FFPE样品制备及分析宝典.docx
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FFPE样品制备及分析宝典
FFPE样品制备和分析宝典
FFPE样品制备和分析宝典
摘要：
本文介绍了制备和保存FFPE样品的方法，可尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。
接下来介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。
FFPE样品制备和分析的宝典，绝对不容错过！
全世界福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片的存档代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。
随着越来越多的研究人员转向FFPE样品的分子分析，开发特定的操作步骤，考虑这些样品的独特性质就变得越来越重要。
本文为完整的FFPE流程提出了建议。
其中介绍了制备和保存FFPE样品的方法，其目的在于尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。
接下来介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。
一、制备和存档FFPE样品时的重要考虑因素
从FFPE样品中提取出的核酸和蛋白的质量取决于固定和包埋之前、期间和之后如何处理样品。
在这一部分，我们确定了影响生物分子质量的主要因素，并建议采取哪些措施，以尽量减少这些因素的影响。
1样品类型
每种组织都有其特定的生理功能，并就其结构和组成细胞而言是独特的。
取决于组织类型，收获后生物分子降解、诱导或修饰的速度可能各异。
因此，组织切除和固定的操作应尽快开展（详见2样品处理）。
从富含纤维或脂肪的FFPE组织中纯化分析物时，不需要特殊的裂解条件：
相反，福尔马林交联和石蜡的存在决定了分析物提取的要求（详见后文）。
在处理肿瘤组织时，应当注意健康和恶性细胞并不是均匀分布的。
因此，同一个组织样品中一块切片的分析结果可能与另一块切片不同。
2样品处理
从病人身上获得组织标本的手术涉及麻醉、血管结扎、组织的切除以及固定。
从病人麻醉到组织固定这段时间内，组织中的基因表达可能发生变化，且可能发生组织自溶。
因此，组织固定前的操作时间应当越短越好，以避免RNA转录本和蛋白表达谱发生明显改变。
操作中每一步的时间应记录在案，这是最低要求。
3福尔马林固定
组织的固定是将标本放在福尔马林溶液中，此溶液的组分可能有所差异（典型的10%福尔马林溶液可能含有3.7%甲醛以及1-1.5%甲醇）。
产生的化学反应导致生物分子之间的交联，包括核酸之间、蛋白之间，以及核酸和蛋白之间的交联。
为了获得最佳的结果，应当使用中性的福尔马林缓冲溶液，以取代无缓冲或酸性的溶液。
中性缓冲液减缓福尔马林的降解，而通常认为其降解产物会损害核酸的质量。
而另外3个影响组织固定程度的因素也很重要：
组织标本的厚度、福尔马林溶液的体积和固定过程的持续时间。
固定不足（underfixation）可导致组织标本中福尔马林未渗入的较深区域的核酸和蛋白降解，或基因表达发生改变。
过度固定（overfixation）则导致更密集的交联，让有用核酸和蛋白的提取变得更加困难。
福尔马林大约以1mm/小时的速率渗透组织。
此外，福尔马林的渗透速率随组织厚度的增加而降低。
因此，在固定一个组织标本时，它应当足够薄，以避免周边的过度固定和中间的固定不足。
在一个比较不同大小样品固定过程的实验中，QIAGEN的研究人员发现，在固定整个组织（厚度大约1cm），而不是组织切片（厚度约4mm或以下）时，RNA显著降解（图1）。
为了获得最佳的结果，通常建议固定最多5mm厚的组织标本。
福尔马林与组织的比例至少应为10:
1，以确保最佳的固定。
在处理小的组织标本，如穿刺活检时，这很容易实现。
