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专题1基因工程教案

专题1基因工程

1.1DNA重组技术的基本工具

一、教学目标

1.知识方面

简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。

2.情感态度与价值观方面

认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。

二、教学重点和难点

1.教学重点

DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。

2.教学难点

基因工程载体需要具备的条件。

三、教学方法

讲授法,对话法

四、教学课时

2

五、教学过程

基因工程的概念:

“基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

⑴来源

⑵作用

〖问题〗1.什么叫磷酸二酯键?

〖生思考讨论回答,师提示〗3,5磷酸二酯键是核酸中核苷酸的连接方式,组成了核酸的一级结构。

在核酸中一个核苷酸核糖上第3位的羟基与下一个核苷酸核糖上第5位的磷酸羟基脱水缩合成酯键,该酯键称3,5磷酸二酯键。

若干个核苷酸间以3′,5′磷酸二酯键(如下图)连接成的多核苷酸链为核酸。

在链的一端的一个核苷酸,其核糖上第5位连接的磷酸只有一个酯键,称此核苷酸为DNA链的5′磷酸末端或5′端。

另一端核苷酸上第3位的羟基是自由的,所以此核苷酸称为3′羟基末端或3′端。

链内的核苷酸第5位上的磷酸已形成二酯键,第3位上的羟基也已参与二酯键的形成,故称核苷酸残基。

 

图DNA上的磷酸二酯键

〖寻根问底1〗2.根据你所掌握的知识,你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵,但是,生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,以防止外来病原物的侵害。

限制酶就是细菌的一种防御性工具,当外源DNA侵入时,会利用限制酶将外源DNA切割掉,以保证自身的安全。

所以,限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效,从而达到保护自身的目的。

〖问题〗3.联系你已有的知识,想一想,为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA?

〖生思考讨论回答,师提示〗迄今为止,基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的,它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。

细菌中限制酶之所以不切断自身DNA,是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,对于外源入侵的DNA可以降解掉。

生物在长期演化过程中,含有某种限制酶的细胞,其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。

这样,尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断,并且可以防止外源DNA的入侵。

⑶结果

①黏性末端

②平末端

〖问题〗4.限制酶所识别的序列有什么特点?

〖生思考讨论回答,师提示〗限制酶所识别的序列,无论是6个碱基还是4个碱基,都可以找到

一条中心轴线(如右图),中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。

〖思考与探究〗1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗?

以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:

(1)…CTGCA   

(2)…AC   (3)GC…(4)…G     (5)    G… (6)…GC

   …G           …TG       CG……CTTAA    ACGTC…     …CG

(7)GT…       (8)AATTC…

    CA…             G…

你是否能用DNA连接酶将它们连接起来?

〖生思考讨论回答,师提示〗答:

任何一种限制酶都只识别和切断特定的核苷酸序列,这是由限制酶的性质所决定的。

2和7能连接形成…ACGT…4和8能连接形成…GAATTC…

             …TGCA…;…CTTAAG…;

3和6能连接形成…GCGC…1和5能连接形成…CTGCAG…

            …CGCG…;…GACGTC…。

二、DNA连接酶——“分子缝合针”

㈠分类

连接酶有两种:

一种是从大肠杆菌中分离得到的,称之为E·coli连接酶。

另一种是从T4噬菌体中分离得到,称为T4连接酶。

㈡作用

这两种连接酶催化反应基本相同,都是连接双链DNA的缺口(nick),而不能连接单链DNA。

〖问题〗6.DNA连接酶连接的是什么部位?

〖生思考讨论回答,师提示〗DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键,而不是连接互补碱基之间的氢键。

〖问题〗7.DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?

为什么?

答:

不是一回事。

基因工程中所用的连接酶有两种:

一种是从大肠杆菌中分离得到的,称之为E·coli连接酶。

另一种是从T4噬菌体中分离得到,称为T4连接酶。

这两种连接酶催化反应基本相同,都是连接双链DNA的缺口(nick),而不能连接单链DNA。

DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键(在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成),那么,二者的差别主要表现在什么地方呢?

