茚三酮呈色反应实验报告.docx
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茚三酮呈色反应实验报告
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茚三酮呈色反应实验报告
篇一：
实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应
实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应
一、实验目的
1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法
二、实验内容
对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。
三、实验操作
（一）双缩脲反应
1、实验原理
当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。
由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。
此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。
2、试剂
（1）尿素
（2）10%naoh溶液
（3）1%cuso4溶液
（4）蛋白质溶液：
将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。
3、操作
（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。
待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。
然后加10%naoh溶液1ml和1%cuso42~3滴，混匀后观察颜色的变化。
（2）另取一试管，加蛋白质溶液1ml、10%naoh溶液2ml及1%cuso42~3滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。
（二）茚三酮反应
1、实验原理
除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有α-氨基酸与茚三酮发生反应生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。
1︰1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。
反应的适宜ph为5~7。
此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。
2、试剂
蛋白质溶液（同前）；0.5%甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液
3、操作
取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴加热2~3分钟，观察颜色变化。
（三）蛋白黄色反应
1、实验原理
蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这类蛋白质可被浓硝酸硝化生成黄色的硝基苯的衍生物。
该物质在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变
为橙黄色的硝醌酸钠。
绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应。
皮肤、毛发、指甲等遇浓hno3变黄即发生此类黄色反应结果。
2、试剂
（1）蛋白质溶液（同前）；
（2）头发；（3）指甲屑；（4）0.5%苯酚溶液；（5）0.3%酪氨酸溶液；（6）10%naoh溶液；（7）浓硝酸（ρ=1.42克/毫升）
3、操作
取5支试管编号后分别按下表-1所示加入试剂，观察各管出现的现象，若有反应慢者可放置微火（或水浴中）加热，待各管均先后出现黄色后，于室温逐滴加入10%naoh溶液直至碱性，观察颜色变化。
表1试验编号
注意：
向蛋白质溶液中加浓硝酸时，所出现的白色沉淀是强酸使蛋白质发生变性所致。
（四）乙醛酸反应
1、实验原理
含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸（chocooh）缩合，形成与靛蓝相似的物质。
此反应机理尚不清楚，可能是由一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合而成的。
含有色氨酸的蛋白质也有此反应。
2、试剂
（1）蛋白质溶液（同前）。
（2）0.03%色氨酸溶液。
（3）冰醋酸（一般含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。
（4）浓硫酸（分析纯）。
3、操作：
取2支试管，分别加入蛋白质溶液及色氨酸各2滴，再加浓冰醋酸约1~2毫升，混匀，倾斜试管慢慢地沿管各加浓硫酸1毫升，使之两相重叠，静置5分钟后则两相界面处出现紫红色环，若效果不明显可在水浴加热。
（五）偶氮反应
1、实验原理
偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质，酪氨酸和组氨酸与之反应则应产物分别为橙红色和樱红色。
含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。
应当指出，组胺、酪胺、肾上腺素和胆色素分子也能发生此反应而显色。
2、试剂：
（1）蛋白质溶液（同前）；
（2）0.3%组氨酸溶液；（3）0.3%酪氨酸溶液；（4）20%naoh溶液；（5）重氮试剂
溶液A：
5克亚硝酸钠溶于1000毫升水中。
溶液b：
溶解5克ɑ-氨基苯磺酸于1000毫升水中，溶解后再加入5毫升浓硫酸。
A、b液分别存在密闭瓶中，用时以等体积混合。
3、操作：
取3支试管分别加入0.3%组氨酸、酪氨酸、蛋白质溶液，各4~5滴，再分别加重氮试剂A、b各10滴，振摇，混匀，取后向3支试管分别加入20%naoh溶液2~3滴，观察各
试管中有色物质的生成，若水浴加热效果更明显。
（六）、醋酸铅反应
1、实验原理
多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下
