毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选范本模板.docx

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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选范本模板

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选

菌体的准备：

1。

挑取酵母单菌落，接种至含有5mlYPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250—300r/min培养过夜；

2.取100-500µl（≤1：

100）的培养物接种至含有50ml新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250—300r/min培养过夜（约20h）,至OD600达到1.3～1。

5;

3。

将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

4。

按步骤3离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬

5。

按步骤3离心,用2—5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

6。

按步骤3离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240ul；

备注:

可将其分装为80µl一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。

比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。

对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。

一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇,就类似BMMY的功能了。

✓KM71比GS115生长的要慢。

毕赤酵母都应该是白色菌落的

✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+离子，提高表达量和蛋白活性？

菌种保存：

挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1：

1加入30％灭菌甘油，—80oCul/管冻存

（一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ulddH2O重溶。

转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。

建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。

乙醇沉淀主要步骤如下：

1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2NaAC,混匀

2）—20℃20分钟沉淀

3）13200rpm,20min，离心后弃上清

4）75％乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清

5）37度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。

6）20ulddH2O重溶）

电击转化：

8.将5~20µg的线性化DNA溶解在5～10µlTE溶液中，与80µl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中;

9。

将电转化杯冰浴5min；

10.根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索,确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；

11。

电击完毕后,马上加入1ml1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至1。

5ml的EP管中;（置于30度摇床低速培养1h，再涂板）

12。

将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600µl涂布一块平板；

13。

将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3—4天）.

推荐：

电压1.5kV;电容25µF；电阻200Ω。

电击时间为4～10msec。

Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法

1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；

2.取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了

3.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装.

3.用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，

利用5’AOX1和3'AOX1引物对转化子进行PCR复筛，同时检测基因插入（如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichiapastoris基因组，则会扩增到两条带,一条为2。

2kb（KM71为3。

6kb）宿主茵AOXI基因,另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。

）

Each50µlaliquotofcompetentPichiacellswith3µglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium。

Muts表型重组酵母的诱导表达实验

Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10—30％ofyourtotalflaskvolume。

1.挑选一单菌落，置于装有50mlMGY、BMG或BMGY培养基的500ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6（～16—18h）；

2。

室温下1500～3000g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM，BMM或BMMY重悬菌体（约2。

5～5ml）；

3.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°

C/250—300rpm的摇床上继续生长；

4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1。

0%；

5。

按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5mlEP管中，最大转速离心2～3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间.时间点一般取：

0、24、48、72、96和120h；

6。

对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀,带检测样品用液

氮或干冰速冻后，于—80°C保存备用;

7.可以用SDS—PAGE、Western—Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达.

Mut+表型重组酵母的诱导表达实验

1.挑选一单菌落，置于装有25mlMGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28—30°C/250—300rpm培养至OD600=2-6（～16-18h）；

2.室温下1500~3000g离心5min,收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右（约100～200ml）；

3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28—30°C/250—300rpm的摇床上继续生长；

4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0。

5~1.0%；

5。

按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2～3min，分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

时间点一般取：

0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；

6.对分泌表达,分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后,于—80°C保存备用；

7。

可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

BMGY和BMMY的换液方式有2种：

1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶,整个过程均用灭菌移液管操作.

2）另一种是静止换液，即在生长培养结束后,将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。

是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。

如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。

用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。

也有人试过用膜过滤,结果膜都溶解了.

菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低,PBS更方便.

麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料）,生长阶段结束后，密度可达到10-12,诱导培养结束后，密度可达到18左右。

如果用1体积的BMGY,在生长阶段结束后,换液时，加入1/10—1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。

通常,真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。

摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。

摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标.

