银杏叶提取.docx
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银杏叶提取
本科生学士学位论文
题目:
银杏叶有效成分纯化工艺
姓名:
刘华侨070804113
学院:
理学院
专业:
高分子材料与工程
指导教师:
徐莉职称:
教授
2011年5月21日
摘要
银杏是我国的特有树种。
银杏叶的药用价值很高,其中含有的总黄酮包括：
银杏双黄酮、黄酮甙元、槲皮素、山奈黄素和异鼠李黄素等多种成分。
银杏双黄酮能降低血清胆甾醇，对高血压患者有降压作用，可用于治疗冠心病、心绞痛和脑血管疾患等多种疾病；黄酮甙元有降低血液胆固醇的作用。
从银杏叶中提取的槲皮素、山奈黄素、异鼠李黄素的混合物，具有扩张血管及解除痉挛的作用，对冠心病、心绞痛等也有疗效；银杏叶中还含有银杏内脂A、B、C、M等成分，可用于治疗脑病、脊髓病和脑水肿性的神经障碍等疾病，并能改善多种休克病人的症状。
目前，国内外均已生产出多种银杏叶制剂，广泛用于心脑血管疾病的治疗。
但据了解，目前市场上所见的银杏叶制剂大多有效成分含量偏低，疗效不显著，使患者服用量大，服用次数多、不方便，而且费用偏高。
银杏叶制剂的有效成分主要是银杏叶黄酮和内脂，其提取较困难，国内外使用最广泛的提取方法是树脂吸附纯化法，该法的提取率最高只能得到银杏叶含黄酮苷的27.4％和银杏叶总内酯10.6％。
本次毕业设计，我们尝试用大孔树脂吸附分离的方法，寻找一种简单的分离方法，从而纯化银杏叶提取物，然后用高效液相色谱表征用以讨论我们实验结果。
第一节标准曲线的测定
在高效液相色谱中，每种物质都有其特定的出峰时间，而其峰面积则对应着注射的液体中提取物的含量，所以只要我们用以单一的标准样品进行高效液相的测定，所得的出峰时间和峰面积，就可以直接用于我们以后提取物得标定和对比。
材料和方法
高效液相色谱仪；标准样品的：
槲皮素，异鼠李素，山奈酸素。
甲醇，色谱级磷酸，去离子水溶剂
黄酮含量测定
1色谱条件色谱柱：
高效液相色谱Cl8柱，流动相：
10mmol/L磷酸盐缓冲液（PH2.5）一甲醇（50：
50），流速：
1.0ml/min，紫外检测波长：
360nm。
用外标法定量，进样量10ul。
2．对照品溶液的制备：
精密称取槲皮素,山柰素和异鼠李素适量,分别加甲醇溶解,配成100ug/ml的对照品贮备溶液。
依次用HPLC流动相稀释成含槲皮素、山奈酸素，异鼠李素0.25-0.5-1-2-4-6-8~ug/ml的系列对照品溶液。
3．供试品溶液的制备：
准确称取银杏提取物20mg，置于l5ml硬质玻璃螺El试管，加甲醇一4mol/L盐酸（7：
3）水解液10ml，加盖，放人80~C恒温水浴槽内，水解lh。
吸取100lxl该液体,用60％甲醇定容至5ml棕色容量瓶中，作为供试液。
黄酮含量标准曲线
1.线性关系：
取黄酮系列对照品溶液，按色谱条件进行测定，以峰面积mAU对进样量（ug）进行回归，得出回归曲线。
2.异鼠李素：
准确配置标准样品，分别配成8—6—4—2—1ug/ml的溶剂，用滤膜过滤后等待做液相。
每一组浓度的样品分别做3组平行样，然后取其平均值，对应出峰面积，下面是我们本次异鼠李素的实验数据：
含量ug/ml
出峰时间min
面积Mau
8
21.85
400
23.864
414
21.368
457
22.36066667
423.66667
6
29
312
25
378
28.646
385
27.54866667
358.33333
4
31.331
273
23.449
234
30.386
225
28.38866667
244
2
16.67
116
20.204
116
23
123
19.958
118.33333
含量ug/ml
面积Mau
8
423
6
358
4
244
2
118
统计总结的含量和面积如下
得出的标准曲线如下
异鼠李素的实验标定讨论：
在1ug/ml0.5ug/ml0.25ug/ml中我们虽然可以看到明显的出峰，但是含量太低