然而，在处理大的组织样品时，固定所用的福尔马林可能不足。
在这种情况下，组织切片应当切割后再进行福尔马林固定。
组织的固定不应超过24小时，以避免过度固定。
在一个比较过夜固定和72小时固定的实验中，QIAGEN的科学家观察到，固定时间对RNA完整性几乎无影响（图2）。
然而，他们也发现，72小时固定对纯化后RNA在一步法RT-PCR中的表现有不利影响：
较大的扩增子无法成功扩增，这极有可能是因为RNA分子的过度交联和较高比例的不可逆交联（图1）。
另一个实验表明，72小时的固定降低了FFPE样品中蛋白的回收率（图3）。
这种不利影响同样是由于交联增加。
图1.样品厚度对RNA完整性的影响。
大鼠组织以整个器官或≤4mm的切片进行福尔马林固定和石蜡包埋。
A包埋后3天利用RNeasy®FFPEKit纯化RNA，并利用Agilent®2100Bioanalyzer分析。
在整个大脑的电泳峰图中，双箭头指出了18SrRNA和28SrRNA的峰减少，表明RNA片段化的增加。
B纯化的RNA被用于一步法RT-PCR中，利用大鼠Rpl4基因特异的不同引物对和QIAGENOneStepRT-PCRKit。
从左到右，扩增子大小分别为96、206、400、613和785个核苷酸。
整个器官的分析中较大扩增子的缺失表明较大的RNA存在降解。
（数据引用自vonAhlfenetal.[2007]DeterminantsofRNAqualityfromFFPEsamples.PloSONE12,e1261.）
图2.固定时间对RNA完整性和一步法RT-PCR的影响。
各种大鼠组织经过福尔马林固定（过夜或3天）和石蜡包埋。
为了比较，大鼠组织以RNAlater®RNAStabilizationReagent稳定。
包埋后3天利用RNeasy®FFPEKit纯化RNA，并利用Agilent®2100Bioanalyzer分析。
此外，利用QIAGENOneStepRT-PCRKit和大鼠Rpl4基因特异的引物对开展一步法RT-PCR。
扩增子大小如图所示，RT-PCR的结果以颜色显示：
红色表示无扩增；黄色表示弱的扩增；绿色表示成功的扩增。
尽管较长时间的固定对RNA片段化和核糖体条带影响甚微，但较长扩增子的扩增效率差。
（数据引用自vonAhlfenetal.[2007]DeterminantsofRNAqualityfromFFPEsamples.PloSONE12,e1261.）
图3.固定时间对蛋白提取的影响。
利用10%中性的福尔马林缓冲溶液按照图中所示的时间固定大鼠组织，然后用石蜡包埋。
利用Qproteome®FFPETissueKit提取总蛋白。
开展ASDS-PAGE分析和BWesternblot分析（利用β-actin的抗体）。
两种分析表明，固定时间长于24小时会降低所提取蛋白的量。
4石蜡包埋
在福尔马林固定之后，组织标本包埋在石蜡中，此过程包含几步。
第一步是脱水，其中水被替换成醇类，通常为乙醇。
接着是透明，其中醇类被替换成二甲苯或二甲苯替代物，之后是浸蜡，其中二甲苯被置换成石蜡。
最后一步是包埋，整个标本被石蜡包围。
在浸蜡之前，组织标本必须完全脱水，因为残留的水分可能导致样品降解。
石蜡包埋是维持蛋白完整性的关键一步，因为残留的水分可能导致蛋白水解。
因此，应当使用未经水稀释的高质量试剂，且整个包埋过程的持续时间和温度应当优化，以实现彻底的脱水。
我们建议使用新鲜的醇类和二甲苯，以避免过去使用时水分残留的可能。
浸蜡和包埋福尔马林固定组织中使用的石蜡的熔解温度和组分可能各异。
在使用熔解温度高的石蜡时，包埋过程需要较高的温度，这可能导致样品降解增加。
为了确保从FFPE样品中可用核酸和蛋白的理想回收，应当使用熔解温度低的石蜡。
此外，应当避免包含添加剂如蜂蜡的石蜡，因为它们可能干扰生物分子的回收。
5染色
为了避免FFPE样品分子分析的问题，样品染色应尽可能避免。
某些染料和试剂可能对核酸造成不利影响，特别是那些用于免疫组化染色的试剂。