(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。

(2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。

因此DNA连接酶不需要模板。

此外,二者虽然都是由蛋白质构成的酶,但组成和性质各不相同。

〖网上查询〗8.DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

迄今为止,所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力,至于原因,现在还不清楚,也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。

三、基因进入受体细胞的载体——“分子运载车”

〖旁栏思考题〗想一想,具备什么条件才能充当“分子运输车”?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等

〖问题〗9.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗?

为什么?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒(plasmid),即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。

是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢?

其实不然,作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。

(1)载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点,以便目的基因可以插入到载体上去。

这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置,还必须是在质粒本身需要的基因片段之外,这样才不至于因目的基因的插入而失活。

(2)载体DNA必需具备自我复制的能力,或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。

(3)载体DNA必需带有标记基因,以便重组后进行重组子的筛选。

(4)载体DNA必需是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。

(5)载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作。

实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件,都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

〖模拟制作讨论题〗1.你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

不能。

因为一般基因有上千个碱基对。

2.如果你操作失误,碱基不能配对。

可能是什么原因造成的?

〖生思考讨论回答,师提示〗可能是剪切位点或连接位点选得不对(也可能是其他原因)。

1.2基因工程的基本操作程序

一、教学目标

1.知识方面

简述基因工程原理及基本操作程序。

2.能力方面

尝试设计某一转基因生物的研制过程。

二、教学重点和难点

1.教学重点

基因工程基本操作程序的四个步骤。

2.教学难点

(1)从基因文库中获取目的基因。

(2)利用PCR技术扩增目的基因。

三、教学方法

讲授法、对话法

四、教学课时

2

五、教学过程

〖对话〗﹙先解决为什么要分四个步骤的问题,然后解决每一步骤的技术方法问题。

1.为什么要有“目的基因的获取”这一步?

〖学生思考讨论回答,师提示〗引导学生看本专题题图中基因工程的概念:

“基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

”可以说这既是概念,也是原理。

这里所说的“更符合人们需要”,就是目的,那么更符合人们需要的那个基因就是目的基因了。

有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。

2.为什么要有“表达载体的构建”这一步?

〖学生思考讨论回答,师提示〗单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。

课文中谈到构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能表达和发挥作用。

3.为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步?

〖学生思考讨论回答,师提示〗教材指出含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞,并且维持稳定和表达,才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。

4.为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步?

〖学生思考讨论回答,师提示〗这是因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中,是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达,只有通过检测、鉴定才能得知。

〖转折〗每一程序的有什么技术和方法的学习?

一、目的基因的获取

〖问题引入〗“目的基因的获取”有什么方法呢?

〖求异思维〗你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗?

〖生思考讨论回答,师提示〗1970年,特明(H.M.Temin)和巴尔的摩(D.Baltimore)证实了RNA病毒中含有一种能将RNA转录成DNA的酶,这种酶被称为依赖RNA的DNA聚合酶,由于与中心法则中的从DNA到RNA的转录是反向的,所以称为反转录酶(reversetranscriptase)。

反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。

像其他DNA聚合酶一样,反转录酶也以5′→3′方向合成DNA(图1-3)。

 

图1-3由mRNA反转录形成cDNA的过程

cDNA合成过程是:

第一步,反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链,形成RNA-DNA杂交分子。

第二步,核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解,使之变成单链的DNA。

第三步,以单链DNA为模板,在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链,形成双链DNA分子。

〖讲授〗1.PCR的扩增过程是怎样的?

PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法,也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。

PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。

第一步:

将反应体系(包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等)加热至90~95℃,使双链DNA模板两条链之间的氢键打开,变成单链DNA,作为互补链聚合反应的模板。

第二步:

将反应体系降温至55~60℃,使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对,这个过程称为复性。

第三步:

将反应体系升温至70~75℃,在耐高温的DNA聚合酶催化作用下,将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上,使DNA链延伸,产生一条与模板链互补的DNA链。

上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。

PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

〖讲授〗2.如何从基因文库中找到所需要的基因?

