紫外光谱分析方法.docx
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紫外光谱分析方法
第四章紫外光谱、紫外－可见光分光光度法
欧阳家百（2021.03.07）
§4-1紫外－可见吸收光谱的产生
一．原因：
分子中价电子跃迁产生的光谱吸收
二．电子跃迁类型
与有机化合物有关的价电子有σ、π和n电子，主要跃迁有：
1．N－V跃迁：
由基态跃迁至反键轨道：
σ-σ*、π-π*
2．N－Q跃迁：
非键电子跃迁到反键轨道：
n-σ*、n-π*
3．N－R跃迁：
σ电子激发到更高能级或电离
吸收波谱：
此外，与分光光度法有关的跃迁还有：
4．电荷转移跃迁，常见过渡金属与有机配位体（显色剂）之间电子转移跃迁，大多在可见光区，吸收强度大，往往用于定量分析。
5.配位场跃迁，d-d或f-f轨道在配位场作用下简并，轨道分裂，产生d-d（Ⅳ、V周期）、f-f（La系、Ar系）跃迁。
此吸收能量少，吸收强度较小，多在可见光区。
三．辐射吸收的基本定律—朗伯-比尔定律
当一束平行光通过均匀的液体介质时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，还有一部分被容器表面散射。
即I0＝It（吸收光）＋Ia（透射光）＋Ir若散射光Ir→0
则I0＝It＋Ia
1．透光率T＝Ia/I0T↑，吸收↓
2．吸光度A＝lg1/T＝lgI0/IaA↑，吸收↑
3．朗伯－比尔定律
当入射光波长一定时（单色光），溶液吸光度A只与溶液中有色物质浓度和比色皿厚度有关，成正比，即
A∝LC=>A＝kLC式中：
k－比例常数－系吸系数
L－比色皿厚度
C－溶液浓度
当C为摩尔浓度，令k＝ε，称为摩尔吸光系数。
4．吸光度的加和性，若溶液中有m种成分，其在某一波长下吸光系数分别为ε1、ε2…εm，浓度分别为C1、C2…Cm
则
对于同一种物质，波长不同时ε（或K）不相同。
四、无机化合物的紫外-可见光谱
§4-2有机化合物的紫外－可见光谱
一．吸收光谱表示方法（光谱图）
用A～λ或T％～λ作图称光谱图。
二．常用术谱
1．生色基团：
含有π键的不饱和基团（为C＝C、C＝O、N＝N、－N＝O等）能产生π-π*跃迁，使得有机化合物分子在紫外－可见光区产生吸收的基团。
1共轭生色团a、基团结构不同：
独立吸收
b、相同，仅一个吸收峰，但强度随生色团数目增加叠加。
②共轭：
仅一个吸收峰（长波称动位置红移）强度显著增大。
2．助色基团：
含有非键电子（n电子）的基团（为－OH、－NH2、－SH、－X等），其本身在紫外－可见光区无吸收，但能与生团中π电子发生n-π*共轭，使生色团吸收峰（长
波方向移动红移）的基团。
3．红移和蓝移
使分子的吸收峰向长波方向移动的效应称红移。
使分子的吸收峰向短波方向移动的效应称蓝移。
三．有机化合物的紫外－可见光谱
1．饱和有机化合物
①不含杂质原子时只有σ-σ*、λ<150nm
②含杂质原子时除σ-σ*外，还有n－σ*吸收可能>150nm，CH3·NH2λmax＝215
CH3Iλmax＝258
一般饱和有机化合物吸收均有远紫外，在一般意义上的紫外区没有吸收，故可作为紫外光谱的溶剂（为烷、醇、醚等）。
2．不饱和脂肪烃
①单烯：
π-π*在170－200nm，不属一般意义紫外区
②共轭烯：
共轭使π-π*的ΔE↓，吸收峰红移，强度增大，这种吸收带称K吸收带（共轭带）。
例：
CH2＝CH2λm＝165nmε＝15000
CH2＝CH－CH＝CH2λm＝217ε＝21000
CH2＝CH－CH＝CH－CH＝CH2λm＝257ε＝35000
3．醛、酮化合物
有σ、π、n电子，可产生n-σ*、π-π*、n-π*，其中n-π*跃迁在270－300nm称R吸收带（基团带），例丙酮280nm，但ε＝10－2。
对于α、β不饱和醛酮－C＝O和C＝C共轭，因此，R，K吸收带均红移。
R在320－340nmε＝10－102
K在220－240nmε>104
4．芳香化合物
①无取代：
苯在紫外区有三个吸收带，均由π-π*引起。
E1吸收带在185nmε＝104（60000）
E2吸收带在204nmε＝103（7900）
B吸收带（苯带）在254－260nm（230－270nm）ε＝200=>由于振动跃迁叠加在π-π*上引起。
2②单取代：
取代为助色基团E2红移、B红移
例：
取代为生色基团E2与K吸收带合并，红移
③二取代：
对位εmax增大，红移，邻位间此作用较小。
④稠环化合物：
共轭苯环数增加，红移，ε↑
§4-3影响紫外－可见光谱的因素
一．溶剂效应
对于π-π*（π*极性较π大，与极性溶剂作用，π*下降多，π下降少，∴ΔE↓）跃迁引起的吸收峰，溶剂极性变大，红移。
对于n-π*（n极性较π*大，n↓多，π*下降少，∴ΔE↑）跃迁引起的吸收峰，溶剂极性变大，蓝移。
因此，利用溶剂极性影响的不同可区分π-π*和n-π*。
此外，溶剂对吸收强度，精细结构等均有影响。
所以，紫外光谱图必须注明溶剂。
二．空间效应
空间阻碍使共轭程度下降，吸收峰蓝移。
例：
二苯乙烯反式：
λmax＝295，顺式：
λmax＝280nm
三．超共轭效应
烷基取代时，C－H的σ饱键和苯环分子轨道重叠，使得ΔE↓，红移。
四．PH
