核黄素测定实验报告doc.docx

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核黄素测定实验报告doc

核黄素测定实验报告

篇一：

实验八荧光光光度法测定核黄素的含量

　　实验八荧光光度法测定核黄素的含量（见教材p118）

　　一.实验目的

　　1.了解荧光法测定核黄素的原理和方法；

　　2.学习荧光光度计的操作和使用。

　　二.实验原理

　　某些具有π-π电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。

建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为分子荧光分析法，而常把被测物称为荧光物质。

在稀溶液中，荧光强度IF与入射光的强度I0、荧光量子效率?

F以及荧光物质的浓度c等有关，可表示为IF=K?

FI0εbc。

式中为比例常数，与仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度IF与荧光物质的浓度c成正比。

　　核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。

这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。

核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。

　　OHHO

　　OHH3CHNOOHOHHOOHH3CH3C－2HH3CH二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：

　　核黄素的激发光波长范围约为440—500nm（一般为440nm），发射光波长范围约为510—550nm（一般为520nm）。

利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，由还原前后的荧光差数可进行定量测定。

根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。

　　注意：

在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。

　　三.仪器与试剂

　　1.实验试剂：

核黄素标准品；冰醋酸；核黄素药片；连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠

　　2.实验仪器：

荧光光度计（F-2500型）天平（感量0.0001g）

　　3.实验器材

　　普通试管：

　　容量瓶：

　　移液管：

　　烧杯：

　　滤纸：

25mL×9100mL×110mL×15mL×11mL×150mL×19cm

　　研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒：

各1

　　四.实验内容

　　1.核黄素标准液（4×10-6g·mL-1）

　　准确称取核黄素4mg，加5mL冰醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。

冷却至室温，用蒸馏水定容至1000mL。

转入棕色瓶中。

　　2.样品液的制备

　　为了消除药片之间的差异，可取几片药片一起研磨，然后取部分有代表性的样品进行分析。

　　将5片核黄素药片称量后磨成粉末，然后从中准确称取1-2mg有代表性的样品，加0.5mL冰醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。

冷却至室温，用蒸馏水定容至100mL（如果有沉淀，迅速通过定量滤纸干过滤，用该滤液在与标准溶液同样条件下测量核黄素的荧光强度）。

转入棕色瓶中。

作样品待测液备用。

　　3.绘制核黄素的激发光谱和荧光光谱

　　1）.固定激发波长λex（Excitationspectra）为440nm,在460-660nm处测定荧光强度，得溶液的发射光谱，在520nm处得最大发射波长λem。

　　2）.再固定发射波长λem（emissionspectra）为520nm，测定激发波长λex为400-500nm处荧光强度，得溶液的激发光谱，在440nm处得最大激发波长λex。

　　4.标准曲线制作及样品测定

　　取8支试管，按下表所示顺序操作。

　　注意：

在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%，则需要再行稀释，并记录稀释倍数。

　　五.结果处理

　　1.从绘制的激发光谱和荧光光谱曲线上，确定它们的最大激发波长和最大发射波长。

　　2.由1～6号管的数据，以核黄素含量（10-6g·mL-1）为横坐标，F值（F1-F2）为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；

　　—3.求两个样品管F的平均值F；

　　—4.由F从标准曲线中求样品管中核黄素的含量（10μg·mL-1）；

　　5.计算药片中核黄素的含量（单位用g/g鲜重），并将测定值与说明书上的值比较。

　　六.注意事项

　　1.在所有的操作过程中，避免核黄素受阳光直接照射。

　　2.使用石英样品池时，应手持其棱角处，不能接触光面，用毕后，将其清洗干净。

　　3.影响荧光强度的因素很多，每次测定的条件很难完全控制一致，因此每次必须做工作曲线，且标准曲线最好与样品同时做。

　　F-2500分子荧光光度计操作规程

　　1.先打开仪器主机，打开电脑

　　2.点击桌面FL－Solutions

　　3.寻找激发波长：

放入样品，寻找激发波长，点击Method，出现对话框，点击General，在Measurement中选择wavelengthscan，点击Instrument，在scanmode中选择Excitation，在datamode中只选Fluorescence，在EMWL中输入发射波长数值（520nm）。

在EXstart中输入激发起始波长（400nm），在EXendWL中输入激发终止波长（500nm）。

点击确定即可得到荧光物质的激发光谱曲线。

　　4.寻找发射波长：

同上法。

在scanmode中选Emission。

在datamode中只选Fluorescence，在EXWL中输入激发波长数值（440nm）。

在EMstart中输入发射起始波长（460nm），在EMendWL中输入发射终止波长（600nm）。

点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。

　　5.将样品放入，在scanmode中选Emission。

在datamode中只选Fluorescence，在EXWL中输入激发波长数值（440nm）。

在EMstart中输入发射起始波长（460nm），在EMendWL中输入发射终止波长（600nm）。

点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。

记录在520nm处的荧光值F1。

加入10mg的连二硫酸钠或亚硫酸钠，混合溶解后，立即重新测定相对荧光强度F2

　　6.在完成测量之后，关闭仪器按下列步骤执行。

（1）从文件菜单（F）中，选择退出（X）指令。

　　⊙closethemonitorwindow,butkeeplampoperating?

