通用名称功能分类使用量和使用范围.docx
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通用名称功能分类使用量和使用范围
质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或者相关情况说明
（一）质量规格要求
乳铁蛋白的质量标准
1范围
本标准适用于食品添加剂乳铁蛋白。
2规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注明日期的文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
GB5009.3食品中水分的测定
GB5009.4食品中灰分的测定
GB5009.5食品中蛋白质的测定
GB5413.21婴幼儿食品和乳品中钙、铁、锌、钠、钾、镁、铜的测定
GB5009.12食品中铅的测定
GB4789.2食品微生物学检验菌落总数的测定
GB4789.3食品微生物学检验大肠菌群计数
GB4789.4食品微生物学检验沙门氏菌检验
GB4789.10食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验
3技术要求
3.1原料要求
3.1.1生乳：
应符合GB19301的规定
3.1.2乳和乳制品：
应符合GB19644的规定
3.1.3其他原料：
应符合相应的安全标准和/或有关规定
3.2感官要求：
应符合表1规定
表1感官要求
项目
要求
检验方法
色泽
具有均匀一致的橙红色泽
取适量式样置于50mL烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态，闻其气味，用温开水漱口，品尝滋味
滋味、气味
具有产品特有的滋味、气味、无异味
组织状态
干燥均匀的粉末状产品、无结块、无正常视力可见杂质
3.3主要成分指标：
应符合表2规定
表2主要成分指标
项目
指标
检验方法
蛋白质/（%）≥
93
GB5009.5
蛋白质中的乳铁蛋白/（%）≥
90
附录A
铁/（mg/kg）≤
350
GB5413.21
3.4理化指标：
应符合表3规定
表3理化指标
项目
指标
检验方法
水分/（%）≤
5
GB5009.3
灰分/（%）≤
1.5
GB5009.4
3.5污染物限量：
应符合表4的规定
表4污染物限量
项目
指标
检验方法
铅/（mg/kg）≤
0.2
GB5009.12（铅）
3.6微生物限量：
应符合表5规定
表5微生物限量
项目
采样方案及限量a（若非指定，均以CFU/g或CFU/ml表示）
检验方法
n
c
m
M
菌落总数
5
2
1000
10000
GB4789.2
大肠菌群
5
2
10
100
GB4789.3平板计数法
金黄色葡萄球菌
5
2
10
100
GB4789.10平板计数法
沙门氏菌
5
0
0/25g
_
GB4789.4
a样品的分析及处理按GB4789.1和GB4789.18执行。
4包装、标签、贮存
4.1包装
包装所用容器、包装材料采用符合卫生标准和卫生要求的原材料。
4.2标签
符合GB7718的规定
4.3贮存
室温阴凉干燥处密封保存。
不得露天存放，不得与有毒有害物质或其他杂物混存。
附录A
高效液相色谱法（HPLC）测定乳铁蛋白的纯度
1.范围
适用于高效液相色谱法检测乳铁蛋白的纯度。
2.原理
用高效液相色谱法（HPLC）测定原料乳铁蛋白中乳铁蛋白的纯度。
用纳米级纯水稀释样本，经聚乙烯苯-二乙烯基苯色谱柱分离，用20-90%乙腈进行线性梯度洗脱。
在214nm波长下，经二极管阵列检测。
3.试剂和仪器
1）.纳米级纯水：
所用水经纳米级纯水净化系统出处理（电阻率达18兆欧姆）
2）.纯化的乳铁蛋白，西格玛公司生产
3）.乙腈（CAN），色谱级或以上
