word版硝酸盐与亚硝酸盐的测定作业指导书.docx
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word版硝酸盐与亚硝酸盐的测定作业指导书
作业指导书
文件编号：
XZJY023-00-2017
版本号/修订状态：
一/第0次修改
亚硝酸盐和硝酸盐的的测定
页码/总页数：
1/11
实施日期：
2017.06.23
1、编制目的
为规范单位对亚硝酸盐和硝酸盐检测的操作，编制本作业指导书。
二、适用范围
本指导书适用于食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定。
三、编制依据
GB5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》
四、实验原理
亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定,硝酸盐采用镉柱还原法测定。
试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后,在弱酸条件下,亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后,再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料,外标法测得亚硝酸盐含量。
采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐,测得亚硝酸盐总量,由测得的亚硝酸盐总量减去试样中亚硝酸盐含量,即得试样中硝酸盐含量。
5、试剂和材料
5.1试剂
5.1.1亚铁氰化钾
5.1.2乙酸锌
5.1.3冰乙酸
5.1.4硼酸钠
5.1.5盐酸
5.1.6氨水
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亚硝酸盐和硝酸盐的的测定
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5.1.7对氨基苯磺酸
5.1.8盐酸萘乙二胺
5.1.9锌皮或锌棒
5.1.10硫酸镉
5.1.11硫酸铜
5.2试剂配制
5.2.1亚铁氰化钾溶液（106g/L）:
称取106.0g亚铁氰化钾,用水溶解,并稀释至1000mL。
5.2.2乙酸锌溶液（220g/L）:
称取220.0g乙酸锌,先加30mL冰乙酸溶解,用水稀释至1000mL。
5.2.3饱和硼砂溶液（50g/L）:
称取5.0g硼酸钠,溶于100mL热水中,冷却后备用。
5.2.4氨缓冲溶液（pH9.6~9.7）:
量取30mL盐酸,加100mL水,混匀后加65mL氨水,再加水稀释至1000mL,混匀。
调节pH至9.6~9.7。
5.2.5氨缓冲液的稀释液:
量取50mLpH9.6~9.7氨缓冲溶液,加水稀释至500mL,混匀。
5.2.6盐酸（0.1mol/L）:
量取8.3mL盐酸,用水稀释至1000mL。
5.2.7盐酸（2mol/L）:
量取167mL盐酸,用水稀释至1000mL。
5.2.8盐酸（20%）:
量取20mL盐酸,用水稀释至100mL。
5.2.9对氨基苯磺酸溶液（4g/L）:
称取0.4g对氨基苯磺酸,溶于
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100mL20%盐酸中,混匀,置棕色瓶中,避光保存。
5.2.10盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）:
称取0.2g盐酸萘乙二胺,溶于100mL水中,混匀,置棕色瓶中,避光保存。
5.2.11硫酸铜溶液（20g/L）:
称取20g硫酸铜,加水溶解,并稀释至1000mL。
5.2.12硫酸镉溶液（40g/L）:
称取40g硫酸镉,加水溶解,并稀释至1000mL。
5.2.13乙酸溶液（3%）:
量取冰乙酸3mL于100mL容量瓶中,以水稀释至刻度,混匀。
5.3标准品
5.3.1亚硝酸钠：
基准试剂,或采用具有标准物质证书的亚硝酸盐标准
溶液。
5.3.2硝酸钠：
基准试剂剂,或采用具有标准物质证书的硝酸盐标准溶液。
5.4标准溶液配制
5.4.1亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL,以亚硝酸钠计）：
准确称取0.1000g于110℃~120℃干燥恒重的亚硝酸钠,加水溶解,移入500mL容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀。
5.4.2硝酸钠标准溶液（200μg/mL,以亚硝酸钠计）：
准确称取0.1232g
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于110℃~120℃干燥恒重的硝酸钠,加水溶解,移入500mL容量瓶中,并稀释至刻度。
