抑制端粒爱惜蛋白TPP1表达诱导ATM依靠的DNA损伤反应.docx

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抑制端粒爱惜蛋白TPP1表达诱导ATM依靠的DNA损伤反应

抑制端粒爱惜蛋白TPP1表达诱导ATM依托的DNA损伤反映

郭晓兰，袁国华，周京国，唐中，刘宁涛，杨明辉，青玉凤，吴凤霞，朱道银

【摘要】目的：

构建端粒爱惜蛋白TPP1短发夹RNA表达载体，探讨抑制TPP1表达后对端粒DNA损伤及细胞增殖的阻碍.方式：

体外构建端粒爱惜蛋白TPP1shRNA逆转录病毒表达载体shTPP101，shTPP102，与表达外源性TPP1的TPP1HA质粒一起转染293T细胞，WesternBlot检测shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表达；RTPCR检测shTPP1抑制小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）内源性TPP1mRNA的表达.再用shTPP1别离感染ATM＋/＋MEF和ATM－/－MEF细胞后，别离采纳细胞生长曲线和BrdU掺入法检测细胞增殖，免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交法（IF/PNAFISH）检测端粒功能障碍诱导损伤灶（TIF）的形成.结果:

shTPP101和shTPP102均能明显抑制外源性TPP1蛋白和内源性TPP1mRNA的表达，shTPP101和shTPP102作用于原代培育的MEFs后细胞生长缓慢，BrdU阳性细胞数量别离占%和%，显著低于对照细胞的%（P<,P<；而细胞表现为体积变大，形态扁平等类似细胞衰老的形态学改变；IF/PNAFISH法检测结果显示，shTPP1作用于ATM＋/＋MEF细胞后致使端粒DNA损伤标志物-磷酸化的H2AX（γH2AX）和53BP1损伤灶（TIF）的形成，定量结果显示约50%的ATM+/+细胞中显现至少5个TIF；而在shTPP1作用后的ATM-/-细胞中，端粒γH2AX和53BP1形成的TIF数量显著减少，显现5个TIF的细胞数量不足5%，与对照组细胞相较无显著性不同.结论：

抑制TPP1表达后诱发端粒ATM依托的DNA损伤反映，进而抑制细胞增殖，增进细胞衰老.

【关键词】端粒;短发夹RNA;DNA;损伤反映

0引言

端粒位于真核细胞染色体的结尾，由串联重复的DNA和端粒结合蛋白组成，其要紧功能是维持染色体的完整性，同时也是细胞生存期限的关键调控因子［1］.对肿瘤的研究发觉，大多数肿瘤细胞在割裂增殖进程中维持稳固的端粒长度，因此通过干与端粒的结构和功能有可能操纵肿瘤进展［2］.目前发觉端粒爱惜蛋白要紧有6个亚单位：

TRF1，TRF2，TIN2，Rap1，POT1和TPP1，他们一起组成端粒爱惜蛋白复合体（Shelterin）［3］，其中TPP1是形成蛋白复合体的关键因子之一［4-5］.咱们通过采纳靶向端粒结合蛋白TPP1小片段干扰RNA（siRNA）技术，构建TPP1短发夹RNA（shRNA）逆转录病毒介导的表达载体，观看抑制TPP1表达后所诱导的端粒DNA损伤反映和对细胞增殖和衰老的阻碍.

1材料和方式

材料构建TPP1的shRNA寡核苷酸和PCR引物由美国Sigma公司合成；RNA提取试剂盒、RTPCR反映试剂盒、转染试剂lipofectamine（Invitrogen公司）；限制性内切酶BglⅡ,EcoRⅠ,HindⅢ（Biolabs公司）；γH2AX鼠mAb（美国Upstate公司）；凝胶成像系统（美国AlphaInnotech公司）；PCR扩增仪PTC200EngineCycler（美国MJResearch公司）；BX41型显微镜（日本Olympus公司）.

