酵母单杂交实验步骤总结.docx

酵母单杂交实验步骤总结.docx

《酵母单杂交实验步骤总结.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酵母单杂交实验步骤总结.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酵母单杂交实验步骤总结

1pBait-AbAi载体的构建〔酵母报道子的构建〕

注：

酵母报道子〔pBait-AbAi〕包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。

大量研究说明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。

首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。

（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端〔建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性〕。

（2）用TEbuffer溶解寡核苷酸至终浓度100μmol/L。

（3）将正向链和反向链按照1:

1的比例混合〔退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50μmol/L〕。

（4）95︒C保温30s，去除二级构造。

（5）72︒C保温2min，37︒C保温2min，25︒C保温2min。

注：

缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。

（6）冰上放置。

退火后的产物可贮存在-20︒C冰箱备用。

（7）酶切1μLpAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。

注：

回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。

（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5μmol/L。

（9）在连接反响管中参加如下成分：

pAbAi载体〔50ng/μL〕1.0μL

annealedoligonucleotide〔0.5μmol/L〕1.0μL

10×T4DNAligasebuffer1.5μL

BSA〔10mg/mL〕0.5μL

Nuclease-freeH2O10.5μL

T4DNAligase〔400U/μL〕0.5μL

总体积15μL

注：

如果有必要，可用1μLnuclease-freeH2O代替寡核苷酸作为阴性对照。

（10）将反响体系室温放置连接3h，转化Ecoli，采用常规方法检测阳性克隆。

注：

可用酶切或测序进展检测。

2质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株〔图〕

图3Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图

（1）用BstBI或者BbsI酶切2μLpBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。

（2）按MatchmakerYeastTransformationSystem2的步骤用1μl酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。

（3）稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。

3d后挑取5个单克隆，用MatchmakerInsertCheckPCRMix1进展PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。

（4）在PCR管中加25μlPCR-gradeH2O。

（5）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。

将枪头伸进PCR-gradeH2O中搅拌，使酵母细胞散开。

注：

切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反响的进展。

如果参加细胞后水变浑浊，证明参加了过多的酵母细胞。

（6）向每个管中参加25μlMatchmakerInsertCheckPCRMix，混匀，离心。

每个PCR管中现已含有如下反响物：

MatchmakerInsertCheckPCRMix25μl

H2O/yeast25μl

总体积50μl

（7）按下述程序进展PCR反响；

95︒C1min

98︒C10s

55︒C30s30cycles

68︒C2min

（8）取5μlPCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。

注：

引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4kb。

图4PCR检测pBait-AbAi的插入情况

正确的PCR检测结果应是：

阳性对照：

1.4kb

阴性对照：

无条带

诱饵菌株：

1.35kb+insertsize

（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura平板上划线培养。

30︒C孵育3d后，将平板置于4︒C保存，即为新构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。

（10）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用1mL预冷培养基〔100ml灭菌的YPDA与50ml灭菌的75%甘油混合〕重悬菌体，速冻后与-70︒C保存。

3检测诱饵菌株AbAr基因的表达

在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不一样。

例如：

p53-AbAi对照的最低aureobasidinA抑制浓度为100ng/ml。

注：

酵母单杂交实验成功的前提是没有源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。

因此在进展文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbAr基因的表达情况十分重要。

所以需要进展实验以确定进展文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。

（1）分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9%NaCl重悬细胞，调节A600到0.002〔大约2000个细胞/100μl〕。

（2）在下述培养基上分别涂布100μl重悬后的菌液，30︒C培养2-3d。

SD/-Ura

SD/-UrawithAbA〔100ng/mL〕

SD/-UrawithAbA〔150ng/mL〕

SD/-UrawithAbA〔200ng/mL〕

预期结果如下所示：

表1AbAr基因预期本底表达结果

[AbA]/〔ng/mL〕

Y1HGold[p53-AbAi]克隆数

Y1HGold[pBait-AbAi]克隆数

0

约2000

约2000

100

0

Baitdependent

150

0

Baitdependent

200

0

Baitdependent

（3）在进展文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度〔高约50-100ng/mL〕，以彻底抑制诱饵菌株的生长。

注：

如果200ng/mLAbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000ng/mL。

然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000ng/mL的AbA浓度仍无法抑制AbAr基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的源调控因子，因而该目的序列无法用来进展酵母单杂交筛选。

