胡椒醇提液外用对兔耳冻伤的医治研究.docx

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胡椒醇提液外用对兔耳冻伤的医治研究

胡椒醇提液外用对兔耳冻伤的医治研究

邓永坤，赖泳，董寿堂，王银辉，李凤贤

【摘要】目的探讨胡椒醇提液外用对兔耳轻度冻伤的医治成效。

方式用－15℃左右低温液复制兔耳轻度冻伤模型，冻伤后48h开始在兔冻耳涂抹胡椒70%乙醇提取液医治，2d后测定血清中SOD活性、MDA和TNF-α含量，4d后评判冻耳外观正常与否及变形程度，制作冻耳组织病理切片，显微镜下观看冻耳组织病理转变，同时测定血清与冻耳组织中SOD活性、MDA和TNF-α含量。

结果用胡椒70%乙醇提取液医治2d后血清中SOD活性显著增加，MDA量显著降低，TNF-α量无明显转变。

医治4d后血清中SOD活性、MDA和TNF-α含量均无明显不同，但冻耳组织中SOD活性与TNF-α水平显著提高，MDA量显著降低。

另外冻耳外观评判与组织病理检查显示冻耳组织坏死范围减少，修复速度明显提高。

结论胡椒70%乙醇提取液局部外用对轻度冻伤有医治作用。

【关键词】胡椒；冻伤；医治作用

　　Abstract：

ObjectiveToinvestigatethetherapeuticeffectofalcoholextractfrompepperonmildandmoderatefrostbiteofrabbitear.MethodsTherightrabbitear,within7cmscopefromapexconchaeauristowardsulcusauriculaeposterior,wasimmersedintocoldliquidat-15℃toestablishanexperimentalmodelofmildandmoderatefrostbite.2dafterfrostbite,70%alcoholextractfrompepperwasappliedontosurfaceofearsfrozen.SODactivity,MDAandTNF-αlevelsinserumweredetermined2and4daftertreatment.Thenafterapplicationfor4d,SODactivity,contentsofMDAandTNF-αintissueofearfrozenweredetected.Inaddition,therecoveryprofilesofearfrozenlikeappearancevariablesandhistopathologicfeatureswereactivityinserumsignificantlyincreased2daftertreatmentwith70%alcoholextractfrompepper,MDAlevelsignificantlydecreasedandTNF-αlevelhadnodifference.SODactivity,MDAandTNF-αconcentrationsinserumshowednodifferencesafteradministrationfor4tissueoftheaffectedear,SODactivityandTNF-αcontentswereobviouslyathighlevelsatthistime,MDAcontentwastheopposite.Ontheotherhand,theappearancereviewandhistopathologicexaminationbothmanifestedthattopicalapplicationof70%alcoholextractfrompepperdiminishednecroticregionsofearfrozen,acceleratedtissuerepairafterfrostbite.Conclusion70%alcoholextractofpepperhaspharmacologicalactivityonmildandmoderatefrostbitehealing.

　　Keywords：

Pepper;Frostbite;Therapeuticeffect

　　胡椒是传统中药，为胡椒科植物胡椒PipernigrumL.的干燥近成熟或成熟果实。

民间有效胡椒粉煮水或泡酒擦洗患处医治冻疮的用法，而且疗效确切。

笔者所在研究组欲对胡椒抗冻疮作用进行动物实验验证，通过查阅中外文献数据库（包括中国CNKI和VIP科技论文全文数据库，美国Gale、Pubmed和HighWirePress数据库），未能检索到动物冻疮实验模型的报导。

研究组曾依照冻疮病因病机试制动物冻疮模型，但均未成功。

临床上以为Ⅰ，Ⅱ度（轻度）冻伤和冻疮的临床表现及医治大体一致，因此在没有冻疮动物模型可用的情形下，药物对轻度冻伤的疗效仍可作为对冻疮医治作用的参考，有踊跃意义。

　　兔耳冻伤后由于局部细胞发生变性或坏死，兔耳形态和组织结构会有所改变，变性的细胞如及时恢复供血供氧，清除损伤因子，能转为正常，反之，如持续缺血缺氧，那么损伤可进一步加重，直至坏死。