异鼠李素的保留时间：
24.295Min
含量ug/ml
出峰时间min
8
22.3
6
27.5
4
28.38
2
19
24.295
从出峰时间上，我们可以看出虽然同一种样品，同样的环境，但是出峰时间存在较为明显的差别，分析原因：
（1）可能由于我们的仪器没有恒温箱，受到外界温度变化的影响较大
（2）每次跑完仪器内都残存有一定量的物质，连续进样会导致下一次出峰时间的变化
3山奈酸素：
同样配置好不同浓度的标准样品，8.0—6.0—4.0—2.0—1.0—0.5ug/ml的溶液，用滤膜处理放等待进样，每一组浓度的样品连续做三组平行样，然后得到的数据求其平均值，得到回归线和出峰时间。
山奈酸素的数据统计
含量ug/ml
出峰时间min
面积Mau
8
18.276
744.27
16.82
827.81
24.52
756.86
6
16.03
547.15
21.21
458.56
17.32
529.27
4
16.16
442.83
17.03
382.11
17.5
413.52
2
16.21
174.68
21.48
181.387
17.34
190.63
1
15.397
96.31
15.7
88.38
16.12
90.23
0.5
nopeakfound
统计总计的含量和面积平均值如下
含量ug/ml
面积Mau
8
776.3
6
511.6
4
412.8
2
182.2
1
91.6
含量ug/ml
出峰时间min
8
19.87
6
18.18
4
16.86
2
18.34
1
15.74
17.798
山奈算素的出峰时间：
17.8Min
结果讨论，在1ug/ml的情况下山奈算素依然可以有明显的峰和面积，表明高效液相比较敏感，容易的
得出的山奈酸素的标准曲线如下
4…槲皮素：
同样配置好不同浓度的标准样品，8.0—6.0—4.0—2.0—1.0—0.5ug/ml的溶液，用滤膜处理放等待进样，每一组浓度的样品连续做三组平行样，然后得到的数据求其平均值，得到回归线和出峰时间。
含量ug/ml
出峰时间min
面积Mau
8
30
802
30
787
30
780
统计总计的含量和面积平均值如右
含量ug/ml
面积Mau
6
30.85
594
8
789
30.215
588
6
591
30.27
592
4
369
4
30.34
390
1
74
30.33
365
30.37
354
2
30.31
197
30.39
192
30.64
158
1
30.5
80
30.38
66
30.11
76
0.5
nopeak
得出的槲皮素的标准曲线如下
得到槲皮素的出峰时间为30S
含量ug/ml
出峰时间min
8
30
6
30.44
4
30.34
1
30.33
30.2775
从此次槲皮素的制定，我们可以看出来槲皮素的出峰时间较为稳定，出峰面积变化幅度也较小，说明槲皮素的测定结果好，在高效液相中的表征准确。
1.2HPLC-液相色谱仪检定中常见的影响因素及解决方法:
1.气泡
由于HPLC系统中气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。
造成上述现象的主要原因有三条：
一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。
为了避免这类问题的出现，HPLC实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理；在HPLC系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净；在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。
2.柱温
在操作HPLC时，色谱柱是在室温环境下工作的。
大多数的工作环境温度是不断变化的，温度的差别就会引起较复杂的问题。
温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的，HPLC方法中的洗脱方式受温度的影响。