4）.三氟乙酸（TFA），色谱级或以上
5）.一次性塑料或玻璃移液管
6）.硅烷化色谱瓶（安捷伦5183-4507号）
7）.ResourceRPC3-mL聚乙烯苯-二乙烯基苯色谱柱（通用电气医疗集团17-1182-01号）
8）.HP1100高效液相色谱系统（配二极管阵列检测器）
4.步骤
4.1标准样品的制备
准确称取13.2mg的乳铁蛋白标准品，定量转移到100mL的容量瓶中，用纳米级的纯水稀释后，用移液管吸取部分标准溶液到硅烷化的HPLC色谱瓶中。
4.2样本的制备
准确称取13.2mg的乳铁蛋白样品，定量转移到100mL的容量瓶中，用纳米级的纯水稀释后，用移液管吸取部分标准溶液到硅烷化的HPLC色谱瓶中。
4.3仪器设置
HP1100高效液相色谱仪
100L注射器
流速1mL/min
ResourceRPC3mL聚乙烯苯－二乙烯基苯色谱柱
二极管阵列检测器（214nm）
洗脱时间30分钟
流动相A-0.1%体积比的三氟乙酸水溶液
流动相B-0.09%体积比的三氟乙酸,90%体积比的乙腈水溶液
线性洗脱梯度
时间（分钟）
%流动相B
0
20
1
20
6
40
16
45
19
50
20
50
23
70
24
100
25
100
27
20
30
20
4.4分析
先注射3次标准样品溶液，接着再注射样本溶液，最后再注射3次标准样品溶液。
记录乳铁蛋白的峰面积值。
注射顺序如下:
第一次:
标准样品
第二次:
标准样品
第三次:
标准样品
第四次:
样本1
第五次:
样本2
第六次:
标准样品
第七次:
标准样品
第八次:
标准样品
5.计算
计算样本中乳铁蛋白的纯度:
乳铁蛋白的纯度%=
其中：
样本峰面积=样本中乳铁蛋白的峰面积
标准品峰面积=6次注射的乳铁蛋白标准品的峰面积的平均值
标准品的重量=乳铁蛋白标准品的重量（mg）
Pstd=乳铁蛋白标准品的纯度（%）
样本的重量=乳铁蛋白样本的重量（mg）
（二）乳铁蛋白标准的编制说明
一、标准起草的基本情况
乳铁蛋白目前尚无统一的国家标准和行业标准，根据《中华人民共和国食品安全法》及其实施条例、《中华人民共和国标准化法实施条例》的要求，制订乳铁蛋白的质量标准。
该质量标准规定了乳铁蛋白的技术要求、试验方法、检验规则、标签、包装和贮存等。
该标准适用于以牛乳及其制品为原料制成的乳铁蛋白。
二、标准的重要内容及主要制订情况
标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国家现行的乳制品标准协调一致，注重标准的可操作性，严格按照食品安全国家标准编写要求进行编写。
起草工作收集了国内相关的国家标准，同时也参考了欧盟的相关标准以及全球多家大型牛乳铁蛋白生产厂家提供的技术资料。
1.范围
本标准规定营养强化剂乳铁蛋白的质量规格要求、检验方法、标签、包装和贮存。
本标准适用于乳铁蛋白的生产、流通和监督管理。
2.规范性引用文件
对于产品的检验规则、判定规则有相应的法律、法规及标准规定的，本标准在该部分予以列出。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注明日期的文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3．技术要求
3.1原料要求：
乳铁蛋白生产所使用的原料应符合相应的国家标准、行业标准或有关规定。
3.2感官要求：
本要求参考GB11674《食品安全国家标准乳清粉和乳清蛋白粉》的规定，以及全球几大乳铁蛋白生产商提供的技术资料联合确定。
3.3主要成分指标：
包括蛋白质、蛋白质中乳铁蛋白以及铁的水平，主要参考EFSA对荷兰富仕兰乳品公司和日本Morinaga乳品公司申报的牛乳铁蛋白的科学意见以及全球几大乳铁蛋白生产商提供的技术资料确定上述各项指标的水平。