从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情,要根据目的基因已有的某些信息来进行。

下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。

第一步,通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来,进行放射性同位素标记(也可以用别的标记方法进行,如生物素、荧光素等),即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针,与扩增出来的DNA杂交。

第二步,将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上(也可以用其他类型的膜),然后,通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质,并使DNA固定在膜上。

第三步,按Southern杂交的方法进行杂交。

第四步,在X光底片上出现黑斑的菌落,这表明这个菌落中含有所需要的目的基因(若选用别的标记方法,有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因)。

第五步,从该菌落中再提取目的基因。

二、基因表达载体的构建﹙核心﹚

〖思考与探究〗1.作为基因工程表达载体,只需含有目的基因就可以完成任务吗?

为什么?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

不可以。

因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用,还需要有其他控制元件,如启动子、终止子和标记基因等。

必须构建上述元件的主要理由是:

(1)生物之间进行基因交流,需使用启动子和终止子才能比较有利于基因的表达;如通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子,只将编码序列导入受体生物中无法转录;

(2)为了增强目的基因的表达水平,往往还要增加一些其他调控元件,如增强子等;

(3)目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记;

(4)有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位,往往要加上可以标识存在部位的基因(或做成目的基因与标识基因的融合基因),如绿色荧光蛋白基因等。

〖讲授〗3.基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素?

道理何在?

主要考虑以下几方面的因素。

(1)基因的特点:

如果一个来自动物的目的基因含有内含子,就不能用于转基因植物,因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同,植物不能将动物基因的内含子剪切掉,只能用该基因的cDNA。

基因的产物如果是一个糖蛋白,那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性,因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的,而细菌无这些细胞器。

(2)要选择强启动子或组织特异性启动子。

启动子有强有弱,选择强启动子可以增加转录活性,使基因产物量增多。

如果希望基因在生物的某个组织表达,如只在植物种子中表达,就要选择种子中特异表达的启动子。

(3)要有选择标记基因,如抗生素基因,以便选择出真正的转基因生物。

三、将目的基因导入受体细胞

〖思考与探究〗2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗?

若想将一个抗病基因导入单子叶植物,如小麦,从理论上说,你应该如何做?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌,在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。

根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。

据不完全统计,约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。

裸子植物对该菌也敏感。

当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。

近年来,也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。

根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。

根瘤农杆菌具有趋化性,即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。

研究证明,主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮,这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成,通常不存在于单子叶植物中,这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。

近年来还发现一些中性糖,如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。

酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物,又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区(毒性区)基因的诱导物,使Vir区基因活化,导致T-DNA的加工和转移,从而侵染植物细胞。

需要注意的是农杆菌中不同的菌株,侵染能力有差别,在基因工程中需要加以选择使用。

利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时,是需要加上述酚类物质的,同时单子叶植物种类不同,农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。

如果想将一个抗病毒基因转入小麦,也可以用农杆菌,但要注意两点:

①要选择合适的农杆菌菌株,因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物;②要加趋化和诱导的物质,一般为乙酰丁香酮等,目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢(趋化性)和激活农杆菌的Vir区(诱导)的基因,使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

〖寻根问底〗1.为什么要构建基因文库?

直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

构建基因文库是获取目的基因的方法之一,并不是惟一的方式。

如果所需要的目的基因序列已知,就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中,直接获得,也可以通过反转录,用PCR方式从mRNA中获得,不一定要构建基因文库。

但如果所需要的目的基因的序列完全不知,或只知道目的基因序列的一段,或想从一种生物体内获得许多基因,或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同,或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同,或者想得到一种生物的全基因组序列,往往就需要构建基因文库。

〖寻根问底〗2.将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗?

如果这么做,结果会怎样?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

有人采用总DNA注射法进行遗传转化,即将一个生物中的总DNA提取出来,通过注射或花粉管通道法导入受体植物,没有进行表达载体的构建,这种方法针对性差,完全靠运气,也无法确定什么基因导入了受体植物。

此法目前争议颇多,严格来讲不算基因工程。

四、目的基因的监测和鉴定

〖讲授〗4.什么是分子杂交技术的显示带?