坏死表皮可由周围正常表皮再生修复，真皮坏死那么只能通过肉芽组织填补修复，修复后兔耳形态和组织结构不能恢复正常；另外，因冻伤后机体氧化抗氧化系统平稳被打破，丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）这对反映组织氧化损伤程度与抗氧化能力的生化指标会发生相应转变；最近几年来肿瘤坏死因子α（TNF-α）在创伤和创伤修复中的作用愈来愈受人们关注。

现已证明，在创伤修复初期TNF-α能诱导白细胞脱颗粒，增强其吞噬能力，加速肉芽组织及肉芽组织内新生血管形成［1～3］。

在修复中、后期高浓度TNFα能抑制成纤维细胞胶原蛋白基因的转录,同时能够引发胶原酶基因转录的显著增加,因此TNFα在组织的重塑中具有重要意义，可减少瘢痕组织形成，提高修复质量［4，5］。

也确实是说，在创伤修复初期适当浓度的TNFα能加速创面修复，中、后期高浓度TNFα能提高修复质量［6］。

该文通过观看冻伤兔耳医治后外观形态与组织病理改变情形，测定血清和冻耳组织中MDA、SOD、TNF-α含量综合评判胡椒局部外用对兔耳轻度冻伤的医治作用，进而研究胡椒抗冻疮的成效。

　　1仪器与材料

　　仪器

　　2020型酶标仪（奥地利AnthosLabtecInstruments公司）；756MC紫外可见分光光度计（上海周密科学仪器）。

　　试药

　　取白胡椒（购自东骏大药房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24h），归并浸提液，静置分层，过滤，滤液用70%乙醇配制为高、中两种浓度供试液，每毫升别离相当于生药，g；MDA和SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号别离为：

，）；TNFα试剂盒（美国AdlitteramDiagnosticLaboratories公司，批号：

RT110371）。

　　动物

　　日本大耳白兔40只，体质量～kg，雌雄兼用，由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：

SCXK（滇）2005-0008。

　　2方式

　　冻伤模型复制与给药

　　［7］取家兔分为4组，即正常、溶剂和高、中浓度胡椒供试液组，每组10只，于实验室正常单笼饲养6d后将右耳耳尖至耳根7cm范围剪毛，隔日将右耳剪毛区域浸入（-15±1）℃冷冻液（6份碎冰+1份氯化钠）中，正常组除外。

待兔耳变白变硬后再冻30s，掏出，空气中停留20s后以35℃温水复温20s，掏出兔耳，擦干水分，冻伤模型复制完毕。

冻伤后48h开始在冻伤兔耳剪毛区域别离涂药，1ml/次，3次/d，涂药4d后，医治终止。

　　冻耳医治后外观评判

　　冻耳皱缩变形的范围大小反映了组织细胞坏死和瘢痕修复的范围大小，是药物对冻伤所致组织细胞变性的爱惜和促恢复作用的直接表现。

此处将冻耳医治后外观评判由好到差分为4级：

正常（冻耳医治后颜色、外观、触感和厚度与正常兔耳完全一样）、轻度变形（冻耳耳尖至耳根方向2cm区域内皱缩变形）、中度变形（耳尖至耳根方向4cm区域内皱缩变形）、重度变形（耳尖至耳根方向皱缩变形范围超过4cm）。

　　冻耳病理检查

　　医治4d后，家兔左耳耳缘静脉空气栓塞致死，当即沿浸冻线剪下冻耳浸冻部份，由耳尖垂直于浸冻线方向将冻耳浸冻部份剪成对称的两半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做SOD、MDA和TNF-α测定），别离在耳尖向耳根方向1，2，3cm处取材，常规石蜡包埋，HE染色，以正常兔耳为对照，显微镜下观看冻耳组织病理转变。

