细胞外miRNA的发现来源及其生物学功能综述病理学论文基础医学论文医学论文.docx

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　　miRNA是一类长度为18~22个核苷酸的非蛋白编码的单链小分子RNA,广泛存在于真菌、细菌、病毒、植物、哺乳动物等生物体内.miRNA通过调控基因的表达参与细胞的早期发育、细胞增殖、细胞代谢、细胞凋亡等重要的生命过程.近几年,多种生物体液中发现了能稳定存在的miRNA.血浆、尿液或其他体液中细胞外miRNA的异常表达与包括肿瘤在内许多种疾病有着密切关系.然而,目前有关miRNA进入体液的具体分子机制尚不清楚.本文仅就细胞外miRNA的发现、来源及其生物学功能方面做一综述.

　　一、细胞外miRNA的发现

　　最早发现在生物体液中存在miRNA的是Chim及其研究团队.2008年,Chim等[1]在研究中发现,孕期女性的血浆中有来自胎盘的miRNA,确认了孕体血浆中157种miRNA,其中17种miRNA在血浆中的浓度是孕妇外周血细胞的10倍以上并且在产后孕妇血浆中无法检测到.同年,Lawrie等[2]在弥散性B细胞淋巴瘤患者的血浆中检出miR-155、miR-210和miR-21a这三种肿瘤相关的miRNA表达水平比正常对照组有升高,并据此提出将循环miR-NA作为疾病甚至肿瘤诊断标志物的设想.随后,Weber等[3]在血浆、唾液、泪液、尿液、羊膜液、初乳、乳汁、支气管液、脑脊液、腹膜液、胸膜液、精液共12种正常人体液中检测miRNA的存在,结果显示miRNA在以上12种体液中都得以检出,说明miR-NA存在于人体多种体液之中.Zhang等[4]以身体健康的中国人（主食为稻米）为研究对象在其血清与血浆中检测到了外源性的植物miRNA,同时在其他动物的血清中也检测到了植物miRNA.

　　二、细胞外miRNA的来源与运送途径在生物体内的过程

（一）细胞外miRNA的来源血细胞与血浆完全接触,即使很小的血细胞数的变动或者细胞溶血的发生都会改变血浆miRNA的水平,许多被认为可以作为肿瘤标志物的循环miRNA在血细胞中的呈现高表达,因此,可以将血细胞认为是血浆中细胞外miRNA的主要来源[5].然而,最近一项研究将AGO1和AGO2（Argonaute）相关的血浆miRNA与全血细胞miRNA进行对比分析,结果显示在正常情况下血浆miRNA也可以来自其他组织器官[6].某些组织特异性的miRNA,如miR-122（肝脏）、miR-133a（肌肉）、miR-208a（心脏）以及miR-124（脑）都已经在血浆中被检出.

　　肿瘤也能向血液中释放miRNA.在肿瘤的不同阶段都可以在血液循环中发现多种肿瘤组织特异性miRNA.并且肿瘤向其他细胞一样可以分泌包含miRNA的微囊泡（microvesicles,MVs）.Mitchell等[7]将人前列腺癌细胞种植在小鼠体内,发现来自于人前列腺癌的异种移植物可进入种植小鼠的体内循环,证实了体液中的miRNA不仅来源于宿主细胞（小鼠）,还有一部分是由肿瘤细胞分泌.

　　Zhang等[4]研究发现人工喂以稻米、小麦、马铃薯等植物的小鼠在喂食后血清中植物miR-168a至少是喂食前的3倍,并且在肝脏、胃肠等脏器中发现该miRNA水平皆有明显增高,而在肾脏等其他器官中并未检测到此种变化,说明植物miRNA通过哺乳动物的摄食行为进入机体内部,通过胃肠道进入血液,这是目前发现的唯一的外源性植物miRNA进入机体的方式,也是细胞外miRNA的来源之一.

（二）细胞外miRNA的稳定性研究者将核糖核酸酶加入新鲜人血清后检测miRNA的量并不会减少,说明血浆miRNA可在富核糖核酸酶的环境中较为稳定地存在.向血清中加入外源性成熟miR-NA则发现外源性miRNA在核糖核酸酶的作用下迅速降解.而在加有核糖核酸酶抑制剂的血清中外源性miRNA则不会降解.这也揭示了miRNA本身并不具有对核糖核酸酶的抗性,为研究者进一步探索miRNA在体液中的存在形式提供了思路.