Mut+/Muts的筛选

用SacI，SalIorStuI线性化插入HIS4位点的载体转化GS155后，多数转化子应为Mut+，但也有His+Muts的转化子存在（见Invitrogenprotocolp36），NotIorBglII线性化插入AOXI位点的载体转化GS155后,用MD/MM平板可区分Mut+/Muts。

UsetheplatescontainingtheHis+transformantsandscreenfortheMut+andMutSphenotypeasdescribedbelow。

1.Usingasteriletoothpick，pickonecolonyandstreakorpatchoneHis+transformantinaregularpatternonbothanMMplateandanMDplate,makingsuretopatchtheMMplatefirst。

2。

Useanewtoothpickforeachtransformantandcontinueuntil100transformantshavebeenpatched（2—3plates）。

3。

TodifferentiateMut+fromMutS,makeonepatchforeachofthecontrols（GS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β—gal）ontotheMDandMMplates.

4.Incubatetheplatesat30°Cfor2days.

5.After2daysorlongerat30°C,scoretheplates。

Mut+transformantswillgrowwellonbothMDandMMplates。

MutStransformantswillgrowwellonMDplates,butshowlittleornogrowthontheMMplates.

WerecommendpurifyingyourHis+transformantstoensureisolationofapureclonalisolates。

YoumaydothisbeforeoraftertestingfortheMutphenotype.

Replica-PlatingProcedure

Thisproceduregivesalowerrateofmisclassifications,butitincreasestheoverallMut+/MutSscreeningprocedureby2days.Youwillneedequipmenttoreplica-plate.

1。

Usingsteriletoothpicks，patch100His+transformantonMDplates（2—3plates）。

Forcontrols,makeonepatchfromeachofthestrainsGS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β-galontotheMDplates.

2.Incubatetheplatesat28-30°Cfor2days。

3.After2days,replica—platethepatchesfromtheMDplatesontofreshMMandMDplatestoscreenforMutStransformants。

4.Incubatethereplicaplatesat28-30°Cfor2days。

5。

After2daysat28—30°C,scorethereplicaplates.LookforpatchesthatgrownormallyontheMDreplicaplatesbutshowlittleornogrowthontheMMreplicaplates.IncludingHis+Mut+andHis+MutScontrolpatchesoneachplatewillprovideexamplesofMut+andMutSphenotypes.

ScreeningbyFunctionalAssay

SomeresearchershaveusedafunctionalassaytodirectlyscreenforhighexpressingPichiarecombinantcloneswithoutfirstscreeningforMutSorMut+phenotypes.Ifyouelecttoscreendirectlyforhigh-expressingrecombinants,besuretoalsochecktheMutphenotype.Thiswillhelpyouoptimizeexpressionofyourrecombinantclone。

毕赤酵母基因组提取方法

⑴接种重组和空质粒转化子于5mlYPD+k抗生素培养基,GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。

⑵室温下，1500g离心5-10min收集菌体

⑶100ulTE（pH7。

0）重悬，加入300ulEDTA（pH8.0），0。

07MTris－HCl，3ulβ—巯基乙醇，1ulLyticase，37℃水浴30min。

⑷10000g离心5~10min，取沉淀，加90ulTE重悬.

⑸200ul饱和酚，200ul氯仿，混匀,离心30s,取上层水相。

⑹加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC,—20℃放置30min；

⑺10000g离心20min,弃上清；75％乙醇漂洗沉淀一次;

⑻干燥后，加入15μl的TE或H2O溶解,-20℃备用。

重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。

所以一定要保存好最原始的重组菌株,每次从中划板，挑单克隆表达，尽量减少菌株传代次数。

不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株.

Pichia菌落PCR破壁方法（史飞）：

30ul培养液，0.2%SDS

Votex15sec

离心1min

取上清，稀释5—10倍

用于PCR模板

GS115的鉴定方法

接种GS115于5mlYPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板,30℃培养48小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板,4℃保存.GS115的his4基因突变了,不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了,而YNB却只含基本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变

毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制

10＊YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的13.4％酵母基础氮源培养基）4℃保存。

34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵,溶于1000ml水中，过滤除菌,或134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过虑除菌or115℃15—20min灭菌。

注意毕赤酵母在高浓度YNB下生长更好,所用YNB的量是酿酒酵母中的两倍。

500*B（0.02％生物素Biotin）20mg的生物素溶于100ml水中,水浴加热溶解，温度不能高于50度。

过滤除菌。

4℃保存保存期为1年。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）,所以肯定要加的。

100＊H（0。

4%Histidine组氨酸）4℃保存保存期为1年.400mg的L-组氨酸溶于100ml水中,（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。

10＊D（20％Dextrose葡萄糖）保存期为1年。

200g葡萄糖溶于1000ml水中，115℃灭菌15—20min或过滤除菌。

10*M（5%Methanol甲醇）保存期为2个月.将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌.