4文库cDNA的合成

提取试材总RNA，进展反转录合成cDNA。

合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec一样的酶切位点。

（1）cDNA第一链的合成

准备高质量的polyA和/或总RNA，用humanplacentapolyA+RNA作为阳性对照。

注：

RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。

在微量离心管中参加如下反响物：

RNA模板〔0.025-1.0μgpolyA和/或0.10-2.0μg总RNA〕1-2μl

CDSIII〔oligo-dT〕orCDSIII/6〔random〕引物1.0μl

DeionizedH2O〔使总体积到达4.0μl〕1-2μl

总体积4.0μl

在另外一支管中参加对照cDNA反响物，即RNA使用1μl〔1μg〕controlpolyA+RNA。

72︒C孵育2min。

冰上放置2min，轻轻混匀，立即参加步骤

中的试剂。

每一个反响参加如下试剂，轻轻混匀离心。

5×first-strandbuffer2.0μl

DTT〔100mmol/L〕1.0μl

dNTPmixture〔10mmol/L〕1.0μl

SMARTM-MLVRT1.0μl

总体积5.0μl

注：

步骤

中的试剂可在步骤

之前加好置于冰上。

此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2min。

如果用的是CDSIII/6随机引物，25-30︒C保温10min。

如果用的是CDSIII引物，省略此步，进展步骤

。

42︒C保温10min。

参加1μlSMARTIIIoligo，充分混合，42︒C保温1h。

75︒C保温10min终止第一链的合成。

降至室温，参加1μlRNaseH〔2U〕。

1137︒C保温20min。

12cDNA第一链合成产物应于-20︒C保存，可用3个月。

〔2〕longdistancePCR〔LD-PCR〕合成cDNA第二链

根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进展LD-PCR时最正确的热循环数。

使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。

表2RNA量与最正确热循环数

总RNA/μg

PolyA+RNA/μg

循环数

1.0-2.0

0.5-1.0

15-20

0.5-1.0

0.25-0.5

20-22

0.25-0.5

0.125-0.25

22-24

0.05-0.25

0.025-0.125

24-26

LD-PCR反响混合物中参加如下物质〔每个样品做2个100μl体系，对照做1个100μl体系〕：

First-strandcDNA〔fromprotocolA〕2μl

DeionizedH2O70μl

10×advantage2PCRbuffer10μl

50×dNTPmix2μl

5’RACE引物2μl

3’RACE引物2μl

Meltingsolution10μl

50×advantage2polymerasemix2μl

总体积100μl

按照以下程序进展PCR反响：

1个循环95︒C30s

X个循环95︒C10s

68︒C6min

1个循环68︒C5min

取7μlPCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1kbDNAladder。

（2）使用CHROMASPIN+TE-400柱纯化dscDNA

为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMASPIN+TE-400柱。

将纯化柱翻转几次，充分悬浮gelmatrix。

移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2ml收集管中。

将柱放入离心机，700g离心5min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。

将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gelmatrix的中央，切勿使样品沿柱的壁流下。

注：

加到边上易使样品沿柱壁流下，易混有小片段cDNA。

700g离心5min，纯化的cDNA收集到管中。

将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。

参加1/10体积3mol/L醋酸钠〔pH5.3〕，混匀。

参加2.5倍体积无水乙醇。

-20︒C冰冻1h。

室温，14000r/min离心20min。

小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。

14000r/min瞬时离心，去除残留上清液。

沉淀于空气中枯燥10min。

注：

一般枯燥至无乙醇味，不可过度枯燥，否那么很难溶解。

用20μl灭菌去离子水溶解沉淀，此cDNA可用来进展同源重组构建文库。

纯化后的cDNA用1%的琼脂糖电泳检测。

5构建并筛选酵母单杂交文库〔cDNA融合表达文库的构建及筛选〕

（1）构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。

注：

AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。

（2）按SMARTtechnology步骤合成dscDNA，其浓度为2-5μg/20μL。

（3）用YeastTransformationSystem2的方法转化酵母，在转化体系中参加如下物质：

cDNA文库转化Y1HGold[Bait/AbAi]菌株

20μlSMART-amplifieddscDNA〔2-5μg〕

6μlpGADT7-Rec，〔SmaI-linearized〕〔3μg〕

Y1HGold[53/AbAi]的转化

5μlp53fragment〔125μg〕

2μlpGADT7-Rec，〔SmaI-linearized〕〔1μg〕

将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100μl涂100mm平板。

文库转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照p53转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。