改变介质PH，对于不饱和酸、烯醇、酚、苯胺等化合物紫外光谱影响较大。
§4-4紫外－可见光分光光度计
一．紫外－可见光分光光度计主要部件及其作用
光谱分析仪器在结构上均相似。
紫外－可见光分光光度计也有很多型号，但各类光谱分析仪器均由光源、单色器、吸收池、检测器和显示系统等五个部分构成。
1．光源
作用：
提供入射光
要求：
提供足够强度和稳定的连续辐射，强度基本不随波长变化而改变。
种类：
钨灯（卤钨灯）发光波长360－1000nm适用于可见光区
氢（氘）灯波长范围180－375nm适用于紫外区
2．单色器
作用：
将复合光分解为单色光
3、吸收池
作用：
盛待测试样
要求：
透光性好，无折射，反射，宽度精确
种类：
石英=>紫外区
玻璃=>可见光区
4.检测器
作用：
将光信号转变为电信号
种类：
硒光电池光电管光电信增管
5.信号显示系统
种类：
检流计（72型）微安表（721）电位计（751）数显
二．紫外可见光分光光度计类型
§4-5紫外－可见光分光光度法的应用
紫外－可见光吸光谱可用于定性和定量分析
一．定性分析
无机化合物吸收弱，很少用于定性分析，但对有机化合物的定性分析是常用手段之一。
根据紫外可见光谱提供的信息可判断分子中生色基团和助色基团的性质。
1．结构骨架推断：
和标准谱图完全相同，则说明有相同生色团，若无K吸收带则不含共轭不饱和键；无R吸收带则无n-π*。
利用E1、E2、B吸收带可判断苯环或芳烃。
2．构型和构象（顺反式）
三、纯度检测（微量杂质）
四、定量分析
（一）测定方法
1．单组分：
①绝对法Cx＝A/εl（知ε）
②比较法Cx＝Ax·Cs/As需已知浓度标样
③标准曲线法
④标准加入法Cx＝Ax·CΔ/（Ax+Δ-Ax）
2．多组分利用吸光度加和性解联主方程
*3．双波长法ΔA＝（ε2b－ε1b）C（a组分在λ1、λ2吸光度相同）
*4．差示分光光度法A＝εl（Cs－Cx）高浓度
低浓度
（二）测量条件选择
1．吸光度范围0.2－0.8
2．入射光波长选择由吸收曲线确定
3．显色反应条件
①显色剂用量固定L、C，改变显色剂用量作图选择
②PH值：
使得络合物，络合物组成，显色剂，待测离子等均稳定的PH范围
③温度
④时间
⑤干扰离子
⑥显色剂要求：
A、无色
B、稳定络合物
C、不与共存离子络合
五．Woodward和Fieser规则
物质的紫外－可见光谱显示的是分子中生色基团和助色基的特性，吸收峰的波长与分子中基团种类，数目及其相互位置有关。
Woodward和Fieser在大量观测结果的基础上，提出了计算共轭体和α、β－不饱和醛酮类化合物λmax的经验规则Woodward－FieserⅠ
共轭烯烃：
基本值
取代增量
键二烯
217
共轭双键30nm
半环二烯
217
环外双键5
同环二烯
253
烷基或环键5
异环二烯
214
－OR6
SR30
X5
NR260
Woodward－Fieser规则Ⅱ（见P94）
效液相色谱分析原理及流程2011-06-20中国化工仪器网点击：
384 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。
通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。
所用的固定相为大于100um的吸附剂（硅胶、氧化铝等）。
这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。
而高效液相所用的固定相粒度小（5um-10um）、传质快、柱效高。
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。
近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。
世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。
高效液相色谱分析原理
（一）高效液相色谱分析的流程
由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（二）高效液相色谱的分离过程
同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。
高效液相色谱的类型
（一）吸附色谱
在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。
所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。
通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。
吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的浓度为10%或更少一些。
如有可能，可进一步减小百分数。
因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。
（二）分配色谱
1.正相分配色谱
正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子型物质。
2.反相分配色谱