5.4.3亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）:
临用前,吸取2.50mL亚硝酸钠标准溶液,置于100mL容量瓶中,加水稀释至刻度。
5.4.4硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL,以亚硝酸钠计）:
临用前,吸取2.50mL硝酸钠标准溶液,置于100mL容量瓶中,加水稀释至刻度。
六、仪器和设备
6.1天平：
感量为0.1mg和1mg。
6.2组织捣碎机。
6.3超声波清洗器。
6.4恒温干燥箱。
6.5分光光度计
6.6镉柱或镀铜镉柱。
6.6.1镉粒镀铜:
将制得的镉粒置锥形瓶中（所用镉粒的量以达到要求的镉柱高度为准）,加足量的盐酸（2mol/L）浸没镉粒,振荡5min,静置分层,倾去上层溶液,用水多次冲洗镉粒。
在镉粒中加入20g/L硫酸铜溶液（每克镉粒约需2.5mL）,振荡1min,静置分层,倾去上层溶液后,立即用水冲洗镀铜镉粒（注意镉粒要始终用水浸没）,直至冲洗的水中不再有铜沉淀。
6.6.2镉柱的装填:
如图所示,用水装满镉柱玻璃柱,并装入约2cm高的玻璃棉做垫,将玻璃棉压向柱底时,应将其中所包含的空气全部排出,在
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轻轻敲击下,加入海绵状镉至8cm~10cm[见图1装置a）]或15cm~20cm[见图1装置b）],上面用1cm高的玻璃棉覆盖。
若使用装置b）,则上置一贮液漏斗,末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。
如无上述镉柱玻璃管时,可以25mL酸式滴定管代用,但过柱时要注意始终保持液面在镉层之上。
当镉柱填装好后,先用25mL盐酸（0.1mol/L）洗涤,再以水洗2次,每次25mL,镉柱不用时用水封盖,随时都要保持水平面在镉层之上,不得使镉层夹有气泡。
说明：
1---贮液漏斗，内径35mm，外径37mm；
2---进液毛细管，内径0.4mm，外径6mm；
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3---橡皮塞；
4---镉柱玻璃管，内径12mm，外径16mm；
5、7---玻璃棉；
6---海绵状镉
8---出液毛细管，内径2mm，外径8mm。
6.6.3镉柱每次使用完毕后,应先以25mL盐酸（0.1mol/L）洗涤,再以水洗2次,每次25mL,最后用水覆盖镉柱。
6.6.4镉柱还原效率的测定:
吸取20mL硝酸钠标准使用液,加入5mL氨缓冲液的稀释液,混匀后注入贮液漏斗,使流经镉柱还原,用一个100mL的容量瓶收集洗提液。
洗提液的流量不应超过6mL/min,在贮液杯将要排空时,用约15mL水冲洗杯壁。
冲洗水流尽后,再用15mL水重复冲洗,第2次冲洗水也流尽后,将贮液杯灌满水,并使其以最大流量流过柱子。
当容量瓶中的洗提液接近100mL时,从柱子下取出容量瓶,用水定容至刻度,混匀。
取10.0mL还原后的溶液（相当10μg亚硝酸钠）于50mL比色管中,以下按7.3自“吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL……”起操作,根据标准曲线计算测得结果,与加入量一致,还原效率应大于95%为符合要求。
6.6.5还原效率计算按式计算：
式中：
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X---还原效率，%；
m1---测得亚硝酸钠的含量，单位为微克（μg）；
10---测定用溶液相当亚硝酸钠的含量，单位为微克（μg）。
如果还原率小于95%时,将镉柱中的镉粒倒入锥形瓶中,加入足量的盐酸（2moL/L）中,振荡数分钟,再用水反复冲洗。
7、分析步骤
7.1试样的预处理
7.1.1蔬菜、水果:
将新鲜蔬菜、水果试样用自来水洗净后,用水冲洗,晾干后,取可食部切碎混匀。
将切碎的样品用四分法取适量,用食物粉碎机制成匀浆,备用。
如需加水应记录加水量。
7.1.2粮食及其他植物样品:
除去可见杂质后,取有代表性试样50g~100g,粉碎后,过0.30mm孔筛,混匀,备用。
7.1.3肉类、蛋、水产及其制品:
用四分法取适量或取全部,用食物粉碎机制成匀浆,备用。
7.1.4发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品:
通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。
7.2提取
7.2.1液体乳样品:
称取试样90g（精确至0.001g）,置于250mL具塞锥形瓶中,加12.5mL饱和硼砂溶液,加入70℃左右的水约60mL,混匀,于沸水
