1920 第1部分 专题12 考点1 基因工程和蛋白质工程.docx

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1920第1部分专题12考点1基因工程和蛋白质工程

　基因工程和蛋白质工程

1．基因工程的基本工具

2．基因工程的操作步骤

（1）获取目的基因的三种方法

①从基因文库中获取

②

③化学法人工合成：

通过DNA合成仪利用化学方法直接合成。

（2）基因表达载体的构建——重组质粒的构建

①基因表达载体的组成

②构建过程

（3）将目的基因导入受体细胞的“三种类型”

①导入植物细胞——农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法（本法针对单子叶植物）

②导入动物细胞——显微注射法

③导入微生物（细菌）——转化法

（4）目的基因的检测与鉴定的方法

①检测目的基因是否导入受体细胞：

DNA分子杂交技术。

②检测目的基因是否转录出mRNA：

分子杂交技术。

③检测目的基因是否翻译成蛋白质：

抗原—抗体杂交技术。

④个体生物学水平鉴定：

根据表达性状判断。

3．蛋白质工程

（1）流程图

写出流程图中字母代表的含义：

A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。

（2）基本途径：

从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

（3）对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现。

1．（2019·全国卷Ⅰ）基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。

回答下列问题。

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。

基因文库包括________和________。

（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。

在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。

上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。

巩固提升见P184考向2第1题

（1）

（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________。

解析：

（1）基因文库包括基因组文库和cDNA文库。

（2）生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。

（3）在PCR过程中，要加热至90～95℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。

答案：

（1）基因组文库　cDNA文库

（2）解旋酶　加热至90～95℃　氢键

（3）Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活

2．（2018·全国卷Ⅰ）回答下列问题：

（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。

该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了___________________________________________（答出两点即可）。

（2）体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。

在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。

（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。

为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。

解析：

（1）两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：

质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达（不同生物共用一套密码子）、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。

（2）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。

噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。

噬菌体专门寄生在细菌中，故不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。

（3）若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。

同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。

答案：

（1）体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达

（2）转化　外壳蛋白（或噬菌体蛋白）　细菌

（3）蛋白酶缺陷型　蛋白酶

3．（2017·全国卷Ⅰ）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。

已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。

回答下列问题：

（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是________________________。

（2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________作为载体，其原因是______________。

（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。

因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_______________________________（答出两点即可）等优点。

（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。

（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________________________。

解析：

（1）人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。

（2）噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主。

家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。

（3）与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。

（4）检测基因A是否翻译出蛋白A，可用抗原—抗体杂交法。

（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。

也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。

答案：

（1）基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A　

（2）噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕　（3）繁殖快、容易培养　（4）蛋白A的抗体　（5）DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体

4．（2017·全国卷Ⅱ）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。

通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。

回答下列问题：

（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是____________________。

提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________________。

（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是___________

____________________________________________________。

（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是____________________（答出两点即可）。

（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_________________________________________。

（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是____________。

解析：

（1）与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。

提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。

（2）以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录（反转录）可以获得cDNA。

（3）因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。

（4）构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。

（5）转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。

答案：

（1）嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解　

（2）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA　（3）目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子　（4）磷酸二酯键　（5）目的基因的转录或翻译异常

巩固提升见P183考向1第1题

（2），P185考向2第2题

（2）第一空

5．（2015·全国卷Ⅱ）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。

如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。

回答下列问题：

（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。

（2）以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。

所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括__________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：

____________________________________________________。

（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。

解析：

（1）从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。

（2）在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。

中心法则的内容如下图所示：

由图可知，中心法则的全部内容包括：

DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制（如烟草花叶病毒等），在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA（如HIV），这是对中心法则的补充。

（3）蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。

答案：

（1）氨基酸序列（或结构）

（2）P　P1　DNA和RNA（或遗传物质）　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质（或转录、逆转录、翻译）

（3）设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能

　基因工程的工具及操作程序

1．（2019·沈阳市东北育才学校高三模拟）青蒿素是最有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tms基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织，从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图。

（1）科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是____________________________________________________。

（2）图中结构P、T是基因成功转录的保证，其中结构P的作用是________________________。

为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是________________。

（3）在获得转基因的冠瘿组织过程中，____________________是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是_____________________。

①

（4）TDNA的作用是可以使____________________，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用____________技术。

②

（5）与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是

____________________________________________________

____________________________________________________。

解析：

（1）目的基因导入植物细胞的方法有：

农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，而导入植物细胞最常用农杆菌转化法，因此，科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是农杆菌转化法。

