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废水培养微生物絮凝剂1
利用废水生产微生物絮凝剂的研究
摘要：
从土壤中筛选得到的6株具有较高絮凝活性的菌种，以啤酒废水为廉价培养基培养，用以降低成本。
通过改变废水预处理方法以及在废水中添加各种碳、氮源及无机盐等因子进行实验。
实验结果表明，最佳絮凝剂产生菌为Y1，其最佳培养条件为：
对啤酒废水高温灭菌，添加KH2PO4为2g/l，调pH为7.5-8.0，培养温度30℃、摇床转速180rpm、培养24h，在这样的条件下，Y1菌种所产的絮凝剂对高岭土悬浊液絮凝率达到90%以上，同发酵培养基的发酵液相比絮凝率相差无几，结果说明利用啤酒酵母废水来培养微生物产絮凝剂是可行的，也是经济的。
关键词：
微生物絮凝剂培养条件啤酒废水
1.前言
1.1概论
随着我国社会工业化的发展，虽然带动了经济的发展，但是引起了各种棘手的环境问题。
特别突出的是，最近几年来水污染现象极为严重，已经严重危害人类健康及发展。
因此，污水处理受到了社会各界的高度关注。
由絮凝微生物生长过程中所产生的一种代谢产物，具有絮凝活性的高分子化合物，可以良好的沉淀、聚集污水中的金属离子、悬浮颗粒、以及色素等有机物质，效果佳、具有生物降解特性，于环境和人类无毒害作用，亦不会二次污染。
微生物絮凝剂是由微生物在生长过程中产生的一类具有絮凝活性的细胞代谢产物[1]。
主要化学成分为粘多糖、糖蛋白、蛋白质以及DNA等高分子化合物，具有安全无毒害、高效性、无二次污染、用途广泛、可生物降解等特点[2]。
目前微生物絮凝剂的研究以及应用依然处在实验室中研究阶段，用于实际工业的仍然是少数的，主要是因为用于生产微生物絮凝剂的培养基成本较高，难以大量培养。
培养基中主要成分是碳源、氮源和无机盐等，而实际生活和工业生产中所排放的各种污水废水中主要的污染成分就是各种营养物质，碳氮源含量丰富。
因此，可以利用污水作为基础培养基通过添加少量无机盐等来培养产絮凝剂微生物用以生产微生物絮凝剂，这样不仅能解决培养基成本过高问题，同时还能降低废水中的污染物，达到以废治废，废水资源化利用的双重目的[3][10]。
1.2微生物絮凝剂进展以及研究
1.2.1微生物絮凝剂的进展
美国科学家Butterfield在1935年从活性污泥中发现并筛选出来的菌胶团产生菌是最早发现的絮凝微生物[4]。
1976年，J.Naknmura等从酵母菌、细菌、放线菌等214株菌株中筛选出19种具有絮凝能力的菌株。
1997年suh.H-H等人发现了DP-152絮凝剂，这是首次发现杆状细菌也能产生絮凝剂[5-7]。
此后，英国、美国、德国、韩国、伊朗、日本、朝鲜等国的科学研究者对絮凝微生物以及絮凝剂投入了大量研究，并且已经取得了相应的成果。
我国对微生物絮凝剂的研究是从90年代才刚刚起步的，中科院成都研究所张本兰从活性污泥中筛选得到P.alcaligenes8724菌株能产絮凝剂；邓述波等人从土壤中分离筛选得到了硅酸盐芽孢杆菌的新变种，该菌可以产生絮凝剂MBFA9，这些絮凝剂在水处理中都有一定的作用[6-9]
微生物絮凝剂有着非常广泛的应用前景，微生物絮凝剂对混浊液絮凝效果好，作用迅速、用量也少，同时具有良好的去色效果。
但是微生物剂依然处于无法大批量生产的阶段。
所以降低微生物絮凝剂的生产成本，优化微生物絮凝剂产生菌的培养条件是工业化大量生产的关键点[11]。
1.2.2微生物絮凝剂的作用机理
微生物絮凝剂是生物大分子物质，其化学组成成分为多糖、糖蛋白、蛋白质、纤维素、DNA等能认为微生物絮凝剂絮凝的作用本质是有机高分子（例如：
多聚糖、蛋白质、纤维素）同目标物质之间发生相互作用[12]。
有关其作用机理前后提出过各种学说，例如：
“桥架作用”、“电性中和”及“化学反应”等作用机理[13]现在比较普遍的是“桥架作用”：
微生物絮凝剂有可以与胶粒表面某些部分起作用的化学基团，微生物絮凝剂和胶粒相接触的时候，基团能够和胶粒表面产生反应而相互吸附，而絮凝剂的其他部分就伸在溶液里，能够和另一有空位的表面胶粒吸附，这就是“桥架作用”。