　　Ｏclosethelamp，thenclosethemonitorwindow.

　　选择yes，FLSolutions程序将终止。

（2）关闭光度计的电源开关。

　　（3）点击Windows98的开始按钮，选择关机（U），在关机窗口对

　　话框中，选择“关机“OK”按钮。

　　（4）关闭计算机和显示器电源（在③步中，计算机能通过某些设

　　定来关闭）。

　　（5）关闭打印机。

　　注：

1、关灯：

使用以上指令来关闭氙灯，为了再次打开氙灯，必须重新启动光度计。

　　2、狭缝宽度一般为5nm或10nm，如果改变狭缝宽度时先选定狭缝宽度，光栅自动关闭，自动调零。

篇二：

作业4尿中核黄素的测定（荧光法）

　　运动营养学实验报告

　　姓名：

________学号：

_____日期：

_

_______

　　备注：

受试者姓名：

性别：

尿液是否稀释：

否

　　课后思考题

　　1.维生素B2的测试过程中有哪些注意事项？

为什么？

　　答：

1.由于核黄素余光分解，整个操作应在避光实验室中进行。

　　2.做内标准的目的是去除尿中可能存在的有荧光的物质。

　　3.使用荧光剂时应用荧光红纳校正。

　　荧光红纳溶液的配制：

溶解25.0mg荧光红钠于少量水中，搅拌使其溶解后加水至250ml，此为储备液。

取0.25ml加水稀释成250ml，此为工作液。

　　校正步骤：

先选择所需激发波长和发射波长，校正仪器零点，然后用荧光红钠工作也校正荧光计，使指针在某一刻度，再测定样品的荧光强度。

　　2.营养和运动对机体维生素B2的影响都有哪些？

　　答：

机体对维生素B2的需求似乎同能量的消耗或肌肉活动有关。

维生素B2缺乏主要发生在素食主义者身上。

如果膳食里未含奶类食品或其他动物脂肪的话，那么机体就有可能缺少维生素B2。

　　维生素B2与机体的有氧代谢能力关系密切。

运动会导致机体对维生素B2的需求量增加，尤其是生长发育期的儿童少年、控体重、减体重以及素食或不吃动物蛋白的运动者，更要注意的是维生素B2的营养状况。

核黄素主要存在于动物内脏中（如肝、肾、心等），牛奶及蛋类含核黄素也较多，坚果类食品（如核桃、栗子、松子、花生、瓜子等）含量也不错。

若缺乏维生素B2，可适量补充以上食物。

　　3.为何加入低亚硫酸钠？

　　答：

核黄素可被低亚硫酸钠还原而失去荧光，故测定还原前后的荧光强度可去除干扰性荧光物质的影响。

篇三：

核黄素

　　核黄素（维生素B2）荧光光度定量测定法摘要:

维生素B2又名核黄素（Riboflavin）,是核醇与7,8-二甲基异咯嗪的缩合物。

由于在异咯嗪的1位和5位N原子上具有两个活泼的双键，易起氧化反应，故维生素B2有氧化型和还原型两种形式，在生物体内氧化还原过程中起传递氢的作用。

在体内核黄素是以黄素单核苷酸（flavinmononucleotide,FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸

　　（flavinadeninedinucleotide,FAD）形式存在，是生物体内一些还原氧化酶（黄素蛋白）的辅基，与蛋白部分结合很牢。

由于FAD,FAN广泛参与体内各种氧化还原反应，因此维生素B2能促进糖，脂肪和蛋白质的代谢，对维持皮肤，粘膜和视觉的正常机能均有一定的作用。

本实验采用荧光光度定量测定法测量核黄素的含量.

　　关键词：

核黄素荧光光度还原氧化酶黄素蛋白

　　VitaminB2andRiboflavin（Riboflavin）,isthenuclearalcoholand7,8-dimethylluooxazinecondensationproduct.Duetothedifferentluooxazine1and5Natomhastwolivelydoublebond,easyoxidationreaction,sothevitaminB2typeoxidationandreducedintwoforms,REDOXprocessinbiologicalhydrogentransferfunction.Riboflavininthebodyisflavinmononucleotide（flavinmononucleotide,FMN）andflavinadeninedinucleotide（flavinadeninedinucleotide,FAD）form,aresomereductioninbiologicaloxidase（flavoprotein）prostheticgroup,combinedwithproteinpartisveryfast.BecausetheFAD,FANwidelyparticipateinvariousREDOXreactioninthebody,sovitaminB2canpromotesugar,fatandproteinmetabolism,tomaintaintheskin,mucousmembraneandhavecertaineffecttothe