鉴于目前尚无乳铁蛋白检验方法的国家标准，参考欧洲食品安全局（EFSA）对牛乳铁蛋白的科学意见中提到的高效液相色谱法对本指标进行测定，该检测方法的验证已通过欧洲食品安全局的评估。
3.4理化指标：
包括水分和灰分，主要参考EFSA对荷兰富仕兰乳品公司和日本Morinaga乳品公司申报的牛乳铁蛋白的科学意见以及全球几大乳铁蛋白生产商提供的技术资料确定上述各项指标的水平。
3.5污染物：
本指标参考GB10765《食品安全国家标准婴儿配方粉》、欧盟委员会指令96/23污染物限量规定、EFSA对荷兰富仕兰乳品公司和日本Morinaga乳品公司申报的牛乳铁蛋白的科学意见以及全球几大乳铁蛋白生产商提供的技术资料，确定污染物铅的限量值。
3.6微生物限量：
确定了乳铁蛋白中菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的限量要求，采样方案以及限量参考GB10765《食品安全国家标准婴儿配方粉》的规定。
4包装、标签、贮存
4.1包装：
包装所用容器、包装材料采用符合卫生标准和卫生要求的原材料。
4.2标签：
应符合GB7718《食品安全国家标准预包装食品标签通则》的规定
4.3贮存：
室温阴凉干燥处密封保存。
不得露天存放，不得与有毒有害物质或其他杂物混存。
三、其他需要说明的情况无。
（三）与国际组织和其他国家（地区）相关标准的比较
荷兰富仕兰乳品工业有限公司和日本Morinaga乳品工业有限公司分别于2009年和2011年，向有关欧盟成员国提出申请，申请乳铁蛋白以新资源食品的身份在欧洲上市。
欧洲食品安全局（EFSA）对两个公司的申请分别进行了一系列评估，并于2012年发布了评估报告。
本申请中所制定的质量规格标准与EFSA报告中所给出的标准的比较见下表。
除上述的EFSA对荷兰富仕兰乳品公司和日本Morinaga乳品公司生产的乳铁蛋白所作出的评估外，目前国际上和其它发达国家尚没有对乳铁蛋白的质量规格标准作出要求。
与欧洲食品安全局对牛乳铁蛋白的科学意见中所提出标准的比较
项目
本标准
EFSA1
EFSA2
色泽
具有均匀一致的橙红色泽
—
粉色
滋味、气味
具有产品特有的滋味、气味、无异味
—
无异味
组织状态
干燥均匀的粉末状产品、无结块、无正常视力可见杂质
—
粉末状产品
蛋白质/（%）≥
93
93
94.5
蛋白质中的乳铁蛋白/（%）≥
90
95
96
铁/（mg/kg）≤
350
—
≤350
水分/（%）≤
5
4.5
4.2
灰分/（%）≤
1.5
1
1.3
铅/（mg/kg）≤
0.2
1（总重金属）
20（总重金属）
菌落总数（CFU/g或CFU/ml）
n
5
—
—
c
2
—
—
m
1000
—
—
M
10000
<1000CFU/g
<1000CFU/g
大肠菌群（CFU/g或CFU/ml）
n
5
—
—
c
2
—
—
m
10
—
—
M
100
<10CFU/g
<0/0.1g
金黄色葡萄球菌（CFU/g或CFU/ml）
n
5
—
—
c
2
—
—
m
10
—
M
100
不得检出/g
不得检出/0.01g
沙门氏菌（CFU/g或CFU/ml）
n
5
—
—
c
0
—
—
m
0/25g
—
—
M
—
0/10g
—
1EFSAPanelonDietteticProducts,NutritionandAllergies（NDA）;ScientificOpiniononbovinelactoferrin.EFSAJournal2012;10（5）2701
2EFSAPanelonDietteticProducts,NutritionandAllergies（NDA）;ScientificOpiniononbovinelactoferrin.EFSAJournal2012;10（7）2811
（四）生产使用工艺
1.乳铁蛋白的生产工艺