（2）图中结构P、T与基因的转录有关，即基因成功转录的保证，T为终止子，则P为启动子，它的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。

为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是标记基因。

（3）在获得转基因的冠瘿组织过程中，基因表达载体的构建是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接。

（4）TDNA的作用是可以使目的基因进入植物细胞，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用DNA分子杂交技术。

（5）冠瘿组织的生长与细胞的分裂和伸长等有关，由此推知冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进其生长。

答案：

（1）农杆菌转化法　

（2）RNA聚合酶识别和结合的部位　标记基因　（3）基因表达载体的构建（或构建基因表达载体）　可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接　（4）目的基因进入植物细胞　DNA分子杂交　（5）tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长

①巩固提升见P185考向2第2题

（2）第二空、P192第1题

（1）第三空

②巩固提升见P193第2题（4）

2．（2019·濮阳市高三二模）P450是石油降解的关键酶，用SalI和NdeⅠ联合酶切获得的P450基因，与下图所示的质粒（pCom8）重组，导入土著菌种Y9，获得了基因工程菌P450/Y9。

图中mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的菌落变成黑色，aacCl是庆大霉素（一种抗生素）抗性基因，限制酶NdeⅠ、XhoⅠ和SspⅠ在原质粒上均只有一个酶切位点。

右图表示几种限制酶的识别序列和切割位点，据图回答下列问题：

（1）构建pCom8重组质粒时，需用________①（限制酶）对图示质粒进行处理，才能与________在DNA连接酶的作用下形成重组质粒。

（2）为了扩增重组质粒，需将其转入用________预先处理的土著菌种Y9中，提高质粒导入率，以便获得更多基因工程菌P450/Y9。

为了筛选出转入了重组质粒的基因工程菌P450/Y9，应在筛选平板培养基中添加________。

作为载体的质粒除了含有标记基因，还应该含有________________________________②（至少写两个）。

（3）为检测基因工程菌降解石油能力的大小，可观测的指标是____________。

土著菌种Y9不能降解石油，但转入上述构建好的表达载体后则获得降解石油的能力，这是因为__________________。

解析：

（1）根据题干信息已知，切割目的基因的限制酶是SalⅠ和NdeⅠ，而pCom8上无SalⅠ的切割位点，又因为右图显示SalⅠ和XhoⅠ切割后露出的黏性末端是相同的，因此可以用NdeⅠ、XhoⅠ切割质粒，然后与目的基因在DNA连接酶的作用下形成重组质粒。

（2）为提高质粒导入率，土著菌种Y9预先需用Ca2＋处理。

因为SalⅠ切割质粒会破坏标记基因mel，而aaCl未被破坏，因此为了筛选出转入了重组质粒的基因工程菌P450/Y9，应在筛选培养基中加入庆大霉素。

质粒具备的特点有含有标记基因、启动子、终止子、复制原点、一个至多个限制酶切割位点等。

（3）为检测基因工程菌降解石油能力的大小，可在一定时间内观测所取样品石油的剩余量。

P450是石油降解的关键酶，转入表达载体后，P450基因得以表达，即基因工程菌P450/Y9可分泌降解石油的P450酶。

答案：

（1）NdeⅠ、XhoⅠ　目的基因（或P450基因）

（2）Ca2＋（或CaCl2）　庆大霉素　启动子、终止子、复制原点（答出两点即可）

（3）2天后（或一定时间后）样品中石油的含量（剩余量）　基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶（合理即可）

①巩固提升见P192第1题

（1）第一空、P192第2题

（2）第二空

②巩固提升见P185考向2第2题

（2）第一空

（1）使用限制酶的注意点

①一般用同种限制酶切割载体和目的基因。

②不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。

③双酶法可以使目的基因与载体定向连接，防止目的基因和载体的自身环化以及二者反向连接。

（2）有关标记基因的易错点

①一般将一些抗性基因作为标记基因。

②标记基因的主要作用是鉴定和筛选含有目的基因的受体细胞。

③标记基因表达产物对什么物质有抗性，在筛选培养时则在培养基中加入什么物质。

④标记基因若被插入了外源DNA片段，则该标记基因会被破坏。

（3）基因工程产物不同，选择的受体细胞类型也不相同

①培育转基因植物：

受体细胞可以是受精卵、体细胞（需经植物组织培养成为完整植株）。

②培育转基因动物：

受体细胞为受精卵，若用体细胞作为受体细胞，则需经核移植技术培养成转基因动物。

③生产蛋白质产品：

一般选用大肠杆菌等原核生物的细胞作为受体细胞，因为原核生物具有一些其他生物没有的特点，如繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。