这种方法目前应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。
通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的PH值，例如，如果样品有一个—COOH基团，使流动相的PH值是偏向酸性的，由于抑制了—COOH基团的电离而加强了保留。
这个方法叫离子抑止法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。
在调节PH值中，保持PH值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，当加入盐以后，最好使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广泛的PH值。
（三）离子交换色谱
这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。
离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。
在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、PH及盐的种类等都对保留值有很大的影响。
在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。
因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用NaCI或其他的氯化物盐类。
根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在210nm，当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适的。
（四）凝胶色谱
凝胶色谱不同于以上三种分离方法。
凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。
这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。
具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。
因为在样品中，小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出，而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。
通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相，叫做凝胶渗透色谱。
凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。
1.凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱（GelPermeationChromatography），简称GPC。
此一类的色谱，使用于有机性溶媒的样品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用的洗脱液有THF，Chloroform等等。
2.凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱（GelFiltrarionChromatography），简称GFC。
此一种类的层析法，使用于水溶媒的试剂中，如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、缓冲液等等。
凝胶的种类很多，按其原料来源可分为有机胶和无机胶。
按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。
而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。
根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。
气相色谱仪是以气体作为流动相（载气），当样品由微量注射器“注样”或气体进样器进样进入汽化室后，被载气携带进入填充色谱柱或毛细管色谱柱。
由于样品中各组份在色谱柱中的流动相（气相）和固定相（液相或固相）间吸附力或溶解度的差异（即保留作用不同），在载气的冲洗下，各组份在两相间作反复多次分配并在柱中得到分离，随后顺序通过柱后检测器依次被检测出来，并转换为电信号送至色谱数据处理系统绘出色谱图给出定量、定性分析结果
气相色谱的工作原理：
实现色谱分离的先决条件是必须具有固定相和流动相。
色谱分离的内因是固定相与被分离各组分发生的吸附（或分配）作用的差别，微观解释就是分子键相互作用力的差别。
外因是由于固定相的不间断流动，使被分离组分与固定相发生反复多次的吸附、解析过程，这样就使那些在同一固定相上的移动速度吸附（或分配）系数只有微小差别的组分在固定相上的移动速度产生了很大的差别，从而达到各个组分的完全分离。
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