生物细胞分离原理及技术思考题南通大学.docx

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生物细胞分离原理及技术思考题南通大学

生物细胞分离原理及技术思考题

1生物分离工程在生物技术中的地位？

是生物技术下游加工过程。

2生物分离工程的特点是什么？

生物产品的多样性决定了分离方法的多样性与复杂性；

绝大多数生物分离方法来源于传统的化工分离方法；

生物分离一般比化工分离难度大；

分离过程的成本占产品总投资的大部分。

3生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？

不溶物的去除：

过滤，离心，细胞破碎

产物粗分离：

离子交换吸附，萃取（溶剂萃取，反微团萃取，超临界流体萃取，双水相萃取）

产品的纯化：

色谱，电泳，沉淀

产品的径直：

结晶，干燥

4在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？

产品价值

产品质量

产物在生产过程中出现的位置

杂质在生产过程中出现的位置

主要杂质独特的物化性质是什么？

不同分离方法的技术经济比较

5常用的细胞破碎方法有哪些

机械破碎：

高压匀浆破碎，珠磨破碎法，超声波破碎法

以下为非机械法

物理破碎：

渗透压冲击，冻结和融化，干燥法

化学破碎：

酸碱处理法，表面活性剂（增溶），有机溶剂，EDTA螯合剂

酶促破碎：

外加酶法，自溶酶法

6在选择细胞破碎方法时需要考虑哪些因素？

细胞处理量；

细胞壁强度和结构（高聚物交联程度、种类和壁厚度）；

目标产物对破碎条件的敏感性；

破碎程度；

目标产物的选择性释放

7基因工程包涵体的纯化方法。

收集菌体细胞；细胞破碎；包涵体洗涤；目标蛋白的变性溶解；目标蛋白的复性。

8什么是萃取过程？

液－液萃取从机理上分析可分为哪两类？

其理论收率如何计算？

利用物质在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的。

物理萃取和化学萃取；

9常见物理萃取体系由那些构成要素？

原溶剂，溶质，萃取剂，萃取相，萃余相

10何谓萃取的分配系数？

其影响因素有哪些？

一种物质在两相系统中的分配行为可用分配系数来描述，分配系数K为该物质在上相和下相中的浓度之比。

K=y/x（y为平衡时溶质在轻相中的浓度；x为平衡时溶质在重相中的浓度。

）

pH；温度；乳化；盐析；有机溶剂的选择

11pH对弱电解质的萃取效率有何影响？

pH影响弱电解质的分配系数（pH--K）

a）弱酸性物质的K值随pH降低而增大，弱碱性物质的K值随pH增大而增大

b）pH低有利于弱酸性物质分配在有机相，碱性物质分配在水相。

12发酵液乳化现象产生原因与影响？

如何消除乳化现象？

表面活性物质聚集在两相界面上，使表面张力降低。

（表面活性剂分子的亲水基团伸向水中亲油集团伸向油中。

）

发酵液乳化的原因：

a蛋白质的存在，起到表面活性剂

b固体粉末对界面的稳定作用

影响：

有机相和水相分相困难，出现夹带，收率低，纯度低。

消除：

物理法：

离心、加热，吸附，稀释

化学法：

加电解质、其他表面活性剂

*转型法

加入一种乳化剂，条件：

①形成的乳浊液类型与原来的相反，使原乳浊液转型

②在转型的过程中，乳浊液破坏，控制条件不允许形成相反的乳浊液，

*顶替法

加入一种乳化剂，将原先的乳化剂从界面顶替出来：

①形成的乳浊液类型与原来的一致

②它本身的表面活性>原来的表面活性

③不能形成坚固的保护膜。

13何谓超临界流体萃取？

其特点有哪些？

超临界流体（SCF）即处于临界温度、临界压力以上的流体。

在临界温度、压力以上，无论压力多高，流体都不能液化但流体的密度随压力增高而增加。

特点：

密度接近液体；萃取能力强；粘度接近气体；传质性能好

14何谓双水相萃取?