分子杂交技术是基因工程中使用频率很高的一项技术,主要用于检测和鉴定,可以分为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交。

常用的技术有:

Southern杂交──DNA和DNA分子之间的杂交。

目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中,这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。

如何证明这一点,就需要通过Southern杂交技术。

基本做法是:

第一步,将受体生物DNA提取出来,经过适当的酶切后,走琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的片段分开;第二步,将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上;第三步,用标记了放射性同位素(或生物素)的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交;第四步,将X光底片压在硝酸纤维素膜上,在暗处使底片感光;第五步,将X光底片冲洗,如果在底片上出现黑色条带,则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。

Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交。

它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法,具体做法与Southern杂交相同,只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA,杂交带的显现也与Southern杂交相同。

Western杂交──蛋白质分子(抗原—抗体)之间的杂交。

它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。

具体做法是:

第一步,将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质;第二步,将表达出的蛋白质注射动物进行免疫,产生相应的抗体,并提取出抗体(一抗);第三步,从转基因生物中提取蛋白质,走凝胶电泳;第四步,将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上;第五步,将抗体(一抗)与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交,这时抗体(一抗)与目的基因表达的蛋白(抗原)会特异结合。

由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带,所以加入一种称为二抗的抗体,它可以与一抗结合,二抗抗体上带有特殊的标记。

如果目的基因表达出了蛋白质,则结果为阳性。

〖思考与探究〗3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素,联系前面有关细胞器功能的知识,结合基因工程操作程序的基本思路,思考一下,若要生产人的糖蛋白,可以用大肠杆菌吗?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的,内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中,大肠杆菌不存在这两种细胞器,因此,在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

〖思考与探究〗4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。

当它的成分异常时,动物有可能患某种疾病,如镰刀形细胞贫血症。

假如让你用基因工程的方法,使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白,想一想,应如何进行设计?

〖生思考讨论回答,师提示〗:

基本操作如下:

(1)从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列(cDNA)。

(2)将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,另外加上抗四环素的基因,构建成一个表达载体。

(3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。

如果表达载体未进入大肠杆菌中,大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉;如果培养基上长出大肠杆菌菌落,则表明β-珠蛋白基因已进入其中。

(4)培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌体,破碎后从中提取β-珠蛋白。

 

1.3基因工程的应用

一、教学目标

1.举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。

2.关注基因工程的进展。

3.认同基因工程的应用促进生产力的提高。

二、教学重点和难点

1.教学重点

基因工程在农业和医疗等方面的应用。

2.教学难点

基因治疗。

三、教学方法

讲授法、对话法

四、教学课时

2

五、教学策略

1.加强收集信息和处理信息环节的指导。

基因工程的应用是基因工程基本操作程序的一个必然结果。

如果本节只作为成果的学习,那么就显得思维力度不足了。

为此,建议加强指导学生收集和处理信息这一环节。

具体做法如下:

无论是学习转基因植物方面的应用,还是学习转基因动物方面的应用,乃至转基因工程菌生产药物方面的应用,首先必须寻找目的基因。

教师可利用表1-1,指导学生整理课本中提供的信息,填写此表。

这样做既可以调动学生学习的积极性,也增强了他们分析和处理信息的能力。

表1-1转基因生物与目的基因的关系

转基因生物

目的基因

目的基因从何来

抗虫棉

Bt毒蛋白基因

苏云金芽孢杆菌

抗真菌立枯丝核菌的烟草

几丁质酶基因和抗毒素合成基因

  

抗盐碱和干旱作物

调节细胞渗透压的基因

   

耐寒的番茄

抗冻蛋白基因

抗除草剂大豆

抗除草剂基因

 

增强甜味的水果

降低乳糖的奶牛

 

甜味基因

肠乳糖酶基因

 

生产胰岛素的工程菌

人胰岛素基因

指导学生提高处理信息的能力,还可以体现在对教材内容的重组上。

例如,我们可以解决当前世界上存在的重大问题作为主题,如以解决“粮食”、“环境污染”、“能源危机”、“攻克不治之症”等问题作为主题,让学生将课文中的知识或学生知道的课外的基因工程应用方面的知识进行重组。

这样的活动不仅培养了学生处理信息的能力,还会使学生感悟到肩负的社会责任,从而激发用科学技术报效祖国的志向。

2.课文中的一些难点,建议采用小组讨论,师生共同归纳的方法学习。

课文中有几处是学生学习感兴趣的知识,但文字说明不多,学生学习有一定难度。

例如“什么叫乳腺生物反应器”、

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