天津城市建设学院学生科技活动基金申请书.docx
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天津城市建设学院学生科技活动基金申请书
天津城市建设学院学生科技活动
资助项目基金申请书
申报类别
课题名称
项目负责人
负责人所在系别
指导教师
填表日期
天津城市建设学院大学生科技创新活动领导小组
天津城市建设学院学生科技活动资助项目基金申请书
一、简表
研究项目
名称
学科领域
研究形式
A.学生独立B.教师指导
C.教师主持项目的部分
起始时间
完成时间
申请经费
申请者姓名
性别
出生年月
专业年级
课题组
总人数
指导教师姓名
职务职称
合作者姓名年级专业
二、立论依据：
（项目研究的意义，国内外研究现状分析）
杯芳烃（Calixarene）是一类受欢迎的多样化的大环化合物，因其具有环糊精和冠醚相似的性质，故被誉为继环糊精、冠醚之后出现的“第三代超分子”主体化合物。
它是由对位取代的苯酚单元（如对叔丁基苯酚，间二苯酚等）和甲醛通过亚甲基在酚羟基邻位连接而构成的环状低聚物。
其结构的上缘是具有疏水的空穴，而下缘则排列着数个羟基，形成环型酚羟基围成的亲水端。
同时对中性分子，离子都有包容能力。
更为重要的是杯芳烃具有多个反应活性点，容易进行各种化学修饰，可制得多种杯芳烃衍生物。
二十年来有关杯芳烃的合成、性能及其应用得到了充分的重视与发展[4]。
随着主客体化学从单点识别发展到多重识别，或是从多点识别向正向不对称性识别方向发展[5],杯芳烃的合成逐步走向功能化发展[6]。
近几年，国内外的化学家对杯芳烃在医药[7]、化学传感器[8，9]、分析分离与测定[10，11]、有机催化与合成[12]、材料学[13]、热力学[14]等领域的物理、化学性质及其应用进行了广泛深入的研究与开发，并取得了许多令人瞩目的成果。
美、日、德、英等国化学家先后就其合成与性能开展了系列研究,并在配合物[15]、分析化学[16]、分子识别[17]、分子催化[18]等领域的应用中取得了突破性进展。
国内的研究起步于90年代初期，中科院化学所等单位开展了一系列有关杯芳烃的研究并取得了一些有价值的研究成果[19]。
与此同时，相对于其他超分子化合物来说，杯芳烃则具有更加良好的特性。
例如：
1、杯芳烃类化合物是一类合成的低聚体,其空穴结构大小具有可调性；2、它可从酚轻基上进行衍生反应,也可在苯环上进行反应,所以可获得众多的衍生物；3、它能与离子、中性分子形成主客体包合物,；4、它的热稳定性及化学稳定性很好,可溶性虽较差,但这各有利弊的一面,通过衍生化之后,某些衍生物具有很好的溶解性；5、它的合成是较为简单的,可望获得较为价廉的产品。
独特的空穴结构，有着特殊的物化性能。
因此杯芳烃类化合物在人工酶、传感器、光电材料等多方面得到了广泛的应用，具有广阔的发展前景。
基于杯芳烃化合物的各种优点，我们设想利用接有枝状化合物的杯芳烃衍生物来实现荧光共振能量转移效应。
荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）是运用荧光蛋白、传统有机染料和其它染料作为探针来研究蛋白构像、蛋白相互作用的一种有用的技术，能检测到小于纳米的距离变化【1-5】。
FRET是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。
当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。
FRET通过易于检测的荧光共振能量转移的效率信息来反映两分子团的距离信息。