　　（三）细胞外miRNA在生物体内的运送过程在体液中发现miRNA之前,研究人员在细胞培养基中已经发现释放到细胞外的胞外体（exosome）中含有miRNA.机体中的miRNA可以通过囊化进入MVs从而到达细胞外.而后,Hunter等人在提纯的人外周血MVs中检测出了miRNA,进一步证实了膜-囊泡结构保护miRNA的假设[8].Gibbing等[9]研究发现miRNA包裹入胞外体可能不是一个随机,而是由特异性蛋白控制的;RNA导的沉默复合体中的一个组分GW182在胞外体中表达极其丰富.而GW182是miRNA与Ago2相互作用发挥功能所必须的.胞外体被包裹进入MVB与神经酰胺有关.胞外体中含有大量的鞘磷脂及神经酰胺,而神经酰胺的合成受到中性鞘磷脂酶2（neutralsphingomyelinase2,nSMase2）的控制.另有研究表明含有miRNA的胞外体进入MVs,并由神经酰胺触发释放到细胞外.过表达nSMase2可以增加细胞外miRNA的分泌,而使用特异性小干扰RNA或化学物质抑制nSMase2的酶活性则明显降低miRNA的分泌水平（Kosaka等.2010）.然而,Galas等[10]研究显示MVs包裹并不是miRNA进入细胞外的唯一途径.在人工培养细胞的培养液中收集的miRNA大多数并不是来自于脱落囊泡和胞外体.同年,两篇研究性文章各自证实了大部分细胞外miRNA不仅和膜-囊泡结构无关而且AGO蛋白有关.在去除细胞碎片的血浆中只有很小一部分的miRNA与MVs相关,90%~95%的miRNA是以和AGO蛋白结合的形式存在（Arroyo等.2011）.正常条件下人工培养的细胞所分泌的miRNA99%左右与膜囊并无关系,而是同AGO蛋白结合（Turchinovich等.2011）.外源性miRNA由于其发现尚存在较大争议,目前也没有更多研究阐述其在生物体内的详细的转运过程.miRNA进入受体细胞的方式仍不清楚,目前认为MVs可由内吞、内化等方式被受体细胞接受,而由MVs包裹的miRNA很可能借由这些过程进入受体细胞.

　　三、细胞外miRNA的生物学作用

（一）内源性细胞外miRNA的生物学作用

　　1.胞外体介导的细胞间通讯:

Zhang等[11]研究发现MVs中的miRNA由循环进入靶细胞作为内源性miRNA调节多种靶基因或者信号.用人微血管内皮细胞系（HMEC-1）作为受体细胞,含有来源于THP-1细胞FITC标记的miR-150的MVs能够进入HMEC-1细胞,miR-150表达水平明显升高.

　　这一结果表明miRNA可以通过MVs传递到远处靶细胞.miRNA-150过表达后,293T细胞的培养上清中的MVs能使HMEC-1细胞中c-Myb蛋白的表达明显降低,HMEC-1细胞的迁移能力增加.沉默THP-1细胞内miR-150的表达,则发现缺乏miR-150的MVs并不影响HMEC-1细胞中的c-Myb蛋白表达及HMEC-1细胞的迁移能力.采用Dil-C16标记THP-1细胞来源的MVs经尾静脉注射给C57BL/6小鼠,血管内皮层中miR-150表达水平明显升高.

　　动脉粥样硬化患者血浆中分离出的MVs中miR-150水平较正常人升高,而这种患者的MVs可以使HMEC-1细胞中c-Myb蛋白的表达明显降低,促进HMEC-1细胞的迁移.这些结果表明病理状态下MV中携带的分泌性miRNA可以到达受体细胞和组织发挥功能.

　　Pegtel等[12]研究发现胞外体miRNA可以促进病毒感染.用EB病毒转化来源于B淋巴样干细胞的胞外体,通过体外共同培养实验病毒miRNA通过分泌的胞外体传递到未感染的细胞,并使EVB-miR-NA的靶基因CXCL的表达呈现出剂量依赖性抑制.

　　进一步对EB病毒负荷增加的人群的外周血进行分析发现,EB病毒DNA仅存在于循环B细胞中,而EB病毒miRNA却在B细胞及非B细胞同时出现,这也提示了循环miRNA可以进行细胞间的传递.Mittelbrunn等[13]研究发现胞外体miRNA也参与免疫应答的调控.J77T细胞、RajiB细胞及原代的树突状细胞分泌的胞外体中含有miRNA,经抗原刺激可以导免疫突触的形成,促进miRNA从T细胞向抗原递呈细胞（antigenpresentingcell,APC）的单向性转移.而miRNA-335可以抑制APC中SOX4mRNA的翻译,进一步证实了转移到APC中的miR-NA在受体细胞中是有生物学功能的,揭示了由胞外体介导的抗原驱动的单向性细胞间miRNA的转移机制,而miRNA这种在免疫细胞之间的转移则可能会在免疫细胞之间信号传递,甚至在在免疫反应中调节基因表达.

　　此外,研究表明在体外miR-133b可以通过胞外体由间充质干细胞转移到星形胶质细胞和神经细胞.肿瘤细胞分泌的miRNA可能会影响周围正常细胞的表达谱,从而影响肿瘤进展,但尚未在体内试验进行验证.

