浅论siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用.docx

浅论siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用.docx

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浅论siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用

浅论siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用

　　【关键词】小干扰RNA；反向转染法；正向转染法；原代细胞；悬浮细胞

　　RNA干扰，小鼠淋巴细胞分离液，RPMI1640培养基，OptiMEM无血清液体培养基，小牛血清，LipofectamineRNAiMAX（Invitrogen公司），Cy3荧光标记的siRNA片段，24孔板，荧光倒置显微镜，流式细胞仪。

　　研究方法

　　小鼠脾淋巴细胞收集

　　断颈处死小鼠，75%乙醇浸泡2～3min,无菌超净台内取出脾脏，将200目无菌不锈钢筛网置于60mm平皿中，加入适量Hank′s液，脾脏剪成碎块置筛网内，无菌玻璃注射器活塞轻柔研磨，使得分散的单细胞透过筛网进入Hank′s中；Ficoll密度梯度离心法分离淋巴细胞，用PBS将所得细胞沉淀洗涤两遍，重悬于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，计数及台盼蓝染色计算活细胞数。

　　细胞转染

　　实验共分为3组。

实验组采用反向转染法，①每孔加Cy3siRNA　μl至不含血清的OptiMEM简化培养基200μl中稀释；②用前摇匀RNAiMAX,取3μl至每孔中，与①液轻柔混匀成为转染复合物，室温孵育20～30min；③用不含抗生素的RPMI1640完全培养基稀释细胞，每孔细胞悬液为400μl，整细胞数为×106，加入②液中，轻微前后推动平板使其混匀，每组设复孔。

对照组按照传统的正向转染法操作，先将细胞在孔板中孵育24h后再加入转染复合物，所加物质用量及浓度与实验组完全相同。

空白组未转染siRNA细胞。

将3组细胞均置于5%CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养，于4～6h后更换含10%小牛血清的完全培养基。

　　细胞活性测定

　　转染后24h每组细胞各取1×106，分别用%的台盼蓝染色5min后,随机各选取3个视野,显微镜下计数所有细胞。

以下列公式计算细胞存活率：

细胞活性=（总细胞数-着色细胞数）/总细胞数×100%。

实验平行重复3次。

　　细胞生存状态观察

　　转染后24h倒置显微镜下每组随机取3个视野观察各组细胞，从细胞形态、细胞膜完整性、细胞数目等方面评估生存状态。

　　荧光倒置显微镜观察转染效果

　　转染后24h，荧光倒置显微镜观察各组Cy3siRNA转染细胞的荧光携带率。

Cy3为红色荧光标记物，应用Cy3siRNA转染小鼠淋巴细胞后，根据细胞内红色荧光的数量来判断转染阳性细胞的数量［5］。

于可见光下固定一个视野,计数细胞总数,转换荧光光源计数携带红色荧光的细胞数,转染效率＝有荧光表达的细胞数/细胞总数×100%,每组选取3孔细胞，每孔细胞随机选择5个观察视野，重复3次。

　　流式细胞仪检测转染效率

　　转染后24h实验组和对照组各取1×106细胞，4℃PBS洗细胞2次。

流式细胞仪计数发红色光的细胞数，计算转染效率。

　　统计学处理采用配对t检验比较两种转染方法转染效率的差异，SPSS软件进行统计分析，表示差异有统计学意义。

　　2结果

　　细胞活性测定

　　细胞转染后24h台盼蓝拒染率计算结果显示：

实验组细胞活性为%，对照组和空白组分别为%和%，3组之间细胞活性比较差异无统计学意义。

见图1。

　　细胞生存状态观察

　　倒置显微镜下观察比较转染后24h实验组、对照组和空白组之间细胞生存状态，结果显示3组无明显差异。

　　荧光显微镜下细胞荧光表达率

　　实验组和对照组细胞内均可见红色荧光，实验组带有红色荧光的细胞数量明显多于对照组，空白组无荧光信号；实验组与对照组经重复实验得到平均转染率分别为%和%，表明实验组较对照组转染效率高，差异有统计学意义。

