNA片段能够直接与适配子连接，或者需要在其片段的3’端增加一个单独的突出的腺苷酸A，以便与平台特异性适配子上突出的胸苷酸T相互配对。
一般情况下，使用Klenow片段（具有最低的3’到5’端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端转移酶活性的聚合酶催化这一步骤。
T4DNA连接酶将双链的适配子与文库片段修复过的末端相连，然后使用回收反应或者根据DNA的尺寸，选择性去除文库中未连接的适配子和适配子二聚体。
大小筛选方法包括使用琼脂糖凝胶电泳分离，使用磁珠或者使用高等的基于柱的纯化方法。
在连接过程中可能出现适配子的二聚体，它们会和与适配子连接的文库片段共同扩增，从而降低测序平台对真正文库片段测序的能力而且降低测序的质量，因此在测序之前，必须将它们从文库中除去。
一些测序平台要求文库片段的长度分布在比较窄的范围内，以得到最佳的结果，很多时候，这只能经过去除凝胶电泳上的相应的片段条带实现。
这种方法也能够用来去除适配子二聚体。
完成这一步骤之后，应该对DNA片段文库的质量进行检测，并进行定量检测。
根据浓度和测序文库的适配子设计，既能够直接稀释溶液并用于测序，也能够对文库进行选择性扩增。
在文库扩增阶段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的适配子序列，经过与PCR引物的重叠，用于后续的克隆扩增和与测序引物结合，或者提高DNA文库的产量。
为了得到最佳的文库扩增结果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。
文库质量评估方法，参见NGS文库质控。
为了充分利用测序能力，不同样本得到的测序文库能够放在一起，在同一轮实验中一同测序。
经过将DNA片段与具有不同特征的适配子相连接，能够实现这一过程，即对于每一个样本使用不同的短核苷酸序列作为适配子。
有一些其它的方法能够用于简化文库构建。
有一种新方法使用转位酶/DNA的复合物进行体外转座，以便在同一个试管中同时将DNA片段化并标记。
经过对所标记的DNA片段进行有限次数的PCR扩增，能够构建完整的测序文库，这节省了操作步骤和时间。
可是，使用体外转座构建的文库，与传统方法构建的文库相比，具有更高的序列偏倚。
NGS文库质控
高质量的文库是成功进行第二代测序的关键。
文库构建包含复杂的步骤，比如片段化样本、修复末端、将末端腺苷酰化、连接适配子和扩增文库。
根据使用的平台和文库类型，这些步骤也会发生变化。
监控每一个步骤非常必要，包括在片段化样本之后检查片段的尺寸，以及连接适配子之后检查片段的大小和浓度。
文库验证过程中，需要分析文库中片段的大小和数量，这是质控的最后步骤。
评估文库中片段的大小
琼脂糖和PAGE凝胶电泳是传统的检测片段大小的方法，它们比较耗时。
最近，基于微流技术的电泳或者毛细管电泳越来越广泛的用于检测片段的大小和浓度。
即买即用的芯片和胶盒省去了配置凝胶的步骤，使用方便。
它们具有更高的通量，而且省去了很多的手动操作时间。
除此之外，它们的灵敏度更高（对于检测的限制更少），而且能完全自动化的获取数据和输出电子化的数据资料。
这些仪器能同时检测片段的大小和浓度。
∙测定文库中的片段数量
∙分光光度法和荧光法
∙参见分光光度法和荧光法
电泳设备
如前所述，基于微流技术的电泳和毛细管电泳除了提供片段大小的信息之外，还提供了定量检测数据。
可是，电泳、分光光度法和荧光法的一个共同的局限性是，都只检测总的核苷酸的浓度，而非与适配子连接的分子的浓度。
Real-timePCR
将适配子连接到文库分子的两端，使得能够在平行的PCR扩增步骤中扩增上百万个独立的DNA分子（乳液PCR或者桥式PCR）。
在有些仪器中，乳液PCR能够将一个DNA分子扩增到数百万个相同序列的拷贝，并全都结合在同一个珠子上。
在另一种平台上，桥式PCR能够将一个DNA分子转变成一个包含相同序列的多个拷贝的DNA簇。
因此，两端连接了适配子的扩增之后的分子，决定了乳液PCR中模板和珠子的比例以及桥式PCR中产生的最佳DNA簇。
