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分子生物学笔记
基础分子生物学笔记
主讲:
姜寒玉
教材:
基础分子生物学教程作者:
赵亚华
出版社:
科学出版社
目录
第1章绪论………………………………………………………………………………………………1
第2章细胞内生物分子相互作用概述…………………………………………………………………2
第3章核酸的结构与功能………………………………………………………………………………3
第4章基因与基因组的结构与功能……………………………………………………………………6
第5章DNA复制……………………………………………………………………………………………8
第6章DNA的损伤、修复和基因突变…………………………………………………………………11
第7章DNA重组与转座…………………………………………………………………………………13
第8章RNA的转录合成…………………………………………………………………………………16
第9章RNA转录后的剪切与加工………………………………………………………………………20
第10章遗传密码…………………………………………………………………………………………24
第11章蛋白质的生物合成——翻译………………………………………………………………26
第12章原核生物的基因调控……………………………………………………………………………31
第13章真核生物基因表达调控……………………………………………………………………………35
第一章绪论
一、分子生物学发展简述
1、细胞学说的确立
细胞学说的建立(Thecelltheory)
德国植物学家施莱登(Schleiden)和德国动物学家施旺(Schwann)共同提出著名的“细胞学说”。
遗传因子在生物性状世代间传递遵循分离和独立分配两个基本规律。
2、1702Leeuwenhoek(荷兰)
3、自制显微镜观察到雨水中的“微生物”
4、同时代的Hooke用“细胞”来形容软木的最基本单元
5、分子生物学发展过程大致分为三个阶段:
(1)准备和酝酿阶段:
人类对DNA和遗传信息传递的认识阶段
确定DNA是遗传物质是分子生物学发展的重大里程碑,DNA双螺旋结构模型的建立是分子生物学发展的又一重大里程碑(分子生物学诞生的标志)
广义的分子生物学:
蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能的研究都属于分子生物学的范畴,即从分子水平阐明生命现象和生物学规律
狭义的分子生物学:
偏重于核酸(基因)的分子生物学,主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控等过程,当然也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究
基因的分子生物学(核酸生物学)MolecularBiology
(2)现代分子生物学的建立和发展阶段:
重组DNA技术的建立和发展
(3)初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段:
重组DNA技术的应用和分子生物学的迅猛发展阶段
综合分子生物学发展历程:
20世纪以核酸为研究核心,带动分子生物学向纵深发展。
20世纪50年代的双螺旋结构,60年代的操纵子学说,70年代的DNA重组,80年代的PCR技术,90年代的DNA测序都是分子生物学发展的里程碑,将生命科学带向一个由宏观到微观,再到宏观的过程。
6、分子生物学概念:
Molecularbiologyisthestudyofgenesandtheiractivitiesatthemolecularlevel,includingtranscription,translation,DNAreplication,recombinationandtranslocation.《MolecularBiology》--RobertF.Weaver(Version2)
分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学,是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘,由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
第2章细胞内生物分子相互作用概述
1、生物大分子
蛋白质——氨基酸
核酸——核苷酸
多糖——单糖
脂类——单脂
无论是原核生物还是真核生物,对一个生命个体来讲,均由蛋白质、核酸、糖类、脂类等生物大分子和一些小分子化合物及无机盐等这些化学成分共同组成。
2、生物大分子的功能:
生物体是由生物大分子等有机物构成的;/生物体能与环境不断地交换物质与能量;所有生物大分子共同存在于细胞环境中;生物体能进行自我更新。
第1节生物大分子概述
1、核酸:
是核苷酸的多聚体
(1)DNA(脱氧核糖核酸):
由脱氧核糖、碱基(A、G、C、T)、磷酸形成的5’-脱氧核苷酸构成.