通过FRET效率的增强可检测分子间发生相互作用或构象改变而靠近；FRET效率的减弱可用于证明两分子远离而失去相互作用，或证明一个分子的两个部分间因分子被切断或构象改变而相互远离。
由于FRET能够提供分子间的距离、方向（定位）和动力学特征的信息，更好地回答有关分子距离数量级的问题。
到目前为止FRET技术仍然是研究分子尤其是蛋白质相互作用比较成熟，应用广泛的几种方法之一。
从理论上讲，在分子水平上研究任何生物学机制都可以运用FRET技术，关键在于找到合适的荧光探针和检测设备以及如何减少和排除非特异信号的干扰以提高对极低水平信号的探测，并需要解决各种不同的探针体系与蛋白质的偶联问题。
FRET研究中常用的探针主要有：
荧光蛋白、传统有机染料、镧系染料和量子点。
现今FRET方法的发展，需要解决的一个问题,就是要选择合适的能量供-受体对,并且能够将其标记到研究对象（生物大分子）上。
作为超分子主体分子，杯芳烃是由酚类物质与醛或酮借助缩合反应而得到的一类环状低聚物，其锥形结构底部（下沿）紧密而有规律地排列着数个亲水性的酚羟基,杯口部（上沿）带有疏水亲油性的取代基团,中间拥有一定尺寸的空腔,使得杯芳烃既可以输送阳离子,又可以与有机中性分子、阴离子借氢键等非超分子作用形成主客体分子。
该类化合物易于化学改性与修饰,利用芳环上不同基团及芳环不同部位的活性，通过置换、取代等化学反应导入或衍生出具有特殊功能的官能团,来改善杯芳烃的自身缺陷并增强整体分子的选择性。
因此利用杯芳烃作为桥连基团来制备FRET荧光复合探针有望增强能量转移过程中的转移效率，提高检测水平和解决FRET荧光探针与蛋白质的偶联问题。
目前，杯芳烃的改性及其衍生物的合成已有大量文献说明，我们想通过杯芳烃的改性将其与枝状化合物相连，研究其与染料的构效关系将染料包裹在杯芳烃和枝状化合物内而促使FRET效应的产生，这样不仅解决了有机染料光谱干扰的问题，也省去了在杯芳烃上接量子点的繁琐。
此外，还可以将药物分子装载于杯芳烃的空腔内，从而实现对药物在体内的动态跟踪。
树枝状聚合物是通过支化单元逐步重复反应得到的具有树枝状、高度支化结构的大分子，反应每重复一次，活性基数目和分支就增加一倍，即繁衍一次，相应地树枝状大分子就增加一代，树枝状大分子的繁衍度以代数（Gn）表示。
其组成一般具有以下共性：
①中心核区域；②辐射状连接中心核的分支单元组成的内部区域；③由大量端基官能团组成的外层。
树枝状聚合物的组成和合成过程决定了其具有精确的分子结构、高度的几何对称性、大量的表面官能团、分子内存在空腔、分子量具有可控性和分子本身具有纳米尺寸等特性。
从二十世纪八十年代，这种具有紧密类球型结构和多官能团的树枝状聚合物（Dendrimer）逐渐成为了研究热点。
随着对树枝状聚合物不断深入地研究，发现当分子代数达到4代（G4）以上时，此类本身具有核-壳结构的化合物通过改性能够形成软核硬壳框架被称为“树枝形盒（dendriticbox）”结构，能将客体分子拓扑捕获至其内部空腔中[19]。
这样伴随着树枝状聚合物的发展，能够形成“树枝形盒”的物质种类也在不断丰富。
我们考虑将树枝状化合物与杯芳烃母体相连，并同时在杯[4]芳烃内和枝状化合物内包裹染料望其促成FRET效应的产生。
同时研究枝状化合物的pH敏感，通过调节pH控制枝状化合物的开合，使其产生靶向。
树枝状聚合物的末端带有很多活性官能团，可以与多个同种的配体分子相连；树枝状聚合物与多个配体分子相连后，具有对靶细胞的多价结合力，使得靶向的特异性大为提高。
如QUINTANA等人将叶酸与PAMAM树枝状聚合物偶联后作为肿瘤细胞的靶向配体，再与抗肿瘤药甲氨蝶呤（methotrexate）偶联，大大提高了药物对肿瘤的靶向性，而该复合物对肿瘤细胞的细胞毒性比单体药物甲氨蝶呤提高了100倍。