见图2，表1。

表1实验组和对照组的转染效率

　　流式细胞术检测转染效率

　　转染后24h，实验组和对照组的Cy3siRNA对小鼠淋巴细胞的转染效率分别为63%和29%，实验组转染效率明显高于对照组。

见图3。

　　3讨论

　　高效的siRNA转染是研究基因沉默是否成功的前提。

目前，RNAi由于转染效率低而成为其发展的瓶颈并限制其进一步应用［6］。

所以选择最合适的转染方法是整个实验非常重要的一步。

siRNA转染的方法很多，磷酸钙沉淀法虽然操作简便，但转染效率低，重复性差；电穿孔法适用于所有细胞，电压越高，转染效率越高，而细胞的存活率越低，成功的电穿孔均伴随高水平的细胞毒性,因此其应用受到了限制；DEAE葡聚糖多用于DNA分子的转染，仅限于瞬时转染，且一般只用于BSC1,CV1,COS细胞系；显微注射法是用微吸管吸取siRNA溶液,在显微镜下准确的插入细胞核中,将siRNA注射进去，转染率高,对细胞无药物毒害,但是技术要求高，操作繁琐耗时,工作效率低,装置昂贵；阳离子脂质体在克服细胞屏障方面与病毒相似，容易透过细胞膜，而且操作简便，容易实施，在各种体外培养细胞的RNA干扰实验中得到了广泛的应用，但对于原代细胞、悬浮细胞仍存在转染效率低的情况［7］；逆转录病毒法适用于各种细胞，转染效率高，但构建病毒载体耗时长且价格昂贵，尤其不适合于有效片段的筛选实验［8］，并且需考虑安全因素。

以上方法均有其优缺点，通过对各种转染方法的综合考虑，本实验选用脂质体为媒介转染小鼠脾淋巴细胞，基于其在采用传统正向转染法时对原代悬浮细胞存在转染效率较低的现象，我们应用反向转染法克服这一困难，把提高转染效率作为实现高效沉默靶基因的基础。

　　转染效率除了由转染方法所决定外，转染细胞状态和siRNA剂量、转染试剂的选择、转染复合物的孵育时间、培养液中血清和抗生素含量等也是影响转染效率的重要因素。

本实验在以上条件参数恒定和规范操作的基础上，提取小鼠脾淋巴细胞，选用脂质体LipofectamineRNAiMAX介导转染小鼠淋巴细胞，RNAiMAX比Lipofectamine2000细胞毒性小，转染悬浮细胞效果更好；并用荧光素Cy3标记siRNA，使转染情况在镜下直接可见,从而提高实验的准确性。

反向转染法与传统正向转染法的区别［9］是传统方法需在转染前一天接种细胞铺板，培养24h后再加转染复合物转染；而反向转染则是先加入转染试剂和siRNA混合物在培养板上共同温育数十分钟，然后加入细胞铺板培养，其优点在于：

①节约培养时间，淋巴细胞体外存活时间有限，可为转染后检测提供充足的时间和保持细胞良好的生存状态；②操作程序简便，避免传统正向转染方法培养条件的频繁变化对细胞表达可能产生的影响；③转染效率高，对于原代悬浮细胞可实现高效转染，从而使干扰效果比传统方法更好。

1小时即可完成转染，快速、省时并且操作方便。

实验在转染后24h台盼蓝染色检测各组细胞活性、显微镜下观察各组细胞生存状态；从荧光显微镜及流式细胞仪两方面检测转染效率。

　　在其他实验条件相同的情况下，实验组与对照组的转染效率分别为%和%，说明反向转染得到的RNA转染效果比传统转染方法更好，对于原代细胞、悬浮细胞这一类难以转染的细胞也能得到较为理想的转染效果，值得一试。

同时，转染24h后实验组、对照组及空白组台盼蓝染色细胞活性分别为%，%和%，显微镜下细胞生存状态亦无明显差异，提示该方法细胞毒性较低，操作过程对细胞损伤较小，对于原代悬浮细胞有着很好的应用前景，为siRNA转染原代悬浮细胞及应用RANi技术进行体外研究提供了实验依据。

【参考文献】

　　［1］BiF，LiuN，FanD.SmallinterferingRNA：

anewtoolforgenetherapy［J］.CurrGeneTher,2003,3（5）：

411-417.

　　［2］ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells［J］.Nature,2001,411（6836）：

494-498.

　　［3］EcheverriCJ，PerrimonN.HighthroughputRNAiscreeninginculturedcells：

auser′sguide［J］.NatRevGenet，2006，7（5）：

373-384.

　　［4］LaPanP,ZhangJ,PanJ.etal.Quantitativeoptimizationofreversetransfectionconditionsfor384wellsiRNAlibraryscreening［J］.AssayDrugDevTechnol，2008，6：

683-691.

　　［5］ErfleH,SimpsonJC,BastiaensPI,etal.siRNAcellarraysforhighcontentscreeningmicroscopy［J］.Biotechniques，2004，37（3）：

454-458.

　　［6］ErfleH,NeumannB,LiebelU,etal.Reversetransfectiononcellarraysforhighcontentscreeningmicroscopy［J］.NatProtoc，2007，2

（2）：

392-399.

　　［7］宋尔卫.RNA干扰的生物学原理与应用［M］.北京：

高等教育出版社,2005.

　　［8］BrummelkampTR，BernardsR，AgamiR.StablesuppressionoftumorigenicitybyvirusmediatedRNAinterference［J］.CancerCell，2002,2：

243-247.

　　［9］FujitaS,OtaE,SasakiaC,etal.HighlyefficientreversetransfectionwithsiRNAinmultiplewellsofmicrotiterplates［J］.JBiosciBioeng，2007,104（4）:

329-333.