对扩增后的文库中的分子进行精确的定量检测，对于确保片段的质量和高效的获得数据是非常重要的。
低估扩增文库中的分子数量，会导致混杂的信号以及难以解析的数据；相反地，高估分子的数量会降低结合模板的珠子或者DNA簇的产量，而且没有充分利用测序能力。
Real-timePCR能够特异性的定量检测两端结合有适配子的DNA分子，因此能够对扩增文库中的分子进行高度精确的定量检测。
Real-timePCR的灵敏性非常高，能够对浓度非常低的文库分子进行定量检测，即使其浓度低于传统方法能够检测的阈值。
因此，这种方法能尽量减少对文库的扩增，降低可能的偏倚。
用于决对定量检测的数字PCR
数字PCR能够对二代测序的文库进行绝对定量检测，而不需要标准品。
这个技术对文库进行有限的稀释，并进行大量独立的PCR反应；因此，大多数反应没有模板，得到阴性的结果。
一个单独的阳性PCR反应统计为一个单独的模板分子。
经过统计所有阳性PCR的数量，能够确定文库分子的绝对数目。
数字PCR的主要优点在于：
∙单分子的敏感性
∙与PCR扩增的效率无关，因为成功的扩增被统计为一个分子，而与最终产物的数量无关
可是，这种技术需要特殊的仪器，而且花费较高，因此尚未广泛用于文库定量检测。
宏基因组学Metagenomics
DNA测序的应用领域之一是宏基因组领域，即从环境样本中直接回收的遗传物质的非培养研究。
宏基因组学是指一个环境样本中所包含的所有微生物基因组的功能和序列分析。
这个词汇起源于“meta”（在这里指对于基因多样性的系统性理解）和“genomics”（对一个物种的遗传物质的综合分析）。
宏基因组不是一个新的学科，但由于二代测序技术所带了的诸多可能性，宏基因组的应用经历了巨大的提升。
据估计，微生物中仅有1%左右是可培养的，因此宏基因组学的研究能极大的拓展我们对于环境的认识。
很多年以来，“宏基因组”这个词汇仅与环境样本的分析有关，比如，分析从极端的生存环境下分离得到的DNA，以便发现能用于工业的新的生物催化剂。
可是，通量的极大提高，以及所花费的费用和时间的降低，将这个领域的应用扩展到了很多其它方面。
宏基因组学可分成几个领域，包括：
∙病理基因组学/感染基因组学
∙微生物组分析
∙环境宏基因组学
注：
这并不是全面的分类，研究者能够选择其它的分类标准。
病理基因组学/感染基因组学和疾病的诊断相关，用于确定有疾病症状的患者体内未知的病原体。
这一般是极具挑战性的过程，因为微生物的数量可能非常少（每毫升血液中大概有1–10个细胞）。
与之相反，微生物组分析则涉及到数量巨大的微生物，比如口腔或者直肠拭子中的微生物。
此时，我们的目标是分析这些菌群的组成。
考虑到人体仅包含1%的人类细胞而其它99%都是微生物细胞，微生物组分析在未来的诊断技术中有潜在的巨大应用。
更多细节，请见人类微生物组工程（.org）。
环境宏基因组学的目标除了包括传统的寻找新的生物催化剂之外，还包括研究和鉴定栖息环境。
从理论上来讲，环境宏基因组学有两种不同的研究方法：
∙全基因组分析：
对所有存在的DNA进行测序
∙16S分析：
仅对16SrRNADNA进行测序
第一种方法只是简单的对样本中存在的所有DNA进行测序。
这能够完整地描绘所有出现过的微生物，而且可能发现新的酶或者酶家族，以及抗生素的抗性。
另一方面，这种方法需要较高的测序能力，因而，相对于第二种方法，其通量较低而且花费较高。
与此相关的进一步的方法正在研发。
在宏基因组的应用中，一般需要能提供较高的片段长度的测序仪，这是因为一般没有参考序列可供参照。
对于16SrRNA分析而言，测序仪的读长需要覆盖整个区域（另请参照二代测序仪）。
RNA测序
RNA测序（RNA-seq）是使用深度测序技术来研究生物体转录组的方法。
此方法在构建合适的文库之后，对样本中的RNA直接测序，得到丰富的数据集以进行分析。
这项技术的高灵敏度和高分辨率使得它成为研究整个转录情形的有价值的工具。
数据的定量性以及测序技术的高动态范围使得其对基因表示的分析具有高度的灵敏性。
数据的单个碱基的分辨率提供了关于单核苷酸多态性（SNP）、选择性剪接、外显子/内含子边界、非翻译区及其它元件的详细信息。