2材料与方法
2.1菌种来源与活化
（1）实验用菌来源于实验室所储藏的六种絮凝剂菌种，分别为Y1、C2、A3、F4、M10、M15。
（2）配置好的活化培养基高温灭菌，然后在超净工作台里倒试管斜面，等培养基凝固后，用接种环把Y1、C2、A3、F4、M10、M15分别接两个试管斜面上，把试管放到电热恒温培养箱里37度培养一天后取出放到冰箱里保存备用。
2.2实验材料和器材
2.2.1实验材料
活化培养基（g/L）：
称量氯化钠5，牛肉膏3，琼脂18，蛋白胨10，并调pH7.0～7.2高温灭菌后实用。
斜面培养基：
与活化培养基一样。
摇瓶发酵培养基（g/L）：
葡萄糖20，磷酸氢二钾5，磷酸二氢钾2，氯化钠0.1，硫酸铵0.2，尿素0.5，酵母膏0.5，硫酸镁0.2，112度灭菌20min。
废水培养基：
取啤酒发酵后排酵母废水，稀释10倍，加入磷酸二氢钾（2g/L），葡萄糖（10g/l），尿素（1g/l）。
将上述培养基均调节pH至7.5～8.0，112℃、20min高压蒸汽灭菌。
2.2.2实验器材
三角瓶、烧杯、量筒、移液管、电子天平、培养皿、试管、涂布棒、接种环
紫外可见分光光度计（752N,上海佑科）、
高压蒸汽灭菌锅（LDZX-75KBS，上海申安）、
垂直净化工作台（SD-DJ，上海浦东伟普净化设备厂）、
电热恒温培养箱（DHP-9272，上海一恒科技有限公司）。
2.3絮凝率的测定方法
CaCl2溶液：
1g无水氯化钙，100mL蒸馏水。
高岭土溶液：
4g高岭土，1000mL蒸馏水。
测定每个样品时，分别取高岭土悬液、氯化钙水溶液各10ml、0.5ml，很合均匀，从中取9.8ml，再取0.2ml发酵液加入小烧杯中，对照不加发酵液。
用PH计在小烧杯中调节PH值到7.5-8.0，在此过程中充分混匀，倒入试管中。
静置半个小时，先用观测法观察其絮凝剂絮凝效果，再用滴管吸取上清液到比色皿中，在紫外分光光度计中550nm处测其吸光值，并计算絮凝率：
絮凝率公式如下：
絮凝率=[（A-B）/A]*100%
式中：
A为对照液上清液550nm处的吸光值；B为样品液上清液550nm处的吸光度。
2.4废水的优化处理条件选择
2.4.1废水预处理选择实验
把啤酒排酵母废水混匀，稀释10倍。
然后进行三组实验，分组六瓶（每瓶40ml废水）：
第一组对废水进行先过滤后灭菌的处理；
第二组进行先灭菌后过滤的处理；
第三组进行只灭菌不过滤的处理方法。
然后分别接种两菌种，在摇床上30摄氏度，180转每分钟，培养24小时，用高岭土悬液法测吸光值，并计算絮凝率。
2.4.2最佳碳源添加选择实验
取一定量废水摇匀，稀释10倍，调节pH为7.5-8.0。
然后分装到摇瓶里（每瓶40ml），然后分别添加0.4g的葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙醇、乳糖，再做一个不添加任何碳源做空白对照。
灭菌后在超净台里接种Y1菌。
在摇床上30摄氏度，180转每分钟，培养24小时，用高岭土悬液法测吸光值，并计算絮凝率
2.4.3最佳氮源添加选择实验
取一定量废水摇匀，稀释10倍，调节pH为7.5-8.0。
然后分装到摇瓶里（每瓶40ml），然后分别添加0.08g的尿素、硫酸铵、蛋白胨、酵母膏，再做一个不添加任何氮源做空白对照。
灭菌后在超净台里接种Y1菌。
在摇床上30摄氏度，180转每分钟，培养24小时，用高岭土悬液法测吸光值，并计算絮凝率。
2.4.4最佳无机盐添加选择实验
取一定量废水摇匀，稀释10倍，调节pH为7.5-8.0。
然后分装到摇瓶里（每瓶40ml），然后分别添加0.2g的NaCl、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、FeSO4、（NH4）2HPO4、KCl、（NH4）3PO4，再做一个不添加任何无机盐做空白对照。
灭菌后在超净台里接种Y1菌。
在摇床上30摄氏度，180转每分钟，培养24小时，用高岭土悬液法测吸光值，并计算絮凝率。