涉及高pH和重金属离子的染色步骤应当避免。
如果样品染色是必需的，则首选甲酚紫（cresylviolet），因为它与核酸分析兼容。
从那些利用组织学染料（如苏木精或固红）进行染色的切片中纯化蛋白，可能导致蛋白产量的显著下降。
然而，纯化后的蛋白可用于westernblotting或反相蛋白芯片分析等下游应用。
6样品保存
在固定和包埋之后，FFPE样品最好应在最佳温度下保存，这样可减缓核酸和蛋白的降解。
在一个比较不同保存温度的实验中，QIAGEN的科学家发现，如果FFPE样品保存在4°C，而不是室温或更高，则RNA在1年后仍基本完整（图4）。
由于FFPE样品中的RNA常常严重片段化，所以对小分子RNA如microRNA（miRNA）而言，回收基本完整RNA的机会高于较长的RNA如mRNA。
这意味着检测短扩增片段的分析（如特定miRNA的分析）受福尔马林固定的影响比检测长扩增子的分析（如特定mRNA转录本的分析）要小（图5）。
图4.保存温度对RNA完整性的影响。
各种大鼠组织经福尔马林固定和石蜡包埋。
在包埋后3天（T0）或在4°C、20-25°C或37°C保存一年后利用RNeasyFFPEKit纯化RNA。
在Agilent2100Bioanalyzer上分析RNA完整性。
对于保存在4°C的样品，18SrRNA和28SrRNA对应的峰清晰可见，表明存在完整RNA，而保存在较高温度下的样品却并非如此。
（数据引用自vonAhlfenetal.[2007]DeterminantsofRNAqualityfromFFPEsamples.PloSONE12,e1261.）
图5.保存条件对实时定量RT-PCR表现的影响取决于RNA大小。
各种大鼠组织经福尔马林固定和石蜡包埋。
利用miRNeasyFFPEKit纯化得到包含小分子和大分子RNA的总RNA。
在包埋后3天（T=0）、室温下保存6个月和37°C保存6个月的RNA样品作为模板，利用miScriptPCRSystem开展实时定量RT-PCR。
在ABI7900循环仪上开展反应。
AmicroRNAmiR-29（模板长度：
22nt）和BHprt1转录本（扩增子长度：
94bp）被检测到。
6个月的保存对mRNA分析表现的影响大于对miRNA分析的影响，表明RNA片段化对较长模板检测的影响比极短模板检测要大。
二、从FFPE样品中提取有用分析物的的关键因素
从FFPE样品中纯化DNA、RNA和蛋白时，目前存在一些主要困难。
首先，这些生物分子彼此交联。
交联程度和不可逆交联的比例取决于，或部分取决于，福尔马林固定的持续时间。
其次，核酸常常严重片段化，这取决于FFPE样品如何制备和保存。
第三，由于FFPE样品很珍贵，故只有有限的材料可用于分析物纯化和下游分析。
因此，所用的纯化步骤必须是高效的，尽可能多地回收有用的分析物。
本章介绍了从FFPE样品中纯化DNA、RNA和蛋白的独特挑战，以及如何最有效地克服它们。
1脱蜡
从FFPE样品中纯化核酸和蛋白之前，需要开展脱蜡。
在此过程中，先溶解石蜡，然后去除，暴露样品，用于后续裂解缓冲液和蛋白酶K（如果合适）的处理。
多种溶剂适用于脱蜡，而溶剂的选择取决于后续开展的纯化步骤。
对于DNA或RNA的纯化，包括用蛋白酶K消化样品，让核酸与硅胶模结合，可选择各种疏水溶剂用于脱蜡。
具体包括二甲苯、庚烷和柠檬烯。
对于FFPE样品的蛋白纯化，如果蛋白用于westernblotting等下游应用，二甲苯脱蜡很合适。
不过，对于2D-PAGE等苛刻应用，只能使用庚烷，才能确保非常高效的脱蜡。
从FFPE样品中纯化DNA或RNA之前，使用QIAGEN的新型脱蜡溶液，可实现更为方便的脱蜡。
在加入FFPE样品之后，溶液仍在样品上，同时可开展蛋白酶K消化。
在加入脱蜡溶液后无需沉淀FFPE样品，也无需去除包含石蜡的上清。
因此避免了脱蜡过程中损失样品的风险。
作为溶剂法的替代，石蜡也可通过加热与FFPE样品分离：
熔化后，石蜡冷却，取决于其用量，石蜡粘在管壁上，或在样品上形成一个固体层。