若要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素（需内质网、高尔基体的加工）则必须用真核生物，如酵母菌。

　基因工程原理的应用及蛋白质工程

1．为探究M基因的功能，科研人员将克隆得到的M基因导入拟南芥植株（自交繁殖），流程图如图所示，回答下列问题：

（1）通过过程a、b，采用__________________的方法来获得大量的M基因，过程b中需先加热至90～95℃然后冷却至55～60℃，冷却的目的是________________________。

（2）为了获得转基因植物，采用________法侵染拟南芥的花序。

基本过程如下：

①过程d：

将重组质粒导入大肠杆菌，其目的是__________。

②过程e：

将重组质粒导入农杆菌，再将含有重组质粒的农杆菌离心、富集，得到含有M基因的农杆菌液。

③过程f：

在拟南芥植株产生大量花序时，将其花表面部分在农杆菌悬浮液中浸泡20～30s，3～4周后对转化拟南芥植株收种子（T0），浸泡之前，需先剪去已经长成的角果（这些角果将来发育成种子），原因是_________________。

④将收获的拟南芥种子T0，播种在含有________的培养基上，能健康生长的幼苗含有________。

（3）采用农杆菌介导的花序侵染法转化，一般只能将目标片段整合到一条DNA上，若要获得M基因稳定的突变体，需________筛选出能稳定遗传的突变体。

解析：

（1）图示中由已知RNA获取目的基因的方法是反转录法（逆转录法），对目的基因进行扩增采用的是PCR技术。

进行PCR时需加热至90～95℃然后冷却至55～60℃，冷却的目的是使引物结合到互补DNA链上。

（2）①图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是利用大肠杆菌的增殖来获取大量重组质粒（让目的基因扩增）。

③适合转化植株的花卉应没有成熟，也没有产生已受精的角果。

因为这些已受精的角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低转化率，不利于后续操作。

④由于质粒中含有卡那霉素抗性基因，成功转入重组质粒的种子能够在卡那霉素培养基上正常生长，非转基因种子不能正常生长，一般萌发后死亡。

（3）由于农杆菌介导的花序侵染法一般只能将目标片段整合到一条DNA上，为筛选出能稳定遗传的突变体，可将T0代连续自交。

答案：

（1）反转录法（逆转录法）和PCR技术　使引物结合到互补DNA链上

（2）农杆菌转化　①获取大量重组质粒（让目的基因扩增）

③这些已受精的角果将来结的种子是非转基因的　④卡那毒素　M（目的）基因

（3）T0代连续自交

2．（2019·安徽省芜湖市高三期末）国际水稻研究所人员从产量低的耐淹水稻中找到一种耐淹基因，将其移入到高产热带水稻中，终于培育出耐淹的高产水稻品系，其产量比高产热带水稻产量还要高。

耐淹基因移入的方法可通过转基因技术实现。

请回答下列相关问题：

（1）为培育耐淹的高产水稻品系，应需将耐淹基因进行体外扩增。

在PCR反应体系中加入了热稳定DNA聚合酶、引物等，还加入耐淹基因作为________，加入__________作为合成DNA的原料。

（2）质粒常被用作运载体，因为质粒具有_____________________（答2点即可）。

构建耐淹基因的质粒表达载体时，常用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，目的是________________________________________。

（3）根据耐淹基因表达的蛋白质，研究人员通过对它的氨基酸序列设计并人工合成耐淹基因。

与水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在结构上缺少了________________。

虽然两种基因转录的产物不同，但最终表达出相同的蛋白质，可能原因是____________。

（4）蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质的原因是____________________。

解析：

（1）利用PCR技术在体外扩增耐淹基因（目的基因）时，在PCR反应体系中除了加入热稳定DNA聚合酶、引物等之外，还加入耐淹基因作为模板，加入dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）作为合成DNA的原料。

（2）质粒被用作运载体，应具备的条件有：

能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切割位点，方便剪切；具有标记基因，便于检测和筛选。

构建耐淹基因的质粒表达载体时，用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，可以减少耐淹基因及质粒的自身环化、使耐淹基因定向连接到质粒上，以增大耐淹基因正向（正确）连接的概率。

（3）根据耐淹基因表达的蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA分子中，缺乏与基因中的启动子、终止子和内含子相对应的