可分解产生硫化钠。
硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。
2、试剂
（1）未稀释的鸡蛋清。
（2）10%的naoh溶液
（3）1.5%pb（Ac）2溶液（醋酸铅溶液）（4）浓盐酸
（5）醋酸铅试纸（将滤纸条浸入醋酸铅溶液中，湿透后取出，100℃烘干即可）
3、操作：
向试管中先加入1.5%pb（Ac）2溶液约1毫升，再慢慢滴加10%的naoh溶液，边加边振摇，直到产生的沉淀溶解为止。
此时再向试管内加蛋白质溶液5~6滴，混匀。
置酒精灯上加热1分钟，溶液变黑，小心加入浓盐酸约2毫升，黑色褪去，嗅其味，将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色的变化。
实验四蛋白质的沉淀反应
一、目的
1．熟悉蛋白质的沉淀反应。
2．进一步掌握蛋白质的有关性质。
二、原理
多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。
三、实验器材
1．试管1.5cm×15cm（×7）。
2．吸管5.0ml（×2）、2.0ml（×2）、1.0ml（×1）。
3．吸滤瓶500ml（×1）。
4．布氏漏斗。
四、实验试剂
1．蛋白质试液：
见实验二十三卵清蛋白液。
2．硫酸铵晶体：
如果晶体太大，最好研碎。
3．饱和硫酸铵溶液：
蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。
4．95%乙醇。
5．结晶氯化钠。
6．1%醋酸铅：
1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。
7．5%鞣酸溶液：
5g鞣酸溶于水并稀释至100ml。
8．1%硫酸铜溶液：
见实验二十三。
9．饱和苦味酸溶液。
10．1%醋酸溶液：
冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。
五、操作
A、蛋白质盐析作用
向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。
操作方法：
1．取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。
2．将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。
再加水稀释，观察沉淀是否溶解。
注意
（1）应该先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液。
（2）固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。
b、乙醇沉淀蛋白质
乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体的水化层而使其沉淀析出。
操作方法
取蛋白质溶液1ml，加晶体nacl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。
观察有无沉淀析出。
c、重金属盐析沉淀蛋白质
蛋白质与重金属离子（如cu、Ag、hg等）结合成不溶性盐类而沉淀。
2+
+
2+
操作方法
取试管2支各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内加1%cuso4
溶液，至有沉淀生成。
D、生物碱试剂沉淀蛋白质
植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。
能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。
生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。
操作方法
取试管2支各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4~5滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管内加苦味酸溶液数滴，观察结果。
篇二：
生物化学实验一蛋白质和氨基酸的呈色反应
实验一蛋白质和氨基酸的呈色反应
一、目的要求
验证蛋白质特性；学习和掌握蛋白质呈色反应的原理和方法；学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、实验原理
蛋白质中的某些化学键或氨基酸残基中的某些化学基团可以与某些特殊试剂形成特定的有色物质。
这些反应称为蛋白质的呈色反应。
各种蛋白质的氨基酸残基不完全相同。
因此，呈色反应产物的颜色也不完全一样。
呈色反应不是蛋白质所特有，一些非蛋白物质也能呈现类似的呈色反应。
因此，不能仅以呈色反应结果来判别被测物质是否为蛋白质。
三、呈色反应
双缩脲反应
1.原理
两分子尿素经加热至180°c后可以缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨。
双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成紫红色络合物，此反应称为双缩脲反应。
多肽及所有蛋白质均具有肽键，与双缩脲分子中亚酰胺键结构相同，也能发生此反应，因此，蛋白质在碱性溶液中与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的颜色反应。
2.器材与试剂
1）器材
试管、药匙、电炉、试管夹、滴管。
2）试剂
〈1〉蛋白质溶液（10%卵清蛋白溶液）：
吸取鸡蛋清溶液10ml，加蒸馏水稀释，定容至100ml。
〈2〉10%氢氧化钠溶液。
〈3〉1%硫酸铜（cuso4）溶液。
〈4〉0.1%甘氨酸（gly）溶液：
称0.1g甘氨酸溶于蒸馏水中，稀释至100ml。
〈5〉结晶尿素。
3.实验步骤
双缩脲反应实验
试管
试剂/滴1234
尿素＋
加热后的尿素＋
蛋白质溶液/滴3
0.1%gly/滴3
10%naoh/滴5555
1%cuso4/滴1111
显色现象
（1）制备双缩脲：
取结晶尿素少许（约火柴头大小），放入干燥的小试管中。
微火加热至尿素熔解至硬化，刚硬化时立即停止加热，尿素放出氨，此时双缩脲