而研究表明肿瘤部位的pH低于正常组织。
因为肿瘤增生很快，它的脉管系统供给的营养及氧并不能充分满足它扩张细胞数量的需要。
这就导致了各种实体瘤与周围组织代谢环境的区别。
在很多肿瘤中研究发现，缺氧导致能量不足，从而产生乳酸及ATP水解产物，则酸性增加，本课题拟设计只可在酸性条件下将空腔打开的枝状化合物，并将其与杯芳烃相连。
杯芳烃和枝状化合物均有空腔，利用价值增大。
树枝状聚合物是Tomalia等人[24]发现的一种合成的球状高分枝的纳米尺寸的大分子。
它的高分散性，大表面积及水溶性，使得它在药物传递和生物医学的应用上有很大的吸引力。
通过对树枝状聚合物的核、分枝及外周的修饰使其具有各种物理性质而具有很多应用。
使树枝状聚合物具有刺激敏感特性，则对于拓宽其在药物传递和生物医学的应用具有深远的意义。
合成的树枝状的单体2,2-二羟甲基丙酸聚酯几乎是万能药物载体[20]。
已有研究将阿霉素连接到具有pH-敏感性的这种载体上，这就表明了利用这些聚酯树枝状聚合物制备聚合物-药物偶联物（结合物，缀合物）的可行性。
树枝状聚合物是通过一些基团与阿霉素连接的。
与聚合物相连的酰胺键对于酸催化水解非常稳定，而阿霉素的酮基可以用来形成对酸敏感的腙键。
合成的化合物显现出优良的水溶性并成为进一步生物学评估的候选者。
还有一种新途径已被研究出来，即利用聚氧乙烯-树枝状聚合物（PEO-dendrimer）作为骨架来制备对酸敏感的胶束[21]。
它将疏水基团利用对酸敏感的乙缩醛键连接到核心成分的外围，当键水解时，疏水基团掉下来，核心变为亲水性，胶束的稳定性降低，被包封在胶束中的药物释放出来。
PEO-dendrimer骨架的分步合成实现了对多聚体结构的很高程度的控制。
也就控制了它的许多性质,例如胶束破裂的比率，临界胶束浓度及胶束的大小。
这一方法已经用于阿霉素向肿瘤部位的靶向传递。
开展此研究的意义在于：
通过研究杯芳烃及树枝状化合物和染料的构效关系将染料包裹在杯芳烃和枝状化合物内，可将其分子间距离控制在10nm之内，得到具有FRET效应的杯芳烃-染料复合物，此复合物的溶解性及与生物分子的结合仅仅取决于杯芳烃的结构及其衍生化反应。
因此，有望同时解决FRET荧光探针应用过程中的溶解性问题及与各类生物分子的偶联问题。
通过对枝状化合物pH敏感效应的研究，并结合枝状化合物的靶向特异性，并叶酸或抗原抗体进一步对杯芳烃进行修饰，使达到其靶向送药的结果。
此项研究有望提高荧光探针特异性标记癌细胞的应答水平，从而为实现癌细胞的识别、定位及特性可视化提供一种有益尝试和工作基础。
并可以通过瞬态荧光光谱研究复合探针体系对典型癌细胞的靶向标记作用和在作用过程中的荧光强度变化，寻求探针与癌细胞作用的相关性内部信息及动力学特征。
三、研究方案
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题：
1）研究目标：
具有特定空腔的能够包裹染料使其产生FRET效应的“树枝状化合物”—“杯芳烃”聚合物的制备是本项目的研究重点。
此外，研究如何通过pH敏感来控制树枝状化合物端口基团的改性，并以此控制树枝状化合物的靶向作用将是本项目的另一个研究目标。
2）研究内容：
（说明研究工作的具体内容，指出重点应解决的科学和技术应用问题及要达到的技术指标，阐述预期成果应用的可能性和效益，或在学术、社会等方向的价值）
1.有关杯[4]芳烃及其衍生物的合成：
a.间苯二酚杯[4]芳烃微波辅助下的制备及改性：