　　SOD、MDA和TNFα测定

　　［8］涂药2d后，左耳中央动脉取血约4ml。

涂药4d后心脏取血约4ml，取“”项下病理检查剪下的另一半冻耳，剪取耳尖部，置事前盛有预冷生理盐水的小烧杯中，涮洗几下，掏出，滤纸吸干水分，称1g耳尖部组织，用10ml预冷的mol/L的PBS制备组织匀浆。

血液与组织匀浆4℃别离以4000r/min和2000r/min离心10min，取血清和耳组织匀浆上清，按试剂盒中操作方式测定SOD总活力、MDA与TNF-α含量。

　　统计

　　所有数据均用统计，其中冻耳医治后外观评判用秩和查验Mann-WhitneyU法，SOD、MDA和TNFα测定结果用方差分析LSD法。

　　3结果

　　冻耳外观转变

　　复温后兔耳开始发红发烧，随后变紫、肿胀、下垂。

肿胀慢慢加重，12h后部份兔耳显现浆液性水泡，泡液无色或淡黄色，随后水泡增大或新水泡形成。

24h后肿胀程度再也不增加，水泡再也不增大或无新水泡形成。

48h后部份兔耳冻区有黄色液体渗出。

医治后冻耳肿胀慢慢消退，医治终止（医治4d）后各组冻耳均已不见明显肿胀。

高、中浓度胡椒供试液组医治终止后别离有4只和2只家兔冻耳外观同正常兔耳（冻耳表皮滑腻平整，未见坏死，冻耳颜色、触感、弹性和厚度均与未冻伤的左耳完全一样），其它家兔冻耳均有不同程度的皱缩变形和硬化、表面凹凸不平、表皮坏死，个别家兔冻耳表面有硬痂产生。

高浓度胡椒供试液组医治终止后冻耳外观评判明显好于溶剂组（P<）。

结果见表1。

表1胡椒对轻度冻伤兔耳形态改变的阻碍（略）

　　冻耳医治后病理转变

　　医治后高、中浓度胡椒供试液组兔冻耳表皮均修复完整，真皮水肿及炎症均明显消退，部份兔冻耳真皮已无水肿和炎症表现（高浓度5只，低浓度3只），近半数兔冻耳毛囊和皮脂腺数量正常（高浓度6只，中浓度4只），未见毛囊和皮脂腺坏死，冻耳整体恢复程度和速度明显好于溶剂组，见图1。

　　SOD测定结果

　　医治2d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中SOD活力均显著高于溶剂组（P<）。

医治4d后各组血清中SOD活力已无明显不同，但冻耳组织中SOD活力有明显不同，高、中浓度胡椒供试液组显著高于溶剂组（高浓度P<，中浓度P<）。

结果见表2。

表2胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中SOD活力的阻碍（略）

　　MDA测定结果

　　医治2d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中MDA量显著低于溶剂组（P<）。

医治4d后各组血清中MDA量均必然程度下降，与正常组相较已无明显不同，但现在冻耳组织中MDA量有不同，高、中浓度胡椒供试液组显著低于溶剂组（高浓度P<，中浓度P<）。

结果见表3。

表3胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中MDA含量的阻碍（略）

　　TNF-α测定结果

　　医治2d和4d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中TNF-α量与溶剂组相较均无明显不同，但医治4d后冻耳组织中TNF-α量显著高于溶剂组（P<）。

结果见表4。

表4胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中TNF-α含量的阻碍（略）

　　4讨论

兔耳冻伤后形态改变的范围事实上反映了冻耳存活的组织细胞面积和存活量。

因此，医治终止后，通过兔冻耳外观正常与否及形态异样范围可评判药物抗冻伤的疗效，药物如能减少耳冻伤后细胞坏死的数量和范围，那么冻耳形态改变区域就小。

这次研究结果显示，高浓度胡椒供试液能显著降低兔耳轻度冻伤后形态改变程度（P<）,而且医治终止后4/10冻耳形态与正常兔耳完全一致。

冻伤4d（医治2d）后兔血循环中SOD活力还明显低于正常，相应的脂质过氧化物MDA含量明显高于正常，但胡椒供试液能显著增强血液中SOD活力，减少MDA的产生。

冻伤6d（医治4d）后血循环中SOD活力和MDA水平大体恢复正常，但冻耳组织中SOD活力明显低于正常，另外MDA量也明显高于正常，更成心义的是胡椒供试液能显著增加冻耳组织中SOD活力并降低MDA水平。