（4）将剩余的所有文库转化混合物〔约15ml〕涂在150mmSD/-Leu/AbA平板上，每板涂150μl。

（5）倒置培养3-5d。

（6）3-5d后，通过统计SD/-Leu100mm平板上的克隆数目来计算筛选的克隆数。

注：

所筛选的克隆数至少应该到达1百万，否那么会降低筛选到目的产物的可能性。

筛选的克隆数=[cfu/mlonSD/-Leu]×[dilutionfactor]×[resuspensionvolume〔15ml〕]

例如：

resuspensionvolume=15ml

Platingvolume=100μl

250coloniesgrewonthe1/100dilutiononSD/-Leuplates

Thenumberofclonesscreened=250cfu/0.1ml×100×15ml=3.75million

（7）预期结果

阳性对照试验：

SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。

文库筛选试验：

根据SD/-Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于1百万且SD/-Leu/AbA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数目取决于诱饵序列。

6阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的别离

（1）阳性克隆重新划线培养，进展表型确认

将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。

2-4d后，选择能够正常生长的克隆进展后续分析。

（2）酵母克隆PCR消除重复克隆

用MatchmakerInsertCheckPCRMix2〔Cat.No.630497〕进展PCR，对插入到pGADT7载体中的cDNA片段进展扩增。

PCR管中参加以下反响物：

MatchmakerInsertCheckPCRMix25μl

H2O/Yeast25μl

总体积50μl

按下述程序进展PCR反响：

94︒C1min

98︒C10s

68︒C3min

PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进展电泳分析。

产物不是单一的条带很正常，这说明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体

注：

为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用AluI或HaeIII或者其它常用的限制性切酶消化PCR产物，产物用2%的琼脂糖凝胶进展电泳分析。

如果大量的克隆含有同一插入片段，那么另取50个克隆进展PCR分析。

为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。

（3）阳性cDNA质粒的别离获取

酵母中文库质粒的分开。

与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着阳性克隆里不只含有能激活AbAr报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表达相互作用蛋白的cDNA质粒。

如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。

为了增加获取阳性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重复涂布2-3次，每次都挑取单一的克隆进展下一步涂布。

从酵母中获取阳性cDNA质粒

为了鉴定阳性互作相关的基因，用EasyYeastPlasmidIsolationKit〔Cat.No.630467〕从酵母中获取阳性质粒。

转化Ecoli并别离阳性cDNA质粒

用常用的克隆菌株对阳性cDNA质粒进展克隆，用LB加100g/mlampicillin进展选择。

（4）鉴别阳性和假阳性互作

酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性

阳性：

正确的诱饵序列和捕获物都是激活AbAr报告基因所必需的。

假阳性：

在诱饵序列突变的情况下，诱饵仍可以激活AbAr报告基因。

用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进展确认：

用YeastmakerTransformationSystem2的试剂和small-scale转化程序将100ng获取的捕获质粒转化到Y1HGold[Bait/AbAi]和Y1HGold[Mutant/AbAi]菌株中。

注：

阳性对照和阴性对照实验应该一起进展。

在SD/-Leu和SD/-Leu/AbA培养基上涂100μl转化混合物1/10和1/100的稀释物。

30︒C恒温培养3-5d后，预期结果如表所示。

表3阳性和假阳性相互作用验证结果

A阳性

样品

选择培养基

2mm清晰的克隆

酵母菌

SD/-Leu

有

Y1HGold[诱饵/AbAi]+靶

SD/-Leu/AbA

有

酵母菌

SD/-Leu

有

Y1HGold[突变/AbAi]+靶

SD/-Leu/AbA

无〔或者很小〕

B假阳性

样品

选择培养基

2mm清晰的克隆

酵母菌

SD/-Leu

有

Y1HGold[诱饵/AbAi]+靶

SD/-Leu/AbA

有

酵母菌

SD/-Leu

有

Y1HGold[突变/AbAi]+靶

SD/-Leu/AbA

有

（5）阳性克隆的测序分析

一旦相互作用被验证为阳性，就可以测序鉴定捕获载体的插入cDNA片段，验证与GAL4AD序列融合的开放阅读框〔ORF〕序列，并与GenBank、EMBL或其他数据库中的序列进展比拟。