2.4.5最佳无机盐添加量实验
取一定量废水摇匀，稀释10倍，调节pH为7.5-8.0。
然后分装到摇瓶里（每瓶40ml），然后分别添加0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0的KH2PO4（g/l）灭菌后在超净台里接种Y1菌。
在摇床上30摄氏度，180转每分钟，培养24小时，用高岭土悬液法测吸光值，并计算絮凝率。
2.5发酵培养基对比实验
将六种菌种接种到配制好的发酵培养基与最佳啤酒废水培养基（每瓶40mL）中，在摇床上30摄氏度，180转每分钟，培养24小时，用高岭土悬液法测吸光值，并计算絮凝率，做对照实验。
3结果与分析
3.1废水预处理结果与分析
表1废水预处理实验结果
絮凝率%
Y1
C2
A3
F4
B10
B15
先过滤后灭菌
10.6
7.3
5.6
6.8
9.2
10.5
只灭菌不过滤
46.7
35.9
33.7
36.9
43.8
43.8
先灭菌后过滤
40.8
33.7
39.5
32.7
36.2
37.8
由以上结果可以看出对啤酒排酵母废水的处理先进行过滤再灭菌来培养六种产絮凝剂菌种，其结果都偏低。
而对啤酒排酵母废水进行先灭菌在过滤或者不过滤的处理方法则结果有了明显的提高，其原因推断为二：
（1）可能是由于废水中的固体杂质对pH具有一定的缓冲作用能够使产絮凝剂菌在生长时的培养条件处于良好；
（2）啤酒排酵母废水中含有大量的酵母菌，直接高温灭菌使得酵母菌死亡，而酵母菌的细胞膜破裂，细胞中的代谢产物、蛋白、生长因子等大量营养物质进入废水中，相当于在废水里添加了一定量的酵母膏。
本次实验可以说明对啤酒排酵母废水按照只灭菌的处理即可达到较好的预处理效果。
3.2废水最佳碳源添加选择实验结果
表2废水最佳碳源添加选择实验结果
碳源
葡萄糖
蔗糖
乙醇
淀粉
乳糖
原液
絮凝率%
47.8
19.6
5.3
7.6
18.1
22.5
实验结果可以看出，添加葡萄糖的废水培养基培养Y1菌种，其絮凝率对比原液有较大程度的提高，可以说明Y1菌种能够利用葡萄糖做碳源。
而添加二糖（蔗糖、乳糖）、醇类（乙醇）以及多糖（淀粉）对比原液空白，其结果显示添加蔗糖、乙醇、淀粉碳源来培养Y1菌，结果絮凝率偏低而且不如原液空白的絮凝率高。
所以可以说明在啤酒排酵母废水中添加葡萄糖为碳源较好。
这可能是因为在Y1菌的对数期能最有效利用的是葡萄糖，有助于菌体在对数期的时候大量产生代谢产物。
而添加二糖（蔗糖、乳糖）、醇类（乙醇）以及多糖（淀粉）使得絮凝率降低可能是添加物对絮凝作用或有抑制作用。
所以可以在啤酒排酵母废水中添加单糖（葡萄糖）来做为碳源添加。
3.3废水最佳氮源添加选择实验结果
表3废水最佳氮源添加选择的实验结果
尿素
硫酸铵
蛋白胨
酵母膏
原液
絮凝率%
50.7
40.6
23.3
29.2
22.5
由上表数据可见：
在添加尿素和硫酸铵的培养基中Y1菌株生长较好。
比较没有添加氮源的原液废水测的絮凝率，添加了尿素和硫酸铵的废水培养基的絮凝率提高了一倍左右；而添加酵母膏和蛋白胨为氮源的培养基中的菌株也能生长，但对比原液废水其絮凝率提高不是很明显，其原因可能是添加的酵母膏和蛋白胨是天然的氮源，天然氮源不利于菌株的快速吸收和利用，而絮凝剂的产生是在对数生长初期产生的初级代谢产物，所以产絮凝剂量低，而尿素和硫酸铵是合成氮源，能够为处于对数期的菌体提供快速吸收的氮源，尿素的含氮量更高一些，所以对比添加硫酸铵的废水培养基会絮凝率高一些。
对比说明，对于啤酒排酵母废水中，尿素是较好的氮源添加选择。
3.4最佳无机盐添加选择实验结果
结果如下表4
A
B
C
D
E
F
G
H
I
絮凝率
30.6
15.1
96.0
80.9
66.9
42.9
93.1
90.6
22.5
注：
表中无机盐A-I分别为NaCl、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、FeSO4、（NH4）2HPO4、（NH4）3PO4以及原液对照。
由上表数据分析可知：