由此说明，兔耳局部轻度（主若是Ⅱ度）冻伤后不仅能打破受冻局部组织氧化抗氧化系统的平稳，而且因此可使全身血循环中氧化抗氧化系统受累，最终致使失衡。

氧化抗氧化系统失衡的顺序为局部冻伤组织到全身血循环，而恢复的顺序那么正好相反。

另外实验结果也说明，冻伤局部应用胡椒70%乙醇提取液能有效增加机体抗氧化能力，抑制受冻组织氧化损伤。

兔冻耳局部胡椒供试液医治2d和4d后血液中TNF-α水平与溶剂组相较均无明显不同，值得关注的是，医治4d（冻伤6d）后冻耳组织中TNF-α含量显著高于溶剂组。

前面已经述及在修复中、后期高浓度的TNF-α能增进组织重塑，提高修复质量，这与冻耳医治后外观评判、组织病理及MDA与SOD活力测定结果相吻合。

兔足轻、重度冻伤后72h内SOD活性和MDA量的转变［9］、大鼠重度冻伤后72h内SOD活性、MDA和TNF-α含量的转变［10］国内已见报导，但冻伤后更长时刻的上述指标的定量及转变尚未文献，加上冻伤后生化指标转变的研究报导数量很有限，因此药物抗冻伤的药效研究都未就冻伤后这些指标的转变进行测定。

这次胡椒对兔耳轻度冻伤的作用研究中SOD活性、MDA和TNF-α含量转变测定结果对药物抗轻度冻伤和冻疮药效评判有必然参考价值。

【参考文献】

　　［1］ZhangLL,DingYC,LiXF,etal.Time-relatedexpressionofcytokinesinskinsamplesduringthewoundhealingprocess［J］.ChineseJournalofClinicalRehabiitation,2004,8（23）:

4906.

　　［2］GrellnerW,GeorgT,WilskeJ.Quantitativeanalysisofproinflammatorycytokines（IL-1beta,IL-6,TNF-alpha）inhumanskinwounds［J］.ForensicSciInt,2000,113（1-3）:

251.

　　［3］GrellnerW.Time-dependentimmunohistochemicaldetectionofproi-nflammatorycytokines（IL-1beta,IL-6,TNF-alpha）inhumanskinwounds［J］.ForensicSciInt,2002,130（2-3）:

90.

　　［4］章建林,林子豪,刘麒,等.增生性瘢痕的形成与组织中肿瘤坏死因子含量相关性的研究［J］.中国临床康复,2002,6（8）:

1125.

　　［5］Solis-HerruzoJA,BrennerDA,ChojrierM,etal.Tumornecrosisfactorinhibitscollagengenetranscriptionandcollagensynthesisinculturedhumanfibroblasts［J］.JBiolChem,1988,263:

5841.

　　［6］张学军,刘维达,何春涤.现代皮肤病学基础［M］.北京:

人民卫生出版社,2001:

232,1084.

　　［7］施新猷.现代医学实验动物学［M］.北京:

人民军医出版社,2000:

509.

　　［8］李向东,鲁开化,郭树忠,等.猪后肢皮肤撕脱伤后TNF-α和IL-1的检测意义［J］.第全军医大学学报,2001,23（5）:

562.

　　［9］杨成君,吕薇,尹旭辉,等.兔足冻伤后抗氧化系统的转变［J］.解放军预防医学杂志,1998,16

（2）:

93.

　　［10］杨义军,陈　悦,杨成君,等.大鼠重度冻伤初期血液中TNF、MDA和SOD的转变［J］.中国公共卫生,1999,15（12）:

1062.