福尔马林交联限制了生物分子的纯化
图6.福尔马林固定对DNA、RNA和蛋白的影响。
福尔马林固定导致核酸之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间的交联。
固定时间越长，交联程度越大。
2基因组DNA的纯化
由于FFPE样品包含的DNA分子会彼此交联，并与RNA和蛋白分子交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。
如果可能的话，因交联而引起的化学修饰也应当逆转，因为化学修饰的DNA不能在纯化过程中高效回收，而且在PCR或其他酶学分析中是一个不佳的底物。
然而，在断裂交联和逆转化学修饰时必须小心，因剧烈的反应条件可能导致DNA的进一步片段化。
QIAamp®DNAFFPETissueKit提供了一个克服交联的有效方法，此试剂盒是特别为FFPE样品的基因组DNA纯化而设计的。
样品先用蛋白酶K在56°C处理1小时，这一步通过消化交联蛋白而释放DNA。
接着是优化缓冲液中的90°C孵育，这可部分逆转交联育过程中，氨基之间的亚甲基桥断裂，且释放出的甲醛分子与受体分子结合。
尽管过度加热会导致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在90°C孵育1小时可实现可分析基因组DNA的最佳回收（图7和8）。
数据还显示，56°C的1小时孵育加上90°C的1小时孵育使蛋白酶K过夜孵育不再成为必需。
图7.基因组DNA的最佳回收。
大鼠肝脏的FFPE切片用蛋白酶K在56°C处理1小时，之后按图中所示的条件孵育。
作为对照，一个样品与蛋白酶K在56°C孵育过夜。
利用QIAampDNAFFPETissueKit纯化基因组DNA，并利用分光光度计确定DNA产量。
与80°C孵育和56°C的过夜孵育相比，90°C孵育实现了DNA的更佳回收。
图8.从FFPE组织中回收可用的基因组DNA。
大鼠肝脏的FFPE切片用蛋白酶K在56°C处理1小时，之后按图中所示的条件孵育。
利用QIAampDNAFFPETissueKit纯化基因组DNA，并用QuantiTect®SYBRGreenPCRKit和Pmp2基因特异的2对不同引物开展SYBRGreen®法实时定量PCR。
生成的扩增子为78bp或464bp。
90°C孵育产生的CT值比80°C孵育更低：
这表明更高温的90°C孵育在逆转交联上更为有效，提供了更多有用的DNA，供实时定量PCR分析之用。
作为对照，一个样品与蛋白酶K在56°C孵育过夜。
在2步孵育之后，DNA可利用QIAampMinElute®离心柱纯化：
在硅胶模上分离DNA，洗涤以去除污染，之后以20-100μl的小体积洗脱。
另外，当DNA与硅胶模结合之前，也可开展样品的RNaseA消化。
如果DNA的下游应用对RNA污染敏感，则需要这一步。
如果纯化的DNA需要通过分光光度计定量，也需要RNaseA消化，因为RNA污染也会贡献吸光值读数，导致DNA产量的过高估计。
为了提高标准化和便利性，QIAampDNAFFPETissueKit所开展的DNA纯化必要时也可在QIAcube®上自动开展。
尽管最佳的裂解和孵育条件可从FFPE样品中释放DNA，部分逆转甲醛修饰，但对于纯化后DNA的下游分析，仍有一些限制。
首先，固定过程中的化学修饰可能引入不想要的序列变化，降低DNA稳定性和酶学分析的效率，让A260/A280的纯度分析变得困难。
其次，由于FFPE样品中的DNA随时间而逐渐片段化，故只能分析短序列（例如在PCR应用中，应当设计产生短扩增子的引物）。
此外，较短的DNA片段可能导致DNA产量的过高估计，因吸光值读数更高。
注意：
QIAampDNAFFPETissueKit适用于从福尔马林固定样品中纯化DNA。
它不适用于用其他彻底破坏DNA的试剂固定的样品，如苦味酸。
3全基因组扩增
FFPE样品的珍贵特性意味着只有少量DNA能够纯化，这限制了我们能够开展的分子分析的数量。