/
(2)RNA(核糖核酸):
由核糖、碱基(A、G、C、U)、磷酸形成的5’-核苷酸构成。
在DNA和RNA分子中,核苷酸之间以3’,5’-磷酸二酯键连接形成长链大分子。
核酸分子都有游离的5’端和游离3’端。
(3)磷酸二酯键:
一个核苷酸的5’-磷酸和另一个核苷酸的3’-OH形成磷酸酯键而共价连接
(4)基本结构——双螺旋结构(基本要点):
A:
大沟,小沟;B:
碱基配对:
A=T,G=C;C:
反向平行:
暗示DNA复制和转录的分子机制
(5)高级结构:
单核苷酸形成的二级结构:
发夹结构;反向重复序列(回文序列)
2、蛋白质:
是氨基酸以肽键连接而成的聚合体
一级结构氨基酸的a-羧基与下一个氨基酸a-氨基缩合形成肽键,从N-端到C-端的氨基酸顺序即为多肽的一级结构。
二级结构C—N键具有部分双键性质,使得C=O与N=H四原子形成刚性的肽键单元平面,肽键单元间以氢键相连,多肽链在空间折叠形成二级结构,常见的有a-螺旋和β-折叠。
三级结构二级结构进一步折叠形成多肽的三级结构。
亲水基团位于蛋白质外侧,疏水基团埋在内侧,氢键、盐键、范德华力和疏水力维持结构的稳定。
分子伴侣帮助蛋白质正确折叠。
四级结构由多条多肽链(亚基)构成的寡聚蛋白,稳定三级结构的力量可将亚基维系在一起构成蛋白质的四级结构。
3、多糖:
(是由多个单糖分子缩合而成的)是糖或糖的衍生物的多聚体,许多碳原子之间产生共价键所形成的糖单位与两个以上的其他糖单位连接在一起形成大分子。
4、脂类:
是一大类化学结构上不同的物质,如脂肪、脂肪酸、磷脂、鞘磷脂和胆固醇等,但他们都具有不溶于水,易溶于乙醚、氯仿等脂溶性的共同特征。
5、生物大分子间相互作用的化学力
生物大分子的基本结构通过共价键聚合而成,而其生物学功能是通过相互作用、协调进行而实现的。
(1)生物大分子的相互作用主要表现在:
DNA与蛋白质之间;RNA与蛋白质之间;蛋白质与蛋白质之间。
(2)作用力有:
氢键疏水相互作用离子键范德化引力二硫键配位键
6、生物大分子的自我组装
生物大分子的自我组装指线性多肽链和核酸链伸长的线性结构,依照一定的方式折叠或盘绕成有序的形态结构,并通过次级键维持该结构的稳定,或进一步折叠并盘绕形成更高级结构,即超二级和三级空间结构,从而表现出自身的功能,同时这种分子还可以作为亚单位和亚分子和其他类生物分子通过次级键形成更高级结构即四级结构,如血红蛋白,多酶复合物,核酸与蛋白质形成的复合物等。
(1)功能类似的分子的组装——cAMP-CAP与DNA序列识别并结合;
(2)同类生物分子的组装——微管与微丝(3)异类生物分子组装——蛋白质与核酸(核糖体)
烟草花叶病毒粒子(TMV)的自我装配
在正常生理条件下,34个蛋白质亚基聚集形成20S双盘结构,RNA嵌入双盘结构,形成装配起始复合物,后蛋白质亚基才逐个加入,完成RNA的包装,最后形成病毒颗粒。
7、生物大分子的相互作用
(1)核酸与蛋白质的相互作用
染色质:
是DNA与小分子的碱性蛋白质组成的,组蛋白使DNA在染色体中紧密堆积在一起,并中和DNA磷酸-戊糖骨架负电荷的排斥力。
A、阻遏蛋白Cro对λ噬菌体DNA的结合:
Cro蛋白是大肠杆菌噬菌体产生的阻遏蛋白,它可以识别并结合DNA上一段专一序列,是一个重要的调节蛋白,并且二者的结合是由于它们的结构特征,同时Cro蛋白的结合保护了其他蛋白质与DNA作用的特定位点。
B、ε.coli的CAP蛋白与ε.coliDNA的某一调控位点相结合:
大部分被特异性蛋白识别结合的序列都具有一定的对称性,而且许多顺序特异性的DNA结合蛋白是多亚基蛋白,它们形成对称性的排列,这种排列有助于识别对称序列;另外蛋白质的α螺旋通常位于DNA螺旋的大沟中,是DNA-蛋白质相互作用的一个普遍特征。
(2)蛋白质与蛋白质的相互作用—多亚基形式的组合
A、多亚基体系具有的特点:
可减少蛋白质合成过程中随机错误对蛋白质活性的影响;对DNA的利用来说,多亚基较为经济;多亚基蛋白质的活性能够很有效和很迅速的被开启和关闭—酶的活性调节
(3)糖与蛋白质的相互作用
A、糖蛋白:
是蛋白质与寡糖链通过糖苷键连接成的产物,寡糖链由多种单糖构成,每一个单糖具有半缩醛羟基和一个以上的醇羟基,单糖间可通过不同苷键连接。
B、糖蛋白中的糖肽连接类型:
在糖蛋白中仅有一种糖残基与天冬酰胺相连,即N-乙酰-b-D-葡糖胺,生成的键是4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-b-D-吡喃葡糖基)-L-天冬酰胺,这种连接方式有时称为N(或Asn)连接型糖链或N-聚糖。
C、糖基或糖链的还原端与蛋白质肽链中的Ser、Thr或羟赖氨酸羟基中的氧原子相连称为O-连接糖链。
D、蛋白聚糖:
主要存在于人或者动物的皮肤、软骨、角膜等部位的结缔组织中。
E、软骨蛋白聚糖是由硫酸角质素和硫酸软骨素与核心蛋白共价结合在一起形成蛋白聚糖单体,由蛋白聚糖单体、连接蛋白和透明质酸形成蛋白聚糖聚集体。
(4)脂与蛋白质的相互作用
脂蛋白是由脂质和蛋白质相互作用的复合物,脂与蛋白质的结合可以通过蛋白质Ser、Thr上的羟基与脂质上羧基形成酯键,或蛋白质上的-SH与脂质上的羧基形成硫酯键。
8、研究生物大分子的方法
(1)离心技术分离生物大分子:
密度梯度离心、等密度离心、差速离心、凝胶电泳技术(DNA分离及大小测定)
(2)蛋白质分子质量测定:
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
本章习题
1、简述生物分子自我组装的定义和种类,并举例说明生物分子的自我组装过程?
2、简述生物分子间的相互作用?
第3章核酸的结构与功能
1、核酸DNA是活细胞中最重要的分子,含有特定细胞的全部遗传信息,RNA是某些病毒和噬菌体的遗传物质。
2、DNA主要特征:
储存遗传信息,将遗传信息传递给子代,物理和化学性质稳定,有遗传变异的能力。
作为信息分子的DNA携带有两种不同的遗传信息:
一类负责编码组成型蛋白质氨基酸序列的信息以及编码RNA的信息;一类负责编码一大类重要的调控蛋白以及决定基因表达的开启或关闭的序列元件,即负责基因表达的调节控制。
3、DNA的基本结构——双螺旋结构
(1)DNA的一级结构:
DNA分子中各脱氧核苷酸之间的连接方式(3´-5´磷酸二酯键)和排列顺序叫做DNA的一级结构,简称为碱基序列。
一级结构的走向的规定为5´→3´。
不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序,因此携带有不同的遗传信息。
一级结构的表示法:
结构式,线条式,字母式
Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性,在1950年总结出DNA碱基组成的规律:
腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等,即A=T。
鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数也相等,即G=C。
含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数,即A+C=G+T。
嘌呤的总数等于嘧啶的总数,即A+G=C+T。
(2)DNA的二级结构双螺旋结构(Watson-Crick模型)
①为两条反向平行的多核苷酸链,碱基在螺旋内侧;磷酸和脱氧核糖位于外侧。
②两条链之间靠碱基对之间氢键连为一体,A=TG≡C。
③螺旋直径2nm,每个螺圈含10个碱基对,螺距3.4nm。
④表面的深沟、浅沟为蛋白识别DNA单一序列并发生作用的基础。