1.1生产工艺简介：
以脱脂牛乳为原料，主要工艺流程为：
将生乳加热至50°C，分离脱脂牛奶和奶酪，分离的脱脂乳72°C巴氏灭菌至少15秒，灭菌后进行微孔过滤以降低微生物和脂肪含量，接着采用离子交换法分离牛乳铁蛋白，再进行超/微孔过滤，最后用喷雾或冻干法干燥得到纯化的牛乳铁蛋白。
将相对较大的颗粒筛除后，即可将纯化的牛乳铁蛋白进行包装。
（见图1）
1.2原料控制
在欧盟，牛乳铁蛋白的生产厂家得到批准方可生产乳铁蛋白，其生产的乳铁蛋白要符合欧盟第853/2004管理条例对动物源性食品的有关卫生规定。
可食用的脱脂牛奶是生产牛乳铁蛋白的唯一原料，生产牛乳铁蛋白的原料需符合欧洲卫生管理法规。
牛乳铁蛋白的生产工艺属于乳品工业常用工艺，产品质量受认证程序（ISO9000:
2000和HACCP）监测。
图1乳铁蛋白的生产工艺流程图
2.牛乳铁蛋白强化婴幼儿配方奶粉的生产工艺
2.1生产工艺简介
对于牛乳铁蛋白强化的婴幼儿配方奶粉,它的基粉生产以及它的包装与目前生产的婴幼儿配方奶粉相同。
具体地来说,就是将水、蛋白质、碳水化合物、油脂（包括乳化剂、DHASCO®以及ARASCO®）、益生菌和矿物质在中和槽内混合，接着将该混合物经均质化并进行巴氏灭菌处理，然后将灭菌后的基粉与维生素预混料、铁粉、微量矿物质预混料、核苷酸预混料以及牛乳铁蛋白等成分混合，制成终产品。
最后对终产品进行包装。
（见图2）
2.2质量控制
美赞臣所有可用的质量控制与保证体系都将被用于牛乳铁蛋白强化的婴幼儿配方奶粉的生产与控制中。
美赞臣中国工厂的婴幼儿配方奶粉生产管理体系，与美国Zeeland和Evansville工厂采用的管理体系完全相同。
图2牛乳铁蛋白强化婴幼儿配方奶粉的生产工艺流程图
（五）婴幼儿配方粉中乳铁蛋白的检验方法或者相关情况说明
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定婴幼儿配方粉中乳铁蛋白的含量
1.范围
适用于婴幼儿配方粉中乳铁蛋白含量的测定。
检出限为0.05g/L.
2.原理
用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定乳铁蛋白强化婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白的含量。
用EDTA钙螯合溶液稀释样本，以释放酪蛋白微胶粒内捕获的所有乳铁蛋白，然后加标制备三点标准加入曲线。
经离心、过滤后收集乳清蛋白部分进行分析。
乳清蛋白经聚乙烯苯-二乙烯基苯色谱柱分离，用20-90%乙腈进行线性梯度洗脱。
在214nm波长下，经二极管阵列检测。
3.试剂和仪器
1）.纳米级纯水：
所用水经纳米级纯水净化系统出处理（电阻率达18兆欧姆）
2）.乙二胺四乙酸二钠盐二水化合物，试剂级或以上
3）.纯化乳铁蛋白，西格玛公司生产，由牛乳或牛初乳，或与前述西格玛标准比较后得到的高纯度原料纯化得到
4）.乙腈（CAN），色谱级或以上
5）.三氟乙酸（TFA），色谱级或以上
6）.全能台式高速冷冻离心机，具有固定角度的离心机转盘（3335号）
7）.玻璃离心管
8）.一次性塑料或玻璃移液管
9）.直径25毫米，带有0.45微米滤孔的PALLGHP注射式过滤器
10）.带有扣压式聚四氟乙烯盖帽的硅烷化色谱瓶（安捷伦5183-4507号）
11）.ResourceRPC3-mL聚乙烯苯-二乙烯基苯色谱柱（通用电气医疗集团17-1182-01号）
12）.安捷伦1100高效液相色谱系统（配二极管阵列检测器）
13）.配备吸头的BioHit0.5-5.0毫升电子移液管
使用上述仪器或类似器材。
4.步骤
4.1250mMEDTA溶液的配制
称取186.12克EDTA，定量转移于2升容量瓶内。
加入纳米级纯水至容量瓶的瓶颈处。