常见的双水相构成体系有哪些？

双水相萃取是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的方法

非离子型高聚物－非离子型高聚物：

PEG－DEXTRAN

非离子-离子型聚电解质两相系统：

聚乙二醇NaCl-DEAE葡聚糖盐酸盐

离子型高聚物-离子型高聚物：

羧甲基纤维素钠-羧甲基葡聚糖钠

高聚物－无机盐（盐析作用）：

PEG－硫酸铵

15反胶团的基本结构？

反胶团萃取的基本原理是什么？

反胶团（ReverseMicelle）是表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体。

表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”

反胶束萃取技术是利用表面活性剂在有机溶剂中自发形成一种纳米级的反胶束相来萃取水溶液中的大分子蛋白质。

蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观两相（有机相和水相）界面间的表面活性剂层同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。

16什么是吸附分离，影响吸附的主要因素？

吸附分离是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面，而从混合物中的分离的的过程。

1吸附剂的性质：

吸附容量（比表面积，空隙度）

⏹吸附速度（粒度大小，孔径分布）

⏹机械强度（使用寿命）

⏹极性

2吸附质的性质:

①能使表面张力降低的物质，易为表面吸附

②溶质在易溶解的溶剂中吸附量小

③极性吸附剂易吸附极性物质

④同系物极性越小，越易被非极性吸附剂吸附

3.溶液pH（影响吸附质的解离度）

4.温度（吸附热，大部分吸附是放热过程，吸附质的稳定性，溶解度）

5.盐浓度（影响复杂，促进/阻止/互不影响，要视具体情况而定）

17亲和吸附的原理和特点是什么？

亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分离的技术。

该吸附作用不同于依靠范德华力的传统吸附和依靠静电相互作用的离子交换吸附。

配基固定化→吸附样品→样品解析

特点：

效率高：

利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。

分离精度高：

可用于分离含量极低，结构相近的化合物

通用性较差，洗脱条件苛刻

18间歇吸附的相关计算

19色谱方法共分几类？

并简述其工作原理

a）吸附色谱：

目标物与杂质与吸附剂之间吸附力的不同

b）分配色谱：

目标物与杂质在两液相分配系数的不同

c）离子交换色谱：

目标物与杂质对离子交换树脂化学亲和力的不同

d）凝胶色谱：

目标物与杂质的分子大小和形状的不同

色谱分离法是一组相关分离方法的总称，它的机理是多种多样的，但不管哪种方法都必须包括两个相。

一相是固定相，通常为表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。

当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离，或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而得到逐步分离。

20何为理论塔板高度和理论塔板数？

如何计算？

理论塔板高度：

流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高

理论塔板数：

反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系

理论塔板数的计算方法：

理论塔板高度：

21、常用的蛋白质沉淀方法有哪些？

盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法;选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）;非离子多聚体沉淀法（不确定是不是）