等度洗脱时温度会影响保留时间，当温度升高时所有的色谱峰都前移了，等度洗脱时一般温度每升高１℃，保留时间会缩短（1~3）％。
温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。
温度变化对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱的影响。
即便如此，若梯度洗脱时不控制温度的话，保留值一般也会有较大的变化。
温度变化还可能引起选择性显著变化。
正如柱子不能完全平衡将导致保留时间的重现性差一样，柱温不平衡也会导致不理想的后果，这个问题在峰宽上的影响尤其明显。
当温度变化时除了选择性和保留时间的变化之外，峰宽也会发生变化。
升高温度通常会使理论塔板数升高，峰宽变窄，由于峰面积不变，峰越窄就会越高，因此升高温度可以达到更小的检测限。
柱子里的温度变化也会影响峰形。
当流动相和柱子之间的温差增大时，由温度不平衡而导致的峰变形就会加剧。
为了获得一致的结果我们必须要控制柱温，使用柱温箱是最好的办法。
如果没有柱温箱，最有效的办法就是将色谱柱隔绝在一个温度波动最小的地方。
3.色谱柱污染
色谱柱污染会引起保留时间漂移。
HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。
污染源可能是：
流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。
样品中如果存在HPLC色谱柱上保留很强的组分，就可能使保留时间漂移。
通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。
可以通过使用固相提取等样品前处理方法来去除样品基质的影响。
避免HPLC色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。
相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。
通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。
使用保护柱是个非常有效的方法。
反冲HPLC色谱柱仅是不得已时采用的办法。
4.HPLC色谱柱平衡
如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。
通常平衡需要10~20个柱体积的流动相。
但如果在流动相中加入少量添加剂则需要相当长的时间来平衡HPLC色谱柱。
需要柱子的充分平衡，然后才能对HPLC进行检定。
5.流动相有机溶剂
HPLC分析总要求使用HPLC纯的试剂，关键是两点：
纯度高、紫外吸收小。
纯度高，是希望没有杂质干扰HPLC分析；不会有金属离子损害纯度为99.99%以上的高纯度硅胶基质。
可以通过重蒸分析纯溶剂；或滤膜过滤，并定期把前置的过滤头取下，放稀硝酸里清洗，再用纯水洗至中性。
流动相有机溶剂可能影响HPLC的检测限。
6.柱压
HPLC柱压过高是HPLC分析中常碰到的问题。
其原因有多方面，而且常常并不是HPLC柱子本身的问题。
HPLC溶剂或样品含有颗粒杂质，这些杂质将筛板堵塞引起压力上升，应更换HPLC柱子入口筛板；泵内有空气，解决的办法是清除HPLC泵内空气，对溶剂进行脱气处理；比例阀失效，应更换HPLC比例阀；泵密封垫损坏，应更换HPLC密封垫；系统检漏，则HPLC找出漏点，密封即可。
HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下，峰形应对称而尖锐。
充分考虑到可能影响分析结果的因素，可以科学地进行液相色谱仪的检定。
第二节银杏叶有效物质的提取
2.1引言
银杏提取物有效成分分析方法