大沟和小沟:
大沟宽2.2nm小沟宽1.2nm
(3)超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式,双螺旋DNA的松开导致负超螺旋,而拧紧则导致正超螺旋。
4、维持DNA双螺旋结构的作用力:
(1)氢键:
G≡C比A=T更稳定;
(2)碱基堆积力:
使DNA分子内部形成强有力的疏水区,与分子表面的介质水分子隔开
(3)正负电荷作用:
DNA分子中磷酸基团上的氧原子带负电荷,能与介质中的阳离子,带正电荷的碱性蛋白质等形成离子键,从而有效屏蔽磷酸基之间的静电斥力。
5、DNA的高级结构
(1)发夹结构:
当一个核酸分子中一段碱基序列附近紧接着一段它的互补序列时,核酸链有可能自身回折配对产生一个反平行的双螺旋结构。
(2)回文序列:
指在双链DNA序列中按确定的方向阅读双链中的每一条链的序列都是相同的。
在双链DNA中,如果两条互补链分开,每条链上的互补序列都有机会发生碱基配对而形成一个发夹结构(对单链而言),两个相对的发夹结构形成了一个十字架形结构(对双链而言)。
6、RNA的结构和功能
(1)RNA通常是单链线性分子,碱基组成AGCU
(2)功能具有多样化,可归纳为两类:
信息分子:
DNA——RNA——蛋白质;功能分子:
蛋白质生物合成的主要参与者初始转录产物的剪接加工与生物体的生长发育密切相关与生物体的进化有很大关系
(3)细胞中RNA的分布——主要分布在细胞质中
7、mRNA:
存在于细胞质中
真核细胞mRNA是单顺反子,每种mRNA分子只编码一种蛋白质信息,只能作为一种蛋白质的翻译模板,而原核细胞mRNA是多顺反子,即一个mRNA分子只含有几种蛋白质信息,可以编码几种蛋白质。
原核生物mRNA特征:
先导区+翻译区(多顺反子)+末端序列
真核生物mRNA特征:
“帽子”(m7G-5´ppp5´-N-3´p)+单顺反子+“尾巴”(PolyA)
8、tRNA的结构
(1)tRNA含量相对较多,约占真核细胞总RNA的15%,以自由状态或与氨基酸结合成氨酰tRNA。
(2)结构特点:
含有稀有碱基和稀有核苷较多;3’都含有一个CCA序列,是所有tRNA接受氨基酰化的位置;所有的tRNA分子都折叠成紧密的三叶草二级结构和倒L形立体构像
rRNA的结构。
(3)特征:
单链,螺旋化程度较tRNA低与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能
5SrRNA的二级结构
9、原核生物及真核生物的核糖体组成
核糖体
亚基
rRNA
真核生物
80s
60s
28s5.8s5s
40s
18s
原核生物
70s
50s
23s5s
30s
16s
10、核酸的变性、复性与分子杂交
(1)核酸的变性
凡是破坏双螺旋结构的作用力(主要是氢键和碱基堆积力)的因素都可以使DNA双螺旋解链,导致DNA变性。
变性的DNA物理性质、化学性质发生一系列变化,如DNA黏度大大下降,沉降速度增加,浮力密度上升,紫外吸收光谱升高,酸碱滴定曲线改变,生物活性丧失等。
(2)引起DNA变性的主要因素有:
加热(生理温度以上);极端PH值。
(>12,<2);有机溶剂、尿素和酰胺等。
(3)通过以下数据衡量DNA链处于什么状态
双链DNA的A260=1.00(浓度为50μg/ml时的吸收能力),单链时为1.37,游离碱基或者核苷酸为1.60;
(4)复性:
变性DNA溶液用某种方法处理后,使之重新形成天然DNA的过程叫做复性或退火,重新形成的天然DNA叫复性DNA。
复性条件:
盐浓度必须高——使两链之间的磷酸基团上负电荷的排斥力消失;温度必须足够高——防止链内随机形成氢键
1)复性的两个阶段:
A、单链DNA在溶液中随机地相互碰撞,如果序列互补,则两条链的碱基之间形成短的双链区