即已形成。
冷却后作为双缩脲样品（1号管）。
（2）另取3支试管，与1号管一起按表加样，混匀，观察各管颜色变化，记
录结果并解释现象。
茚三酮反应
1.原理
蛋白质或氨基酸在弱碱性条件下，其上的氨基与茚三酮共热可产生蓝紫色缩
合物。
此反应为一切蛋白质和α-氨基酸所共有，具有亚氨基的脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生特征性的黄色化合物，含有氨基的其他化合物也能呈此反应。
2.器材与试剂
1）器材
滤纸、试管、试管夹、药匙、电炉、滴管、吸管、水浴锅。
2）试剂
〈1〉卵清蛋白溶液100ml：
与双缩脲反应相同。
〈2〉0.1%甘氨酸（gly）溶液。
〈3（:
茚三酮呈色反应实验报告）〉0.1%茚三酮水溶液。
〈4〉0.1%茚三酮-乙醇溶液：
0.1g茚三酮溶解于乙醇中并用乙醇定容至
100ml。
3.实验步骤与结果观察
（1）取两支试管，按表加样。
茚三酮反应实验
试剂/ml试管
1
1.02蛋白质溶液
0.1%gly1.0
0.1%茚三酮水溶液0.50.5
沸水浴中加热1-2min，观察颜色由粉色变成紫红色再变蓝现象
（2）另取一张滤纸，滴一滴0.1%gly溶液，风干后，在原处滴一滴0.1%茚三
酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
黄色反应
1.原理
在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）残基上的芳香
环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，后者在碱性条件下可转变为橘黄色的硝醌衍生物。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少许浓硫酸后才会有黄色反应。
2.器材与试剂
1）器材
同茚三酮反应
2）试剂
〈1〉卵清蛋白溶液100ml：
与双缩脲反应相同。
〈2〉10%氢氧化钠溶液。
〈3〉头发。
〈4〉指甲。
〈5〉0.5%苯酚溶液。
〈6〉浓硝酸。
〈7〉0.3%色氨酸（Trp）溶液。
〈8〉0.3%酪氨酸（Tyr）溶液。
3.实验步骤与结果观察
取6支试管，按表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢，可置
沸水浴加热5min。
蛋白质的黄色反应实验
123456
材料/滴蛋白质溶液指甲头发0.5%苯酚溶液0.3%色氨酸0.3%酪氨酸
4少许少许444
浓硝酸/滴24040444现象
待各管出现黄色后于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
实验结果：
双缩脲反应：
1号管紫红色，2号管浅紫色，3号管蓝紫色，4号管蓝紫色。
因为多肽及所有蛋白质分子均具有肽键，与双缩脲分子中亚酰胺键结构相同，也能发生此反应，因此，蛋白质在碱性溶液中与铜离子也能呈现出类似双缩脲的颜色反应。
试剂试管
茚三酮反应：
观察紫红色斑点
黄色反应：
1号、2号、3号、4号、5号、6号试管都出现黄色。
于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，1号、2号、4号、6号试管变为橘黄色。
3号、5号实验失败，没有出现橘黄色。
篇三：
蛋白质呈色反应实验原理
双缩脲反应
（一）、实验原理
尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。
含有一个肽键和一个—cs—nh2，—ch2—nh2，—cRh—nh2，—ch2—nh2—chnh2—ch2oh或—chohch2nh2等基团的物质以及乙二酰二胺（o＝c——c＝o）等物质也有此反应。
nh3也干扰此反应，因为nh-3与cu-2+可生成暗蓝色的络离子cu（nh3）42+。
因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
茚三酮反应
（一）、实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。
尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成co2、nh3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜ph为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同ph条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
黄色反应
（一）、实验原理
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
考马斯亮蓝反应
（一）、实验原理
考马斯亮蓝g250具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。
在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度A595nm值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
一）双缩脱反应：
1.原理：
尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
二）二）茚三酮反应
1.原理：
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
该反应十分灵敏，1：
1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成co2、nh3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。
反应机理如下：
此反应的适宜ph为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同ph条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
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