添加磷酸盐类如KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2HPO4、（NH4）3PO4的废水培养基中Y1菌种生长相较其他添加盐类的废水培养基较好，可以使得絮凝率达到80%以上更高着达到96%效果显著。
磷元素是细胞膜中的磷脂以及细胞和中的核糖核酸的重要组成部分，有利于Y1菌在对数期快速大量增殖，促进产生初级代谢产物，另外。
而添加了NaCl、CaCl2、FeSO4盐的废水培养基其絮凝率相比与原液不加盐的废水培养基都有一定的提高，Na+、Ca+、Fe+可能对絮凝效果有一定的促进作用。
所以对于啤酒排酵母废水选择添加的盐应该是KH2PO4。
3.5最佳无机盐添加量实验结果
结果如下
0g/l
0.2g/l
0.5g/l
1.0g/l
1.5g/l
2.0g/l
3g/l
4g/l
絮凝率%
21.5
51.8
63.5
78.9
80.7
96.0
94.9
91.7
由上表数据分析得：
结果显示，在逐步增加添加磷酸二氢钾到废水培养基中的量时，其絮凝率也在逐步增加，在添加磷酸二氢钾量为2g/l的时候絮凝率达到最高值96%，随后继续增加磷酸二氢钾的量，絮凝率随之下降。
所以添加磷酸二氢钾的量为2g/l的时候絮凝率最高。
3.6发酵培养基对比实验结果
发酵培养基培养结果
Y1
C2
A3
F4
B10
B15
絮凝率%
81.3
77.2
78.9
70.0
77.6
73.5
废水培养基培养结果
Y1
C2
A3
F4
B10
B15
絮凝率%
91.34
88.40
82.72
79.67
81.42
80.74
结果分析：
由以上数据显示，Y1菌株无论是在发酵培养基还是优化过的废水培养基中都有较好的生长态势与产絮凝剂量。
通过对比发酵培养基和废水培养基的絮凝率数值，我们可以看出优化过的废水培养基的絮凝率略好于发酵培养基，可能是因为灭菌后的啤酒排酵母废水中有一些物质能够促进絮凝，这也说明了将啤酒排酵母废水进行简单优化后可以作为廉价的培养基来进行产絮凝剂菌的培养，达到了废水利用，以废治废的效果。
3.7实验结论
取自啤酒发酵排酵母阶段的废水来培养产絮凝剂Y1、C2、A3、F4、M10、M15六种菌种时，Y1菌种产絮凝剂量最好。
同时废水培养基的最佳优化条件为：
对废水进行灭菌即可，添加1g/l的尿素、2g/l的磷酸二氢钾，180rmp，pH为7.5-8.0，培养温度30℃，培养24h另外由于废水水体里还有较为丰富的营养物质所以本着降低成本的目的其实葡萄糖为碳源可以不用添加。
以上条件可以使Y1对高岭土悬液的絮凝率高达96%。
4.讨论
本实验的主要目的在于利用废水来培养产絮凝剂微生物并改变废水的一定条件使得絮凝剂的产量增加。
以废水培养基对Y1、C2、A3、F4、M10、M15这六个菌种进行了发酵培养，初步确定了Y1菌的产絮凝剂量高，进而对Y1菌进行了控制变量法实验以确定对废水培养基的最佳优化条件。
实验中以废水的预处理、添加碳氮源以及无机盐和添加无机盐的量为变量因素进行了实验，以寻求最佳废水优化处理条件。
首先对废水进行预处理方法的选择入手，因为废水中含有数量较多的酵母菌，而酵母菌的存在会对废水中的营养物质进行不断的消耗另外也会产生代谢产物从而影响到产絮凝剂菌的生长繁殖与代谢。
而考虑到实际生活当中处理大量废水过滤难度较大所以又采取了灭菌后过滤和不过率的实验。
而实验结果恰恰显示为灭菌后不过滤效果好。
但是实验设计还是有不足之处，例如在实际废水处理中难以实现高温灭菌（成本太高），又如在实际中处理废水的时候并不是在无菌条件下进行的等。
考虑到此，又设计了不灭菌的废水培养基培养菌种，但是结果很不理想（结果未曾在上文中列出），可能是菌体在不灭菌的废水中不能生长，也有可能是废水中的酵母菌产生的代谢产物影响了絮凝效果。
在对最佳碳源选择添加时，添加的葡萄糖的培养基培养24h后其结果较好。
可以说明产絮凝微生物能够利用葡萄糖做为碳源。
实验对比中还有二糖与多糖类碳源物质，虽然在24h后的结果对比葡萄糖并不好，但是推断如果在实验36h或者48h时效果会有所提高，因为后期二糖与多糖会被分解为单糖，依然能被菌种利用。