22、简述盐析的原理。

首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态（亲水胶体）：

¡两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系

¡蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞

当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：

（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大；

（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：

¡盐离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；

¡中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。

23、影响盐析的主要因素有哪些？

溶质种类的影响：

不同溶质具有不同的Ks和β值，组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。

溶质浓度的影响：

a）蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；

b）蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高，但回收率低；

c）蛋白质的含量一般控制在2-3%

pH值：

影响蛋白质表面净电荷的数量，从而影响蛋白质的溶解度

通常调整体系pH值，使其在pI附近时进行盐析；

盐析温度：

一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而

24、简述有机溶剂沉析的原理。

原理：

（1）静电作用：

降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。

（2）脱水作用：

由于水溶性有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

25、简述等电点沉析的原理。

原理：

蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。

26、膜分离技术的概念。

膜分离的概念：

利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。

27，根据膜孔径大小，膜分离技术可分为哪几类？

微滤、超滤、纳滤、反渗透，电渗透，透析

28，主要的膜组件有哪些？

膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这些部件的容器

29，微滤，超滤，纳滤，反渗透分离技术的特点，及适用范围？

过程

膜结构

驱动力

应用对象

实例

微滤

对称微孔膜

0.05-10μm

压力差

消毒、澄清收集细胞

培养悬浮液除菌，产品消毒，细胞收集

超滤

不对称微孔膜

１-５0nm

压力差

大分子物质分离

蛋白质的分离/浓缩/纯化/脱盐/去热源

纳滤

复合膜＜1nm

压力差

Donna效应

小分子物质分离

糖/二价盐/游离酸的分离

反渗透

致密膜、复合膜＜1nm

压力差

小分子物质浓缩

单价盐/非游离酸的分离

透析

对称的或不对称的膜

浓度差

小分子有机物/无机离子

除小分子有机物或无机离子

电渗析

离子交换膜

电位差

离子脱除、氨基酸分离

海水淡化，纯水制备，生产工艺用水

微滤、超滤、纳滤、反渗透相同点：

①以膜两侧压力差为推动力；②按体积大小而分离；③膜的制造方法、结构和操作方式都类似。

微滤、超滤、纳滤、反渗透区别：

1膜孔径：

微滤0.1-10m>超滤0.01-0.1>纳滤0.001-0.01m>反渗透小于0.001m

2分离粒子：

微滤截留固体悬浮粒子，固液分离过程；超滤、纳滤、反渗透为分子级水平的分离；

3分理机理：

微滤、超滤和纳滤为截留机理，筛分作用；反渗透机理是渗透现象的逆过程：

4压差：

微滤、超滤和纳滤压力差不需很大0.1-0.6MPa

30，简述电渗析膜分离的基本原理。

利用待分离分子的荷点性质和分子大小的差别，以外电场电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；

电渗析器主要组成部分是离子交换膜。

分为阳膜，阴膜。

阳膜只充许阳离子通过而阴离子被阻挡；阴膜只充许阴离子通过而阳离子被阻挡。

31，结晶操作的原理是什么？

结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程,这一过程包括：

a）溶质分子凝聚成固体

b）分子有规律地排列在一定晶格中

这一过程与表面分子化学键力变化有关；因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。

32，饱和溶液和过饱和溶液的概念

饱和溶液：

当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；

过饱和溶液：

溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；（溶质只有在过饱和溶液中才能析出）

33，结晶的一般步骤是什么？

过饱和溶液的形成；晶核的形成；晶体生长

34，过饱和溶液形成的方法有哪些？

热饱和溶液冷却（等溶剂结晶）：

适用于溶解度随温度升高而增加的体系，同时，溶解度随温度变化的幅度要适中；

自然冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）

部分溶剂蒸发法（等温结晶法）：

适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或随温度升高溶解度降低的体系；

加压、减压或常压蒸馏

真空蒸发冷却法

–使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。

–设备简单、操作稳定

化学反应结晶

–加入反应剂产生新物质，当该新物质的溶解度超过饱和溶解度时，即有晶体析出，该方法的实质是利用化学反应，对待结晶的物质进行修饰，

–调节pH值，改变溶质溶解特性而析出

盐析法

–加入某些物质，使溶质的溶解度降低而析出

35，绘制饱和温度曲线和过饱和温度曲线，并标明稳定区、亚稳定区和不稳定区。

36，常用的工业起晶方法有哪些？

自然起晶法：

溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核、当产生一定量的晶种后，加入稀溶液使溶液浓度降至亚稳定区，新的晶种不再产生，溶质在晶种表面生长。

刺激起晶法：

将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定的养晶区使晶体生长。

晶种起晶法：

将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较低浓度，加入一定量和一定大小的晶种，使溶质在晶种表面生长。