　　2.特异的循环miRNA表达谱可作为肿瘤及其他疾病的新型生物标记物:

已有研究报道某些生理病理条件下可能会得到较为独特的循环miRNA谱.由于细胞外miRNA可在血浆、血清中稳定存在,可考虑以不同血清miRNA作为不同疾病的标记物.Chen等[14]将11个非小细胞肺癌患者（non-smallcelllungcancer,NSCLC）的血清进行汇集测序,并与正常人的血清miRNA进行对比,发现NSCLC患者的血清出现63种不存在于比正常人血清中的miR-NA,而28种正常人血清miRNA也未能在NSCLC患者的血清中检出.NSCLC患者的血清miRNA表达谱同时与血细胞miRNA表达谱进行比较,发现两者共有的miRNA有57种.而76种miRNA仅在NSCLC患者的血清中检出,这一结果同正常人血清miRNA与血细胞miRNA表达谱的比较结果差异较大.他们进一步对结肠癌和糖尿病患者的血清miRNA进行了测序,发现在结肠癌患者血清中发现了69种正常血清中为检测到的miRNA,值得注意的是许多miRNA,如mi-134、mi-221等在肺癌和结肠癌患者血清中都有发现,并且不存于正常人血清中,这一结果提示血清中可能存在某些肿瘤相关miRNA.

（二）外源性细胞外miRNA的生物学作用Zhang等[4]发现外源性的植物miR-168a可以被小鼠消化道吸收,进入血循环及胃、小肠、肝脏等多种脏器,与靶基因低密度脂蛋白受体衔接蛋白1（low-densitylipoproteinreceptoradapterprotein1,LDLRAP1）结合,从而抑制其在肝脏中的表达,减缓低密度脂蛋白从血浆中的清除.在人类小肠上皮细胞Caco-2中高表达miR168a,并用Caco-2的MV处理HepG2,结果发现HepG2细胞中miR-168a水平也有升高,而LDLRAP1的蛋白水平降低.这一研究结果表明外源性植物miRNA可以通过哺乳动物的摄食行为进入其体内,调控靶基因表达从而影响摄食者的生理功能.

　　四、结语与展望

　　目前研究已经证实细胞外miRNA能够在血清中稳定存在,并且广泛存在于人体12种体液中.细胞外miRNA由体内细胞分泌或通过摄食行为由胃肠道吸收,进入循环中,被靶细胞摄取,调节靶基因或信号,起到了细胞间的通信作用.然而,还有许多关于细胞外miRNA的问题需要进行进一步的研究:

miRNA是否由细胞选择性分泌,具体是如何进行分拣进入微囊泡中或与AGO等蛋白结合?

循环miRNA如何被靶细胞识别并摄取?

什么机制触发了miRNA由远端部位的释放?

此外,研究miR-NA的终极目标在于对人类疾病的预测、预后以及治疗上的价值.尽管目前这一研究领域仍处于探索阶段,但相信其在细胞间通信以及疾病的诊断和治疗都将产生重大影响.

　　参考文献

　　1ChimS,ShingT,HungEC,etal.Detectionandcharacter-izationofplacentalmicroRNAsinmaternalplasma.ClinChem,2008,54482~490.

　　2LawrieCH,GalS,DunlopHM,etal.Detectionofelevatedlevelsoftumour-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma.BrJHaematol,2008,141672~675.

　　3WeberJA,BaxterDH,ZhangS,etal.ThemicroRNAspec-trumin12bodyfluids.ClinChem,2010,561733~1741.

　　4ZhangL,HouD,ChenX,etal.ExogenousplantMIR168aspecificallytargetsmammalianLDLRAP1:

evidenceofcross-kingdomregulationbymicroRNA.CellRes,2012,22107~126.

　　5PritchardCC,KrohE,WoodB,etal.BloodcelloriginofcirculatingmicroRNAs:

acautionarynoteforcancerbiomar-kerstudies.CancerPrevRes（Phila）,2012,5492~497.

　　6TurchinovichA,BurwinkelB.DistinctAGO1andAGO2as-sociatedmicroRNAprofilesinhumancellsandbloodplas-ma.RNABiol,2012,91066~1075.

　　7MitchellPS,ParkinRK,KrohEM,etal.CirculatingmicroR-NAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.ProcNatlAcadSciUSA,2008,10510513~10518.

　　8HunterMP,IsmailN,ZhangX,etal.DetectionofmicroRNAexpressioninhumanperipheralbloodmicrovesicles.PLoSOne,2008,33694~3705.

　　9GibbingsDJ,CiaudoC,ErhardtM,etal.MultivesicularbodiesassociatewithcomponentsofmicroRNAeffectorcomplexesandmodulatemicroRNAactivity.NatCellBiol,2009,111143~1149.

　　10WangK,ZhangS,WeberJ,etal.ExportofmicroRNAsandmicroRNA-protectiveproteinbymammaliancells.NucleicAcidsRes,2010,387248~7259.

　　11LiJ,ZhangY,LiuY,etal.Microvesicle-mediatedtransferofmicroRNA-150frommonocytestoendothelialcellspro-motesangiogenesis.JBiolChem,2013,28823586~23596.

　　12PegtelDM,CosmopoulosK,Thorley-LawsonDA,etal.FunctionaldeliveryofviralmicroRNAsviaexosomes.ProcNatlAcadSciUSA,2010,1076328~6333.

　　13MittelbrunnM,Gutierrez-VazquezC,Villarroya-BeltriC,etal.UnidirectionaltransferofmicroRNA-loadedexosomesfromTcellstoantigen-presentingcells.NatCommun,2011,2282~292.

　　14ChenX,BaY,MaL,etal.CharacterizationofmicroRNAsinserum:

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