方式

shRNA表达载体的构建小鼠TPP1的mRNA序列来自GenBank（GI:

），参照siRNA靶点设计原那么，设计如表1.合成的正义链和反义链经变性和退火反映后形成双链DNA，用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ将其定向克隆至逆转录病毒载体RetropSuper（含有嘌呤霉素抗性挑选标记），经EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定取得的阳性克隆RetropSupershTPP1，简称shTPP1.表1shTPP101和shTPP102的碱基序列

细胞培育和转染将质粒shTPP101和shTPP102别离转染病毒包装细胞293T，转染操作按lipofectaminePlus说明进行：

①接种1×105个293T细胞于10cm细胞培育盘中，37℃，50mL/LCO2培育留宿；②改换为无血清DMEM，逐滴加入转染试剂Lipofectamine（含4μgshTPP1质粒DNA），培育4～6h后，改换为完全DMEM培育基培育；③别离于培育24，48h后搜集293T细胞培育上清感染MEF细胞，72h后加入2mg/L嘌呤霉素进行挑选.

Blot检测shTPP1抑制外源性TPP1表达细胞转染72h后搜集293T细胞，超声破碎细胞后，4℃,10000g离心20min，搜集上清进行蛋白质定量测定.取50μg蛋白质经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移至PVDF膜，以抗HA抗体检测TPP1HA的表达水平.

检测shTPP1抑制MEF内源性TPP1mRNA的表达搜集含有逆转录病毒的293T细胞培育上清，以MOI=500的病毒滴度感染MEF细胞，48h后重复感染1次，72h后搜集细胞提取总RNA，采纳RTPCR检测shTPP101和shTPP102对MEF细胞内源性TPP1在转录水平表达的干扰作用.TPP1上游引物序列：

5′ATGTCCGATTCAGGGTTGCTGG3′，下游引物序列：

5′TCATACCTGGGTTAACTCAGACTCTG3′.同时扩增GADPH作为内参.GADPH上游引物序列：

5′TCACCACCATGGAGAAGGC3′,下游引物序列：

5′GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA3′.PCR反映条件：

94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共25个循环.

细胞生长曲线和BrdU掺入实验MEF细胞经含有shTPP101和shTPP102表达质粒的逆转录病毒感染后，加入2mg/L嘌呤霉素挑选2wk取得稳固表达shTPP101或shTPP102的细胞.然后按5×104/孔接种于细胞培育6孔板中，别离于第0，2，4，6，8日作细胞计数，绘制细胞数量-时刻的生长曲线.同时按2×104/孔的细胞接种8孔的chamberslide，培育留宿后加入BrdU（终浓度为10μmol/L），继续培育1h，固定细胞后以抗BrdU抗体检测掺入BrdU后的细胞及其数量.

免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交法（IF/PNAFISH）检测端粒功能障碍诱导的损伤灶（TIF）将逆转录病毒介导的shTPP1别离感染ATM+/+MEF和ATM-/-MEF细胞，2mg/L嘌呤霉素挑选2wk.按2×104/孔接种chamberslide培育留宿，按文献［6］行IF/PNAFISH法检测端粒上磷酸化的H2AX和53BP1的TIF形成.同时WesternBlot检测细胞中磷酸化的H2AX（γH2AX）水平.

统计学处置:

实验结果中两组计量资料之间的比较，采纳x±s进行t查验.

2结果

逆转录病毒介导的shTPP1质粒的鉴定和功能检测按上述描述的方式构建逆转录病毒介导的shTPP1质粒.shTPP1质粒经限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果显示约为300bp的片段，而空载体酶的片段为240bp左右，与预期值一致，即shTPP1的大小为60bp左右（图1A）.shTPP1与表达外源性的TPP1HA质粒一起转染293T细胞后，WesternBlot结果显示shTPP101和shTPP102均能明显抑制外源性TPP1蛋白的表达（图1B）.RTPCR结果说明shTPP101和shTPP102别离有效地降低了MEF细胞内源性TPP1在转录水平的表达（图1C）.