除此之外，RNA-seq不需要预先知道参考序列，这使得从头的转录组分析和新的变异体和突变体的检测成为可能。
RNA-seq是研究转录组的强大、革命性方法，可是使用这种技术需要非常仔细以获得最高质量的数据。
RNA-seq中需要考虑的因素
第一个需要考虑的因素是样本富集。
总RNA一般只包含比例很少的编码RNA或者功能RNA；样本中大部分RNA是核糖体RNA（rRNA：
大约占到了总RNA的80–90%）和较少的转运RNA（tRNA）。
为了避免将80–90%的测序资源用在重复的rRNA序列上，一般在测序之前，需要从样本中去除rRNA。
这一般能够经过特定的消耗rRNA实现，也能够经过使用寡聚胸腺嘧啶富集技术选择性富集PolyA实现。
消耗rRNA的方法能够同时保留编码RNA和非编码RNA（一项非常重要的研究内容）的信息，而PolyA富集则仅保留了编码mRNA。
PolyA富集可能会丢掉特定的RNA和具有高转换率的RNA。
有一些其它的方法能够避免rRNA的影响，比如选择性降解大量转录物，或者不扩增rRNA的扩增技术。
可是这些方法不像rRNA消耗或者polyA富集那么常见，而且可能扭曲转录物表征的正常水平。
另外一个需要考虑的因素是要研究的RNA的大小。
RNA转录物跨越比较大的大小范围；与常规的RNA分析相比，关注小RNA的实验（比如microRNA或者长度范围在15–35bp的RNA），需要特别的纯化和文库构建方案。
大多数其它大小的RNA片段能够同时测序（RNA测序的常见步骤之一是将RNA分割成普通长度，比如200–300nt长度的片段）。
RNA-seq测序操作步骤
一旦确定了移除核糖体的方法和要研究的片段大小，就能够将RNA构建成一个文库。
对于大多数测序仪器而言，这包括首先将RNA打碎成片段，其次经过逆转录方法构建双链cDNA。
在后续的文库构建过程中，这些双链的cDNA被当作普通的基因组DNA来对待。
如果想要保留RNA的直接信息（链型），必须使用修改过的文库构建方案，比如将mRNA与连接适配子直接相连，或者标记cDNA的一条链以便在测序之前移除。
在进行测序计划过程中，需要考虑三个主要的因：
测序深度、读长和是否使用双端测序数据。
测序深度能够提供RNA转录物的丰度信息，而且较大的测序深度使得对于稀有转录物的检测更加灵敏。
读长也很重要，因为较长的读段对于检测剪接事件更加灵敏（内含子–外显子边界，外显子–外显子边界）。
双端测序数据能提供更多关于转录物结构的信息，特别是相互分隔的较远的外显子。
一般而言，从头分析以及寻找新的结构变异要求较高的测序深度和读长，而且会得益于双端测序数据。
典型的测序应用包含100–200M片段，长度为2x50–100bp。
与之相反，表示分析得益于较高的测序深度，可是读长和双端测序数据则对结果的改进作用较小。
这方面应用的一个典型实验包含10–30M片段，读长为1x35–100bp。
基因调控研究
二代测序技术也是研究基因调控网络的强有力的工具。
比如ChIP-seq技术（染色质免疫共沉淀测序）能够用于分析蛋白-DNA的相互作用。
二代测序技术也能用于确定基因组的全局甲基化模式。
ChIP-Seq
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是用于研究转录因子和修饰组蛋白基因调控机制的强大、多功能方法。
这种技术用于确定活细胞中染色质上那些与转录因子、共调节因子、修饰组氨酸、染色质重塑蛋白或者其它的核因子相互结合的区域。
整个操作过程非常耗时，包含了很多步骤和变量，每一个步骤都需要研究者根据自己的模型体系进行优化。
将细胞与甲醛交联之后，将染色质中共价相连的基因组DNA和核因子复合物分离出来，然后经过超声波处理，剪切成能够处理的大小。
抗体与目标核蛋白特异性免疫共沉淀时，也将与这些核蛋白特异性结合的基因组DNA也沉淀下来了。
去除化学交联并经过核酸纯化处理的这些DNA可用于测序、基于微阵列的基因组杂交或者PCR扩增。
ChIP与二代测序技术联用（ChIP-Seq）可研究与感兴趣蛋白相结合的位点在基因组的范围内的分布。