但是测定菌种最佳絮凝率时期为培养24h，虽然添加二糖与多糖能在后期被分解为单糖，但是絮凝率的提高是有限的，
由于实验条件有限，所以原培养基中氮源的成分不名。
故在添加外来氮源时选择了两类氮源，一是有机氮源也就是天然氮源，另一类是无机氮源。
其结果显示Y1产絮凝剂在添加无机氮源的废水培养基上测的絮凝率较好。
如果能降最佳碳源与最佳氮源组合在一起，进一步的进行对比实验，则能得到更加好的效果。
在对培养基的预处理与添加碳氮源的优化条件确定后，考虑到废水培养基中必要的营养物质以足但测的的絮凝率依然处于未达到预期值，所以分析可能缺少了必要的无机盐类物质。
在对添加最佳无机盐成分确定的实验中，先添加了NaCl、MgSO4、CaCl2、FeSO4，其结果显示添加磷酸二氢钾与磷酸氢二钾结果有了极为显著的提高。
当时推断为K+为关键元素，故又进行了添加KCl的对比实验（结果极差上文没有提及），其结果显示K+并非关键元素，又推断是P+，所以又对比了的实验其测的的絮凝率结果同样显著提高，说明磷元素是关键性的元素。
可能是啤酒排酵母废水中以为前期酵母的大量生长繁殖将水体中的磷元素大量消耗导致水体磷元素含量极低。
而KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2HPO4、（NH4）3PO4中对比可知磷酸二氢钾效果稍好一些，所以可以选择磷酸二氢钾作为无机盐的添加。
对与无机盐的添加量，由于到了实验后期，实验设计了一个简单的梯度实验结果粗糙但可得出结论：
在啤酒排酵母废水水体中添加磷酸二氢钾量为2g/l时效果最为显著。
在每个单项条件废水培养优化选择探究的时候，作为对比项的原液废水未添加任何外来物质，而且整体实验结果也没有综合起来与发酵培养基做对比，所以得到的结果好坏未知，所以有做了最后一项对比。
实验结果显示在优化后的啤酒排酵母废以足以代替发酵培养基，其效果甚至略好与发酵。
只是由于实验条件，不能分析为何优化后的废水培养基效果略好与发酵培养基，也是实验设计的不足之处。
本次实验还有很多的不足之处，例如实验初期在废水预处理选择时忘记调节pH而导致结果不理想，反复多次都没有注意到这个问题，后来经老师提醒才发现这个问题，实验才能继续进行下去；实验中前后原液培养细菌测得的絮凝率数据不同，其原因应该是同一批废水搁置时间过久导致水中营养物质有一定的消耗导致的，可以设计实验为取得废水先进行高温灭菌后再冷冻保存。
另外在实验中发现，絮凝率高的摇瓶里的发酵液颜色会相比其他摇瓶要浅一些，这说明实验中产生的絮凝剂具有一定的脱色能力。
由于时间紧迫所以没有对其脱色能力进行进一步的研究。
本次实验还可以用无机絮凝剂与优化后的废水培养出来的微生物絮凝剂做一个对比，也没有来得及做。
经过这次毕业论文实验我学习到了许多许多。
虽然实验结果显得粗糙，有偶然因素，也有实验设计的不足，还有必要专业知识把握不准导致，但是最终在老师的帮助下能够完成论文也是一种收获。
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The research about using waste-water to produce Microbial flocculant
Abstract :
Screening for 6 strains with high flocculating activity from the soil ，cultivate them with beer waste-water （to reduce costs） as cheap medium. Make experiments by changing the method of waste-water pretreatment and by adding carbon, nitrogen source andinorganic salts….to the waste-wat
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