将磁力搅拌棒置于容量瓶内，在电磁搅拌器或电热板上缓缓加热并搅拌，直至EDTA溶解（注意：
EDTA的溶解可能需要一个小时或更久）。
待EDTA溶液冷却至室温后，取出搅拌棒，用纯水定容、混匀。
4.2加标溶液的配制
称取约31.2毫克纯化的乳铁蛋白，定量转移至50毫升容量瓶内。
加入250mMEDTA溶液溶解乳铁蛋白（溶解过程可能需要一个小时），最后用250mMEDTA定容至50毫升。
4.3样本的制备
1）.称取约10克婴幼儿配方乳粉，定量转移至100毫升容量瓶内。
加入足量的250mMEDTA溶液使其液面刚好达瓶颈处。
放入一只小型搅拌棒，搅拌一个小时后，取出搅拌棒（将粘附其上的残渣洗入容量瓶内），再用250mMEDTA定容。
（注意：
稀释前往容量瓶内滴1滴1-辛醇，防止产生泡沫）
2）.用移液管分别移取8.0mL样本溶液至3个25mL容量瓶内。
将容量瓶贴上标签1、2、3。
按照下表，用移液管分别向每只容量瓶加入相应量的加标溶液：
容量瓶编号
加入的加标溶液量（mL）
1
0
2
1.0
3
2.0
用250mMEDTA溶液定容
3）.4℃、10,000xg离心10毫升样本溶液15分钟。
4）.用玻璃或塑料移液管吸取乳清蛋白（液体），小心操作，以免搅动顶部的脂肪层或底部的酪蛋白颗粒（注意：
根据产品配方，样本中可能没有脂肪层和/或酪蛋白颗粒）。
以0.45微米滤孔的PallGHP注射式过滤器过滤乳清蛋白，弃去最初1mL滤液。
5）.收集过滤后的滤液于硅烷化HPLC瓶内。
4.4流动相的制备
1）.流动相A（0.1%体积比的三氟乙酸水溶液）-将1mL三氟乙酸加入999mL纳米级纯水中制成1L流动相A
2）.流动相B（0.09%体积比的三氟乙酸,90%体积比的乙腈水溶液）-将900微升的三氟乙酸、900毫升的乙腈溶液和99.1毫升的纳米级纯水混合，制成1L流动相B。
4.5仪器设置
HP1100高效液相色谱仪或类似设备
100微升注射器
流速1毫升/分钟
ResourceRPC3mL聚乙烯苯－二乙烯基苯色谱柱（通用电气医疗集团）
二极管阵列检测器（214nm）
柱温为室温
洗脱时间30分钟
线性洗脱梯度
时间（分钟）
%流动相B
0
20
1
20
6
40
16
45
19
50
20
50
23
70
24
100
25
100
27
20
30
20
4.6分析
用20%的流动相Ｂ平衡色谱柱至少20分钟。
注射两次空白样本250mMEDTA。
每个样本注射一次，各样本间用空白样本清洗。
记录LF的峰面积。
5.计算
1）.计算每个样本中加入的乳铁蛋白浓度：
容量瓶1：
[乳铁蛋白]＝0g/mL
容量瓶2：
[乳铁蛋白]＝
容量瓶3：
[乳铁蛋白]＝
其中：
mg乳铁蛋白＝用于制备加标溶液的标准原料乳铁蛋白的量
P乳铁蛋白 =标准原料乳铁蛋白的纯度（以分数表示）
2）.以加标浓度值和乳铁蛋白峰面积绘制线性回归曲线
计算下列参数：
相关系数，斜率和截距
3）.计算样本中乳铁蛋白的含量：
a）.样本溶液中乳铁蛋白的含量（μg/mL）=截距／斜率
b）.每1升冲调婴幼儿配方乳中乳铁蛋白的量（克）＝
乳铁蛋白的浓
其中：
134g＝冲调1Ｌ配方乳所需配方粉的量
c）.每100克婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白的含量（毫克）＝
乳铁蛋白浓度
6.分析注意事项
无
7.标准图谱
乳铁蛋白
乳铁蛋白标准图谱
（六）婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白反相高效液相色谱测定方法的验证验证报告
2011年8月2日修订
美赞臣内部研究
报告
1.背景
美赞臣营养品公司于2010年开发出一种可定量检测婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白含量的方法，并对其进行验证。