37，重结晶的概念

重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。

38，干燥的概念

用热能加热物料，使物料中水分蒸发而干燥或者用冷冻法使水分结冰后升华而除去的单元操作；

39，干燥的基本流程

40，物料中所含水分的种类有哪些？

平衡水分和自由水分的概念

按照物料与水分的结合方式可分为以下三类：

化学结合水:

分与物料的离子型结合和结晶型分子结合（结晶水），结晶水的脱除必将引起晶体的崩溃；

物化结合水:

包括吸附、渗透和结构水分，其中吸附水分结合力最强；

机械结合水:

毛细管水、湿润水分、孔隙水份

按照物料中水分去除难易程度分类：

结合水（包括细胞含水、纤维束含水以及毛细管水）较难以除去；

非结合水（物料表面的湿润水分和孔隙水份）较容易除去

平衡水分：

当一种物料与一定温度及湿度的空气接触时，物料势必会放出或吸收一定量的水分，物料的含水量会趋于一定值。

此时，物料的含水量称为该空气状态下的平衡水分。

平衡水分代表物料在一定空气状态下的干燥极限，即用热空气干燥法，平衡水分是不能去除的。

自由水分：

在干燥过程中能够除去的水分，是物料中超出平衡水分的部分

41，了解干燥曲线，并结合干燥速率曲线说明恒速干燥阶段和降速干燥阶段的特点

恒速干燥阶段：

湿物料表面为非结合水所湿润，物料表面温度是该空气状态下的湿球温度；

此时，传热推动力（温度差）以及传质推动力（饱和蒸汽压差）是一个定值；

因此，干燥速率也是一个定值；

实际上，该阶段的干燥速率决定于物料表面水分汽化的速率、决定于水蒸气通过干燥表面扩散到气相主体的速率。

因此，又称为表面汽化控制阶段。

此时的干燥速率几乎等于纯水的汽化速度，和物料湿含量、物料类别无关；

影响因子主要有：

空气流速、空气湿度、空气温度等外部条件。

降速干燥阶段：

物料湿含量降至临界点以后，便进入降速干燥阶段。

在降速干燥阶段，非结合水以及被蒸发，继续进行干燥，只能蒸发结合水。

结合水的蒸气压恒低于同温下纯水的饱和蒸汽压，传质、传热推动力逐渐减小，干燥速率随之降低；

干燥空气的剩余能量被用于加热物料表面，物料表面温度逐渐升高，局部干燥。

在这一阶段，干燥速率取决于水分和蒸汽在物料内部的扩散速度。

因此，亦称为内部扩散控制阶段，与外部条件关系不大。

主要影响因素为物料结构、形状和大小

42，干燥设备选型的原则是什么？

被干燥物料的性质：

湿物料的物理特性、干物料的物理特性、腐蚀性、毒性、可燃性、粒子大小及磨损性；

物料的干燥特性：

湿分的类型（结合水、非结合水）、初始和最终湿含量、允许的最高干燥温度、产品的色泽、光泽等；

粉尘及溶剂回收

安装的可行性

43，常用的干燥设备有哪些？

厢式干燥设备；气流干燥设备；喷雾干燥设备；流化床干燥设备；红外干燥设备；微波干燥设备；冷冻干燥设备

44，电泳的基本原理

蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。

带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。

45，电泳技术的分类

依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系统

a）移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis）

b）区带电泳（zoneelectrophoresis）

c）稳态电泳（steadystateelectrophoresis）

其中区带电泳又分为：

纸电泳：

载体为滤纸

纤维素电泳：

载体为醋酸纤维素

凝胶电泳：

载体为葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

46，常用的凝胶电泳技术有哪些？

常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）；载体两性电解质pH梯度等电聚焦；双相电泳

47，聚丙稀酰胺凝胶电泳与SDS-PAGE的异同

48，等电聚焦电泳的基本原理

载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。

49，双相电泳的概念及其分离原理

第一相等电聚焦；

第二相SDS－PAGE

目的：

为了获得更详细的组分信息

目前已经广泛应用于蛋白质组研究中