DNA样品量的增加可通过全基因组扩增（WGA）来实现，其中整个基因组是利用一种高度进行性的DNA聚合酶扩增的。
然而，从FFPE样品中片段化的DNA开始时，这是一个挑战。
REPLI-g®FFPEKit采用了一种改进的WGA方法，实现了FFPE样品中基因组DNA的扩增，且不需要预先的DNA纯化。
片段化DNA先随机连接，形成更高分子量的DNA分子。
随后利用一种高度进行性的DNA聚合酶来开展WGA。
尽管DNA片段未按照正确的顺序拼接，但假如分析方法稍作修改，还是能在某些应用中实现可靠的DNA分析。
例如，如果引物设计成产生尽可能短的扩增子，那么可开展PCR和实时定量PCR分析（图9）。
尽管数据显示了358bp片段的成功PCR扩增，但我们建议PCR分析的扩增子在100bp左右，因为FFPE样品中的DNA严重片段化，且甲醛修饰会减少可读取DNA序列的长度。
图9.利用FFPE组织中的基因组DNA开展的可靠PCR和实时定量PCR。
A6个人肝脏FFPE样品（11年）经过REPLI-gFFPEKit的全基因组扩增。
产生的DNA样品随后用于终点PCR，利用QIAGENFastCyclingPCRKit在Eppendorf®Mastercycler®epgradientS上开展，以扩增358bp的序列。
1-6：
DNA样品；N：
无模板对照；M：
marker。
B2个人肝脏FFPE样品（11年）经过REPLI-gFFPEKit的10次独立全基因组扩增反应。
随后利用QuantiFastSYBRGreenPCRKit和Stratagene®Mx3005P®循环仪开展实时定量PCR，以扩增100bp的序列。
4亚硫酸氢盐转化
表观遗传学DNA甲基化分析中的第一步是开展亚硫酸氢盐转化，其中未甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶。
由于甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸氢盐转化的影响，故可通过PCR或实时定量PCR来检测，或焦磷酸测序（Pyrosequencing®）来检测和定量。
然而，亚硫酸氢盐转化需要在高温和低pH值下孵育，因此可能发生DNA的片段化。
在研究来自FFPE样品的早已严重片段化的DNA时，这可能是个问题。
EpiTect®PlusFFPEBisulfiteKit具有一些独特之处，可实现FFPE样品中DNA的最佳回收，并提供最大程度的亚硫酸氢盐转化，而不会导致DNA进一步降解。
首先，此试剂盒采用一种优化的脱蜡步骤，它能最大限度地减少操作，节省时间，并尽可能提高DNA产量。
在脱蜡之后，样品先用蛋白酶K在56°C处理30分钟，通过消化交联蛋白而释放DNA。
之后在一种新颖的缓冲液中95°C孵育1小时，以部分逆转交联：
在孵育过程中，氨基之间的亚甲基桥断裂。
尽管过度加热会导致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在95°C孵育1小时可实现基因组DNA的最佳回收，DNA无需进一步纯化，可直接用于亚硫酸氢盐转化步骤。
通过创新的DNA保护技术，可防止亚硫酸氢盐转化过程中的化学DNA降解。
图10.FFPE样品中的DNA经亚硫酸氢盐转化之后的PCR分析。
利用EpiTectPlusFFPEBisulfiteKit或供应商Z的同类试剂盒从大鼠FFPE肝脏组织（10μm）中纯化DNA。
A利用PyroMark®PCRKit开展终点PCR，以检测指定的基因。
琼脂糖凝胶分析表明，利用EpiTectPlusFFPEBisulfiteKit纯化得到的模板，比同类试剂盒相比产量更佳且高度一致。
B利用QuantiTectSYBRGreenPCRKit开展实时定量PCR反应，以检测GSTP基因的2个大小不同的扩增子（156和279bp）。
每个反应在4个样品上开展，重复三次。