黄酮类化合物定量定性分析方法银杏黄酮是一类具有抗氧化作用的多环多元酚类化合物，它的药用价值很高，银杏黄酮具有清除自由基生成，抑制细胞膜脂质过氧化，提高红细胞SOD活性，防止血栓形成，增进红细胞变形能力，改善循环障碍的特点，对脑部血液循环及脑细胞代谢有较好的改善及促进作用，对大脑有保护作用。
其提取方法主要有：
水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法，树脂法，酶法，微波法、超声波法，超临界流体萃取法等。
其含量分析方法主要有：
气相色谱法、高效液相色谱法、分光光度法、毛细管电泳法、直接比色法、薄层层析法等。
近年来对银杏黄酮类物质的定性定量分析方法进行了较多的研究。
周亚平等在水浸提银杏黄酮苷时认为最主要的因素是提取温度，其次是提取时间。
曾凡骏等采用改进Uv法，既能适用于以乙醇溶液作提取剂也能适用于以丙酮溶液作提取剂的银杏提取液，其各项指标均能达到科研和生产的要求。
上官小东等在实验中发现碱性条件下银杏黄酮对H20rLuminol体系有显著的抑制作用，且抑制程度的大小与银杏黄酮浓度之间呈线性关系，该法适用于批量生产的质量控制和微量分析，可用于银杏黄酮制剂的测定。
白丽娟等采用水回流浸提法，以新合成的功能化松香丙烯醇酯网状聚合物吸附分离银杏黄酮，并研究了分离吸附效果。
HASLER等报道的用梯度洗脱二极管阵列紫外检测器测定EGB水解后总黄酮糖苷含量以及银杏叶“指纹色谱”的RP-HPLC方法，被认为是目前最好的定性定量EGB中总黄酮糖苷的方法。
由于银杏中黄酮种类很多，不同黄酮响应系数不同，所以无论采用何种方法其相关的分析条件都需要进一步优化。
2.2实验装置图
采用比较传统蒸馏方法：
（1）选取干燥的银杏叶用粉碎机粉碎称量50mg，装入三口烧瓶中。
（2）用乙醇溶剂在60°的温度下搅拌提取2个小时。
（3）然后选用高速离心机离心，去杂质
（4）用旋转蒸发仪旋转蒸发至溶液有微量固体产生
（5）收集起来等待用大孔树脂分离
对第一步提取工艺的问题研究：
（1）原料破碎度对浸提效果的影响 以70%的乙醇溶液提取,液固比为5∶1,于80℃条件下对不同破碎粒度的银杏叶提取2次,每次1h。
结果如下图表明,粒度不同,浸提效果也不同,粒度小,浸提效果好,但当粒度超过60目后,过滤困难,滤饼中残留的滤液较多,提取率反而下降。
因此实际操作以粒度50～60目为宜。
（2）2.2.2 乙醇浓度对浸提效果的影响 选用粒度为50～60目的银杏叶,用不同浓度的乙醇溶液提取,液固比为5∶1,于80℃条件下分别提取2次,每次1h。
由图知,随乙醇浓度的增加,总黄酮提取率呈上升趋势。
乙醇浓度在70%时提取效果最好,浓度进一步增加,提取率略有下降。
乙醇浓度低于50%时,提取液中杂质含量较高,可能是蛋白质、糖类等水溶性物质大量溶出,提取液粘度较大,过滤、浓缩、分离均较困难。
故选60%～70%乙醇作提取剂为宜
（3）温度对浸提效果的影响在不同温度下,分别以70%的乙醇溶液浸提50～60目粒度的银杏叶,液固比为5∶1,提取2次,每次1h,结果图表明温度越高,总黄酮的提取率越高。
这可能是由于黄酮在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大,同时由于温度升高,浸提液粘度减少,扩散系数增加,促使浸提速度加快。
但温度过高时,热能消耗大,提取液中的活性成分也易被破坏,且杂质的溶出量增加,给后续操作带来不便,成本费用增大,
。
综合各方面因素考虑,浸提温度以80℃左右为宜
（4）提取时间和次数对提取效果的影响 在提取最初的2h内,银杏叶黄酮提取率随时间的延长呈直线上升,当达到2h后,提取率达70%。
时间的延长对浸提效果影响不大,其原因可能是浸提液中黄酮浓度已基本与叶片中黄酮浓度达到平衡;在给定条件下,提取2次后,黄酮提取率已接近最大值。
再增加提取次数,提取率增高很小,而且加大了溶剂用量,增加了成本。
故提取次数以2次为宜。
综合考虑：
提取时间为2h,提取次数为2次。
提取条件的最终确定：
银杏叶的粉碎粒度为50---60为佳，选用60—70的乙醇提取液，在三口瓶中搅拌提取2h，得到滤液后，把残渣在提取一次，然后收集2次得到的提取液，混合，则完成一次提取过程。