希望在美赞臣全球的质量管理体系下，该方法都是稳定、准确且易于操作的。
该方法是通过对D.FElgaretal[1]和K.P.Palmano,D.F.Elgar[2]所发表“反相高效液相色谱法测定乳清蛋白含量（包括乳铁蛋白）”的改编得到。
2.验证方案
在验证试验开始之前，先根据分析学中的SOPGRD1.AS.SOP.1.03方法验证程序指南制定验证方案。
该方案（见附件1）指导以下方法性能的测试：
适用范围、特异性、线性范围、仪器精密度、方法精密度、测定范围、重现性以及准确度。
3.方法与材料
3.1试剂
试剂级二水乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）和1-辛醇，购自Sigma-Aldrich公司；HPLC级的乙腈和三氟乙酸，购自EMD公司；水，经实验室内部纳米级纯水制备系统（Barnstead公司生产）处理。
3.2标准与样本
纯化的乳铁蛋白原料（批号10496133），由DMV公司提供。
源自牛初乳的乳铁蛋白标准品，由Sigma-Aldrich公司提供。
美赞臣公司的多种婴幼儿配方产品包括:
安婴儿优生营养品，批号QAC36;泰国安儿宝A+Plain,批号QKS31A12;安婴儿优生即食型配方奶，批号8MJS020;泰国LIPIL安儿宝（含85mg乳铁蛋白/100g）;0.6g乳铁蛋白/LEW2的基粉021010-A（不含乳铁蛋白）;1.0g乳铁蛋白/LEW2的基粉021010-B（不含乳铁蛋白）;安婴儿优生乳铁蛋白强化（1.0克/升）临床产品3380-729。
3.3样本制备与色谱分析系统
用250毫摩尔的EDTA溶液对样本进行稀释并搅拌1小时后，再用250mMEDTA溶液对样本进一步稀释，加入DMV的乳铁蛋白标准溶液，制作三点标准加入工作曲线。
用SorvallBiofugeStratos离心机分离样本中的乳清蛋白、酪蛋白和脂肪。
用口径为25毫米、滤孔为0.45微米的PALLGHP注射器式过滤器过滤乳清蛋白，收于硅烷化色谱瓶内，待分析。
采用HP1100高效液相色谱仪进行反相高效液相色谱法分析，色谱柱采用ResourceRPC1-mL装填聚苯乙烯-二乙烯基苯柱（通用电气医疗集团生产），20-90%乙腈进行线性梯度洗脱，214nm波长下检测。
样本的制备和确切的分析条件请见附件2-3。
4.验证结果
4.1范围
适用于反相高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶（粉）中乳铁蛋白的含量。
4.2特异性
在本色谱条件下，证明配方产品中的其他成分不会干扰乳铁蛋白的含量分析是必要。
产品中除乳铁蛋白外的其他所有成分（矿物质、维生素、蛋白质、脂肪等）都要准备用于方法的特异性分析。
虽然美赞臣的安儿宝产品在全球有多种配方，但是鉴于泰国市场的配方中酪蛋白（酪蛋白是配方粉中最有可能和乳铁蛋白的洗脱时间相同的成分，因此会干扰乳铁蛋白的峰面积值）的含量最高，所以本验证过程选用该配方产品。
下面的样本根据他们各自相应的检测方法制备（见附件2-3），以观察其对乳铁蛋白的色谱峰是否具有明显的干扰作用：
空白样本–250mMEDTA溶液、安婴儿优生配方粉批号QAC36、安婴儿优生即食型配方奶，批号8MJS020、泰国安儿宝A+Plain批号QKS31A12。
空白样本中未见有干扰峰，而每一个产品样本中，都发现紧挨乳铁蛋白峰之后有一小的洗脱峰。
根据发表的研究报告[1、2],该峰为牛血清白蛋白（BSA）。
虽然BSA色谱峰阻碍乳铁蛋白色谱峰尾到达基线处,但仔细计算峰值面积可以消除BSA的明显干扰。
在方法的研发过程中，未能成功解决BSA的色谱峰和乳铁蛋白色谱峰在基线处的分离问题。
样
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