A:

shTPP1经EcoRⅠ和HindⅢ酶切；B:

WesternBlot检测shTPP1作用后外源性TPP1蛋白的表达水平;C:

RTPCR电泳.M:

标准分子质量;V:

空载体;1:

shTPP11;2:

shTPP12;Tubulin:

加样的蛋白量；GAPDH:

内参.图1shTPP1质粒的构建和鉴定及其功能检测

抑制TPP1表达对细胞增殖的阻碍与对照组细胞相较，shTPP1作用于原代培育的MEFs后，细胞生长明显减缓.BrdU细胞增殖掺入实验进一步证明，BrdU阳性细胞数量在空载体质粒转染的对照细胞组中占%，在shTPP101或shTPP102作用后的细胞别离仅占%（t=,P<和%（t=,P<.增殖受到抑制的细胞在显微镜下表现为体积变大、形态扁平等类似细胞衰老的形态学改变（图2）.

抑制TPP1表达对端粒DNA损伤反映的阻碍shTPP1作用于ATM+/+细胞后，γH2AX明显增高，而在ATM-/-细胞中那么未检测到（图3A）；在空载体质粒转染的ATM+/+细胞中γH2AX形成TIF的阳性率为5%，在shTPP101或shTPP102作用后的ATM+/+细胞那么别离为45%（t=,P<和40%（t=,P<；53BP1在空载质粒转染的ATM+/+对照细胞中形成TIF的阳性率为%，而在shTPP101或shTPP102作用后的ATM+/+细胞中TIF别离为42%（t=,P<和35%（t=,P<；TPP1受到抑制后，ATM+/+细胞中γH2AX形成TIF的信号（绿色）、53BP1形成TIF的信号（绿色）与端粒PNAFISH杂交的信号TTAGGGFISH（红色）相重合，说明DNA损伤反映发生在染色体的端粒.定量分析显示，大约50%的ATM+/+细胞中显现至少5个由γH2AX或53BP1形成的TIF（图3B，C）；ATM-/-细胞在shTPP1作用后的细胞中形成TIF的数量与空载体转染细胞相较无明显不同，ATM-/-细胞中显现5个TIF的细胞数量不足5%（图3D），说明抑制TPP1表达后诱导端粒发生了ATM依托的的DNA损伤反映.

3讨论

端粒除维持染色体的完整性外，在调控细胞的增殖能力方面起着关键性作用.哺乳动物细胞通过端粒上特有的蛋白区分正常染色体结尾不被识别为损伤的DNA而诱发ATM（ataxiatelangiectasiamutated）或ATR（ataxiatelangiectasiaandRad3related）介导的DNA损伤反映［7］，显现DNA损伤蛋白53BP1和γH2AX在端粒的聚积，致使细胞增殖衰竭或凋亡［8］.端粒功能障碍引发的细胞增殖衰竭和凋亡是机体清除衰老细胞的一个重要途径，也是机体组成的一道重要癌变防御屏障.大多数肿瘤细胞在割裂增殖进程中维持稳固的端粒长度，因此在肿瘤细胞中诱导端粒功能障碍有可能成为新的医治策略.

A:

WesternBlot检测ATM+/+和ATM-/-细胞中的γH2AX；B:

IF/PNAFISH显示ATM+/+和ATM-/-细胞端粒中γH2AX形成的TIF；C:

IF/PNAFISH显示ATM+/+和ATM-/-细胞端粒中53BP1形成的TIF；D:

定量分析γH2AX和53BP1在ATM+/+和ATM-/-细胞端粒中TIF的形成.V:

空载体;1:

shTPP11;2:

shTPP1.

图3抑制TPP1表达诱发细胞端粒ATM依托的DNA损伤反映

端粒爱惜蛋白在调控端粒的结构和功能方面起着关键性作用.最近OConnor等［9］发觉，TPP1表达的缺失能够致使端粒爱惜蛋白复合体的形成障碍，Chen等［10］那么发觉TPP1具有调控胞核输