与微阵列分析（ChIP-Chip）相比，ChIP-Seq技术提供了较高的空间分辨率，动态范围和基因组覆盖度，因而它对于DNA结合位点的检测具有超级的灵敏度和准确度。
另外，ChIP-Seq技术一般只要很少的起始样本输入量，而且不需要杂交探针，具有较高的灵活性，任何测序过基因组的物种都能够使用这种方法进行研究。
高效的ChIP-Seq过程需要优化几个关键的变量。
首先，甲醛交联的温度和时间需要优化。
如果蛋白和DNA交联的过于紧密，则在测序之前无法将染色质有效地打碎成片段，而且去除交联也会遇到困难。
一般情况下，最好以在37°C下与1%的甲醛共培育10分钟起始，然后在此基础上进一步优化。
有几种不同的方法能够将染色质打成碎片，比如超声波和酶消化（比如使用微球菌核酸酶）。
如果使用二代测序技术来分析免疫共沉淀的DNA，染色质碎片的大小应在大约100–300核苷酸长度范围内，而且每一个测试系统中（细胞的类型、组织的类型），将染色质打碎成片段的参数也需要严格优化。
ChIP实验的成功与否取决于所使用的抗体的量和特异性。
最好选用能从多家抗体厂商处获得的，经过ChIP实验验证的抗体。
为了确定抗体能特异性地沉淀目标蛋白，能够使用蛋白印迹技术检测核提取物。
如果在结果中，仅能观察到一条特定大小的条带，则可认为该抗体是特异性的。
使用选定的抗体进行免疫共沉淀，然后经过蛋白印迹分析技术确定抗体是否能特异性的沉淀目标蛋白。
如果这样的实验失败了，那么还能够将选定的抗体与培养的细胞进行免疫荧光试验。
如果仅有细胞核显色，则说明抗体至少能特异性的识别一种位于细胞核内并可结合到DNA上面的蛋白。
根据目标蛋白的丰度，经过验证的抗体的量以及用于免疫共沉淀的染色质的量必须经过优化，以便获得足够的DNA进行测序。
对于识别组蛋白和组蛋白修饰的抗体而言，每一次免疫共沉淀反应大概需要100，000到1百万个细胞中的染色质。
如果转录因子与DNA结合的动态性较高或者与组蛋白相比，仅在有限的基因组位点上结合，那么实验就需要更多的染色质。
为避免多余的抗体与非目标蛋白和染色质的非特异性结合，同时保证能沉淀足够多的目标蛋白，每一次免疫共沉淀反应使用的抗体的数量也非常重要。
一般而言，1–10µg的抗体即可得到合理的结果。
能够用对照反应来比对ChIP反应的特异性。
在平行的ChIP反应中，使用同样数量的染色质，能够使用同型的对照抗体或者没有抗体的珠子用来比照抗体和珠子与蛋白和染色质的非特异性的结合。
经过比较阴性对照样本和ChIP样本中在特定位点沉淀的DNA的量，能计算这个位点的富集因子。
可是，在这种免疫共沉淀对照实验中得到的沉淀物的量一般很少，不足以提供足够的片段进行二代测序。
因此，ChIP-Seq实验一般使用输入对照样本作比对。
在这种情况下，每个ChIP反应中一般有1%交联而且打碎的染色质被用来去除交联而且与沉淀的样本一同纯化并进行后续的深度测序。
这使得我们能够比对由于打碎染色质所引起的偏移，这些偏移表现在染色质的局部结构，DNA扩增，测序，拷贝数量的变化，以及测定基因组区域的能力。
在沉淀的DNA碎片去除交联和纯化之后，建议使用real-timePCR技术确认与目标蛋白结合的基因组位点的回收和富集效果。
经过比较输入对照组与ChIP样本的qPCR结果，能够计算出输入物质的回收比例（ΔCT方法）。
如果使用了同型对照抗体样本（或者空白珠子的对照样本），则能够与ChIP样本相互比对，以进一步对qPCR技术检测到的位点的富集进行定量分析（ΔΔCT方法）。
为了能稳定地构建二代测序文库，至少需要10ng的ChIPDNA。
因此，必须仔细的定量免疫共沉淀得到的DNA。
但由于每一次ChIP反应得到的总的DNA量一般很低，因此需要比吸光光度定量法更加灵敏的方法。
荧光测定方法（比如使用PicoGreen）在定量ChIPDNA时具有较高的灵敏度和动态范围。
如果依然没有得到足够的DNA，可将从几次ChIP反应所得到的所有物质能够放到一起，用来构建一个测序文库。
由于用于构建文库的起始材料的数量非常低，因此在片段与测序适配子连接之后
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