B、双链区继续扩展,形成一定长度双链
2)复性程度检测:
A、测定减色效应:
跟踪测定A260的光吸收值。
B、测定S1核酸酶水解DNA的量。
羟基磷灰石柱层析
3)影响复性速度的因素:
分子的简单程度;同一种DNA分子,浓度越高,互补链碰撞机会越多,复性速度越快
DNA片段大小;温度的影响;阳离子浓度
11、核酸的分子杂交
分子杂交:
将两个不同来源的互补序列退火形成双链的过程。
溶液杂交:
将不同来源的DNA变性后在溶液里杂交。
滤膜杂交:
用硝酸纤维素制成的滤膜可以吸附单链DNA/RNA,将变性的DNA/RNA吸附到滤膜上再进行杂交的过程。
Southern杂交:
DNA
Northern杂交:
RNA
Western杂交:
蛋白质
本章习题
1、DNA双螺旋结构有哪些形式?
说明其主要特点和区别?
2、DNA变性的主要因素有哪些?
3、变性的定性和定量方法是什么?
4、细胞内RNA的结构特点以及与DNA的区别?
5、分子杂交一般有几种类型?
它们分别用于检测哪些物质?
第4章基因与基因组的结构与功能
1、基因:
是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列,是遗传的基本单位和突变单位以及控制性状的功能单位。
2、基因组:
是指生物体或者细胞中,一套完整单体遗传物质的总和。
不同生物的基因组大小及复杂性不同。
生物的复杂性与基因组内的基因数量有关。
进化程度越高,基因组越复杂。
(1)C值(C-value):
在真核生物中,每种生物的单倍体基因组的DNA总量总是恒定的,称为C-值【C-valueisthequantityofDNAinthegenome(perhaploidsetofchromosomes).】
C值是每种生物的一个特征,不同生物之间差别很大,低等真核生物中与形态学复杂程度相关,但高等真核生物中变化很大
(2)C值悖理:
是指真核生物中DNA含量的反常现象。
表现为:
C值不随生物的进化程度和复杂性而增加,如肺鱼的C值为112.2,而人的C值是3.2,与牛的相近关系密切的生物C值相差甚大,如豌豆为14,蚕豆为2,相差7倍,真核生物DNA的量远远大于编码蛋白质等物质所需的量。
例:
人类与E.coli编码基因数目的比较研究
E.coli.4X106bpDNA约编码3000种基因,人类29X108bp的DNA是大肠杆菌的700多倍
(3)噬菌体(PHAGE)
1)、ΦX174噬菌体:
很小的E.coli噬菌体
DNA为单链环状,有5386个核苷酸(FrederickSanger于1977分析测定,为此荣获第二次诺贝尔奖)
2)、ΦX174噬菌体基因排列更加体现经济原则
a、11个蛋白质基因,只转录成三个mRNA;b、DNA分子绝大部分用来编码蛋白质,不翻译部分只占4%;c、显著的特点是有重叠基因(overlappinggenes或嵌套基因nestedgenes)。
(4)重叠基因有以下几种情况:
1)一个基因完全在另一个基因内部如:
B和A*E和D其读码结构互不相同部分重叠K和C
2)两个基因共用少数碱基对如:
A*和CD和J
λ噬菌体:
双链DNA长度48502bp(48Kb)
(5)其DNA分子有三种存在形式
a、两个粘性末端分离的线性分子COS位点(cohesive-endsite)b、带有切刻的环状分子(开环的粘性末端互补后未连接的)c、闭合环状分子(粘性末端互补,DNA连接酶连接)
(6)大肠杆菌(EscherichiacoliE.coli)特点:
a、在实验室中容易操作;b、生长迅速,要求营养物质简单,能进行很多生理生化过程;c、其有性生殖的存在使得遗传学的研究成为可能(遗传杂交、遗传性状、存在性状);d、能够供应细菌病毒的生长,使病毒的本性即病毒扩增的深入研究成为可能
大肠杆菌的遗传物质
1)染色体DNA