2.3大孔树脂分离方法：
大孔吸附树脂简介：
大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，是20世纪60年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。
大孔吸附树脂技术的分离原理：
大孔吸附树脂是吸附性和筛选性原理相结合的分离材料（以苯乙烯和丙烯酸酯为单体）。
它是一种具有大孔结构，不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物，是一类人工合成的有机高聚物吸附剂，是一类不含离子交换基团的交联聚合物。
大孔树脂本身具有的筛选性是由于其本身多孔性结构所决定的，吸附性是由于范德华力或产生氢键的结果，它通过其巨大的比表面进行物理吸附而工作的，使有机化合物根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱而分开，达到分离、纯化、除杂等不同目的。
通常有机化合物是通过树脂的孔穴扩散到树脂的内表面而被树脂吸附，孔径的大小直接影响不同分子的自由出入，从而使吸附树脂具有一定的选择性
大孔吸附树脂的优点：
大孔吸附树脂的孔径与比表面积都比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。
树脂预处理:
树脂先用2molöLNaOH浸泡5h,用蒸馏水洗至中性;再用3molöLHCl浸泡8h,用蒸馏水洗至中性;最后用乙醇浸泡24h,充分溶胀,用乙醇洗至流出液加适量水无白色浑浊现象,再用蒸馏水反复清洗至无醇气味,用蒸馏水浸泡待用。
大孔树脂预处理流程：
预处理大孔树脂→湿法装柱→上三七提取液→水洗→乙醇洗脱→收集流出液→检测
注意：
（1）不管在装柱子前得洗脱或者是装柱子后的洗脱，一定不能让大孔树脂暴漏在空气中，否则影响大孔树脂的装填质量
（2）如果大孔树脂装填的不紧密，可以用蒸馏水从柱子下口冲一下，使得树脂全部漂浮，然后重新沉降，以便大孔树脂装填的严密厚实！
（3）在进样的时候保证柱子上面保存有一点点乙醇，切不能干掉，加入样品，等待一段时间使得样品充分吸附分散在柱子上，然后在用不同浓度的乙醇冲洗，得到不同组分提取物。
实验步骤：
（1）向柱子中加入我们预先旋转蒸发过的银杏叶提取物，等待充分填充柱子，大约半个小时，提取物已充分填充吸附在柱子中。
（2）先加入25%的乙醇溶液冲洗，底下收集液体，大约1/3液体的时候换成另外一个小锥形瓶，共收集5次。
然后分别加入50%---75%---99%的乙醇液体洗脱，同样分别收集5次。
（3）混合每组分的5瓶洗脱液，旋转蒸发至一点浓度，等待后处理！
2.4过高效液相的前处理
供试品溶液的制备：
准确称取银杏提取物20mg，置于l5ml硬质玻璃螺口试管，加甲醇一4mol/L盐酸（7：
3）水解液10ml，加盖，放人80~C恒温水浴槽内，水解lh。
吸取100ul该液体,用60%甲醇定容至5ml棕色容量瓶中，作为供试液。
但盐酸水解液对仪器有一定的腐蚀作用，所以样品测定后应尽快用水冲洗仪器。
我们对样品的水解条件进行了比较。
经试验：
样品加10ml甲醇一4mol/盐酸（7：
3）水解液，80℃水解温度下，水解lh，水解完全。
由于山柰素、异鼠李素二者较难分离，所以实验中要严格控制流动相的极性及流动相比例本实验选用10mmol/ml磷酸盐缓冲液（pH2.50）一甲醇（50：
50）作为流动相，槲皮素、山柰素和异鼠李素三种成分能达到基线分离,干扰杂质峰很少,满足定量要求。
处理完毕后，准确量得所得25%---50%---75%---99%四种组分所得的体积，以便后面计算。
然后走高效液相前，用一次性注射器和滤膜处理，防止里面含有杂质，损坏仪器，影响出峰。
2.5样品过高效液相
50%的
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