以间苯二酚为原料在微波辅助下可在短时间内获得大量产物，在此基础上连接长碳链进行下一步反应将其杯上所连基团进行改性得到亲水或疏水性良好的杯芳烃母体。
b.对叔丁基杯[4]芳烃的制备及改性：
对叔丁基杯[4]芳烃要用传统方法制备，反应时间较长，产率较低，但杯上所连基团对叔丁基的性质较好，我们希望能够进一步改进现有的制备叔丁基杯[4]芳烃的方法，并将其改性。
c.对叔丁基杯[6]芳烃的制备及改性：
杯[6]芳烃与杯[4]芳烃类似，同样使用传统加热方法制得，但杯[6]芳烃的产率相对较高，且杯[6]芳烃的空腔也相对较大。
2.杯芳烃与燃料的构效关系及特性研究；
3.选择合适的染料用于FRET特性研究；
4.选择合适的可与杯芳烃相连的树枝状化合物；
5.树枝状化合物的pH敏感。
3）拟解决的关键问题：
（包括拟采用的研究方法、技术路线、实验手段和步骤，及其可行性分析与比较，可能遇到的问题和解决办法）：
a.研究出杯芳烃改性及其有效合成方法
b.探讨杯芳烃与染料的构效关系
c.FRET体系的构建;
d．树枝状化合pH敏感效应条件
2.拟采取的技术路线、研究方案：
3.项目的进度安排：
可行性分析：
1、有关于FRET前人已有相关的研究，并且也报道了相关的研究进展和成果。
王进军等利用FRET原理设计了一种可以检测PKA酶活性的报告蛋白（AKAR）。
它的两端是GFP的衍生物CFP与YFP,利用FRET原理工作，通过对单个细胞YFP荧光强度进行随时间变化的定量分析,可以清楚地反映出EGF诱导的单个细胞PKA酶活性变化大小的动态过程。
Graham等采用绿色荧光蛋白的变种,借助FRET技术,研究了Rac/Cdc42与其效应蛋白之间的相互作用。
与显微术相结合,FRET可以对活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用进行显微成像分析。
Kenworthy利用荧光共振能量转移显微术,结合免疫荧光法,将Cy3和Cy5分别作为供体和受体荧光团,标记到抗体上,对蛋白质-蛋白质相互作用进行成像分析。
Oswald等将两种近红外的荧光染料Sq635和Sq660转化成它们的NHS脂,将其共价结合到HSA和抗HSA上,形成偶联物可以测定蛋白质的浓度。
2、我们已经进入实验室并且开展了一系列有关于杯芳烃及其衍生物的合成与改性的探究性实验。
4.本项目的特色与创新之处：
5.预期的结题形式：
注：
项目结题最终分为三类
优秀：
能够顺利结题，同时在核心刊物发表论文、申请并获得专利、相关媒体报道三者满足一项的项目
合格：
只有结题报告书，且能够顺利结题的项目
不合格：
只有结题报告书，且未通过结题的项目
四、研究基础（完成课题需具备的可行性条件）
1.相关领域参考文献（10条以上）：
2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径：
3.指导教师基本情况、研究领域及成果：
4.项目负责人及成员课堂学习成绩情况：
五、指导教师推荐意见：
（应对申请者的素质和研究能力、课题的意义、研究的条件、方案的先进性、可行性做认真介绍）
推荐人：
专业技术职务：
单位：
六、申请者所在单位的审查与保证
（包括对项目申请书中所述内容的真实性，研究计划的可行性和经费的合理性的审查意见，对申请者开展此项研究所必需的基本条件的保证）
系学生科技活动指导小组组长：
系主任：
年月日（公章）年月日
七、专家评审小组复审意见：
组长签名：
年月日
八、大学生科技活动指导中心审定意见：
主任签字：
年月日
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