对数生长期的E.coli(2~4个类核)--丰富的基因组DNA;类核中,染色体DNA成分占80%,其余为RNA和蛋白质;4.6x106bp的基因组DNA与多种DNA结合蛋白质组装成E.coli的染色体;基因组DNA为双链环状,总长度为1100~1400μm,1400个基因都已定位
2)E.coli的基因结构的特点
a、功能相关的几个结构基因以操纵子(operon)的形式存在,其中包括共同的调节基因、启动子(promoter)、操纵基因(operator),在基因转录时协同动作;b、包括功能相关的RNA基因也串联在一起(rrn操纵元),如:
16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA基因转录在同一个转录产物中;c、蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在;d、RNA基因多拷贝大多数的E.coli菌株都含有七个rrn(其中六个分布在E.coliDNA的双向复制起点附近)
3、真核生物基因组特点:
(1)真核基因组的分子质量大;
(2)真核生物一般有多条呈线状的染色体
(3)细胞核DNA与蛋白质稳定地结合,形成染色质的复杂高级结构。
染色质内除含有DNA和组蛋白之外,还有大量非组蛋白;(4)真核细胞被核膜分隔成细胞核和细胞质,在基因表达中,转录和翻译在时间和空间上被分隔,不偶联真核细胞基因组DNA有大量重复序列,这些重复序列的单位长度不一,从几个至几千个碱基对不等;重复程度各异。
(5)真核生物的蛋白质基因一般以单拷贝形式存在,转录产物为单顺反子mRNA。
功能上密切相关的基因密集程度不如原核生物高;(6)真核生物基因组存在着可移动的DNA序列;(7)绝大多数真核生物基因都含有内含子,因此基因的编码区不是连续排列的。
4、真核生物的断裂基因
(1)断裂基因(interruptedgene)也称割裂基因(splittinggene)不连续基因(discontinuousgene):
基因内部插入了不编码序列,使一个完整的基因分裂成不连续的若干区段。
断裂基因的发现实验:
通过成熟mRNA(或cDNA)与编码基因的DNA杂交试验而发现;后来发现鸡的卵清蛋白基因与其mRNA杂交也出现了R环。
5、真核生物基因的外显子和内含子
概念:
在不连续基因中有编码功能的区段称为外显子,而无编码功能的区段称为内含子。
Exon(外显子、外元)
——isanysegmentofaninterruptedgenethatisrepresentedinthematureRNAproduct
Intron(内含子、内元)
——isasegmentofDNAthatistranscribed,butremovedfromwithinthetranscriptbysplicingtogetherthesequences(exons)oneithersideofit./
6、真核生物基因组的序列类型
(1)单拷贝的DNA序列;
(2)低度重复的DNA序列,有2-10个拷贝数;(3)中度重复的DNA序列,有几十至数十万个拷贝数;(4)高度重复DNA,重复次数上万至数百万次
单一拷贝的基因序列;绝大多数编码蛋白质的基因都是单拷贝的序列。
7、持家蛋白:
(1)将生物体内所有细胞都共同具有的蛋白质称为持家蛋白。
“持家”——维持生命必须的低度重复序列,许多蛋白质家族,其氨基酸序列具有很高的同源性,典型例子有珠蛋白基因、细胞骨架蛋白基因等。
(2)珠蛋白家族包括α-珠蛋白和β-珠蛋白。
人类α-珠蛋白基因簇在第16号染色体上,由3个基因串联而成。
β-珠蛋白基因簇在第11号染色体上,由5个基因构成。
8、假基因(pesudogene):
是一种类似于基因序列,但在转录、转录后加工或翻译水平上有缺陷,缺乏正常功能,