左边的扩增子曲线表明，利用EpiTectPlusFFPEBisulfiteKit纯化得到的模板，两个扩增子的CT值都较低，且结果高度重复。
而利用同类试剂盒纯化得到的模板，只有156bp片段成功扩增，且CT值较高（右）。
5总RNA和miRNA的纯化
甲醛修饰会影响FFPE样品中的DNA，这个问题也同样适用于RNA。
全新经过优化的RNeasyFFPEKit和miRNeasyFFPEKit都是专门为FFPE样品的RNA纯化而设计的（图11和12）。
由于RNA在热处理时更容易片段化，故试剂盒使用了经过优化的缓冲液条件，并降低了孵育温度。
尽管80°C以上的孵育会略微改善RNA在RT-PCR中的表现，但它还是会导致更多RNA片段化。
同时，在较低温度下孵育会导致产量较低，且RT-PCR表现明显变差。
FFPE样品先用蛋白酶K在56°C消化15分钟，以便从交联的蛋白分子中释放RNA分子，之后在80°C孵育15分钟，以逆转一些甲醛修饰。
接着，为避免DNA污染，特别是去除有可能干扰下游分析（如实时定量RT-PCR）的痕量DNA小片段，用DNaseBooster和DNase处理RNA。
在接下来的步骤中，利用RNeasyMinElute离心柱纯化RNA，其中RNA经过结合、洗涤，最终洗脱在15-30μl无RNase的水中。
取决于结合条件，低至70nt的总RNA（RNeasyFFPEKit）或包含低至18nt的miRNA的总RNA（miRNeasyFFPEKit）被纯化。
鉴于RNA的片段化性质，尝试纯化单独的、富含小RNA的部分是不切实际的。
为了提高标准化和便利性，RNeasyFFPEKit和miRNeasyFFPEKit所开展的RNA纯化必要时也可在QIAcube上自动开展。
图11.来自FFPE样品的RNA的实时定量RT-PCR分析。
利用RNeasyFFPEKit从大鼠肾脏中纯化总RNA。
在Rotor-Gene®Q循环仪上开展PGK1（磷酸甘油酸激酶1）的实时定量RT-PCR分析，加（+RT）或不加（-RT）逆转录酶。
-RT曲线证明了利用RNeasyFFPEKit纯化的RNA几乎不含基因组DNA。
图12.从FFPE组织中高效纯化miRNA。
大鼠肝脏组织用福尔马林固定24小时或60小时，接着用miRNeasyFFPEKit纯化包括miRNA在内的总RNA。
纯化所得的RNA作为模板，并利用miScriptPCRSystem开展实时定量RT-PCR，以检测miR-16和miR-29a以及较大的PGK1基因mRNA。
结果表明了同一洗脱液中miRNA以及mRNA的成功检测。
6蛋白的纯化
与核酸不同，FFPE样品中的蛋白不会遇到片段化的问题。
因此，全长蛋白的分离是可以实现的。
然而，从FFPE样品中抽提蛋白时，也会面临一些重要的问题。
首先，如果下游应用需要样品裂解液，而不是高度纯化的蛋白，则石蜡的彻底去除是必需的。
其次，蛋白酶K和高度变性剂不能用来断开福尔马林交联，因为它们会导致蛋白降解。
蛋白纯化的效率受到切片厚度的影响。
我们建议样品厚度在10-15μm。
产量取决于切片中组织的量和组织的性质。
肝脏组织的3块10μm切片的一般产量为1.5μg/μl，而大脑组织为1.6μg/μl。
QproteomeFFPETissueKit利用专利技术从FFPE样品中高效回收全长蛋白。
在二甲苯多次处理去除石蜡后，组织切片在优化的提取缓冲液中孵育2次。
第一次是100°C、20分钟，以逆转福尔马林交联。
第二次是80°C、2小时，以确保蛋白溶解度最高。
最终获得了100μl包含蛋白的裂解液，适用于质谱和westernblot分析等应用（图13）。
图13.乳腺癌活检中HER2的检测。
利用QproteomeFFPETissueKit处理8个FFPE乳腺组织，并通过SDS-PAGE分离蛋白。
在westernblotting之后，与HER2（上图）或β-actin（下图，对照）抗体杂交
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