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浴中加热15min,取出置冷水浴中冷却,并放置至室温。
定量转移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L亚铁氰化钾溶液,摇匀,再加入5mL220g/L乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。
加水至刻度,摇匀,放置30min,除去上层脂肪,上清液用滤纸过滤,滤液备用。
7.2.2其他样品:
称取5g（精确至0.001g）匀浆试样（如制备过程中加水,应按加水量折算）,置于250mL具塞锥形瓶中,加12.5mL50g/L饱和硼砂溶液,加入70℃左右的水约150mL,混匀,于沸水浴中加热15min,取出置冷水浴中冷却,并放置至室温。
定量转移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L亚铁氰化钾溶液,摇匀,再加入5mL220g/L乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。
加水至刻度,摇匀,放置30min,除去上层脂肪,上清液用滤纸过滤,弃去初滤液30mL,滤液备用。
7.3亚硝酸盐的测定
吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中,另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠）,分别置于50mL带塞比色管中。
于标准管与试样管中分别加入2mL4g/L对氨基苯磺酸溶液,混匀,静置3min~5min后各加入1mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混匀,静置15min,用1cm比色杯,以零管调节零点,于波长538nm处测吸光度,绘制标准曲线比较。
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同时做试剂空白。
7.4硝酸盐的测定
7.4.1镉柱还原
7.4.1.1先以25mL氨缓冲液的稀释液冲洗镉柱,流速控制在3mL/min~5mL/min（以滴定管代替的可控制在2mL/min~3mL/min）。
7.4.1.2吸取20mL滤液于50mL烧杯中,加5mLpH9.6~9.7氨缓冲溶液,混合后注入贮液漏斗,使流经镉柱还原,当贮液杯中的样液流尽后,加15mL水冲洗烧杯,再倒入贮液杯中。
冲洗水流完后,再用15mL水重复1次。
当第2次冲洗水快流尽时,将贮液杯装满水,以最大流速过柱。
当容量瓶中的洗提液接近100mL时,取出容量瓶,用水定容刻度,混匀。
7.4.2硝酸钠总量的测定
吸取10mL~20mL还原后的样液于50mL比色管中。
以下按7.3自“吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL……”起操作。
8、计算结果与检出限
8.1亚硝酸盐含量计算
式中:
X1———试样中亚硝酸钠的含量,单位为毫克每千克（mg/kg）;
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m2———测定用样液中亚硝酸钠的质量,单位为微克（μg）;
1000———转换系数;
m3———试样质量,单位为克（g）;
V1———测定用样液体积,单位为毫升（mL）;
V0———试样处理液总体积,单位为毫升（mL）。
结果保留2位有效数字。
8.2硝酸盐含量的计算
式中:
X2———试样中硝酸钠的含量,单位为毫克每千克（mg/kg）;
m4———经镉粉还原后测得总亚硝酸钠的质量,单位为微克（μg）;
1000———转换系数;
m5———试样的质量,单位为克（g）;
V3———测总亚硝酸钠的测定用样液体积,单位为毫升（mL）;
V2———试样处理液总体积,单位为毫升（mL）;
V5———经镉柱还原后样液的测定用体积,单位为毫升（mL）;
V4———经镉柱还原后样液总体积,单位为毫升（mL）;
X1———由8.1式计算出的试样中亚硝酸钠的含量,单位为毫克每千克
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（mg/kg）;
1.232———亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数。
结果保留2位有效数字。
8.3检出限
亚硝酸盐检出限:
液体乳0.06mg/kg,乳粉0.5mg/kg,干酪及其他1mg/kg;硝酸盐检出限:
液体乳0.6mg/kg,乳粉5mg/kg,干酪及其他10mg/kg。
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