10＊GY（10%Glycerol甘油）保存期为1年以上。

将100ml甘油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。

100*AA（0。

5％ofeachAminoAcid,各种氨基酸）4℃保存保存期为1年。

分别将500mg的L—谷氨酸、L—蛋氨酸、L—赖氨酸、L-亮氨酸和L—异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌.

1M磷酸钾溶液（potassiumphosphatebuffer，pH6。

0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6。

0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH.

1M山梨醇

毕赤酵母表达的培养基配制

2.1LB（Luria－Bertani）培养基:

Tryptonl％

YeastExtract0.5％

NaCll％

PH7。

0制作平板时加入2％琼脂粉.121℃高压灭菌20min。

可于室温保存.

2.2LLB（LowSaltLB）培养基:

Tryptonl％

YeastExtract0。

5％

NaCl0.5％

PH7。

0制作平板时加入2％琼脂粉.121℃高压灭菌20min。

可于室温保存数月。

2。

3YPD完全培养基（又称YEPD）（YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）

Yeastextract1％10g/L

Trypton2%20g/L

dextrose（Dglucose）2％20g/L

+agar2%20g/L

液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。

YPD或YEPD：

YeastExtractPeptoneDextroseMedium（1L）,又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基.　

YPD培养基配制方法：

1.溶解10gYeastExtract（酵母膏），20gPeptone（蛋白胨）于900ml水中,如制平板加20g琼脂粉　　

2。

高压121度20min

3。

加入100ml20％（10X，共20g）的Dextrose（glucose）（葡萄糖），（葡糖糖溶液灭菌后加入）　　

注:

葡萄糖，yeastextract,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合.葡萄糖可以过滤除菌，也可以115℃15—20min灭菌。

YPD培养基用途：

用于酵母菌的培养，及供药品和生物制品含王浆和蜂蜜的合剂酵母菌数测定。

YPEG：

除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作为碳源外，其他成分同YPD；YPDZ是在YPD的基础上加上ZEOCIN抗生素；YPDA是在YPD的基础上加0。

003％的腺嘌呤硫酸盐。

2。

4MD与MDH选择培养基

MinimalDextroseMedium+（Histidine）最小葡萄糖培养基+（0。

004％组氨酸）（含有：

1。

34%YNB；；4X10-5％生物素；2％葡萄糖）

1.灭菌800ml的ddwater，冷却到60℃左右，加入

2ml的500*B，

100ml的10＊YNB

100ml的10＊D母液,4℃保存

2。

如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可，4℃保存；

3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15g的琼脂。

4℃可保存数月。

2.5MM和MMH培养基

MinimalMethanolMedium+（Histidine）（含有：

1。

34%YNB;4X10—5%生物素；0.5％甲醇）

1.灭菌800ml的ddwater，冷却到60℃左右，加入

2ml的500＊B，

100ml的10*YNB

100ml的10*M，4℃保存

2.如配制MMH，可在上述的MM中加入10ml的100*H即可,4℃保存；

3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15g的琼脂。

4℃可保存数月。

MMorMD是筛选mutS和mut+表型的。

2。

6BMG和BMM培养基

BufferedMinimalGlycerol，BufferedMinimalMethanol（含有100mMpotassiumphosphatepH6。

0,1.34％YNB；4X10—5％生物素1％glycerolor0.5％methanol）

1.灭菌700ml的ddwater，冷却到室温，加入

2ml的500*B，

100ml的10＊YNB

100ml的1Mpotassiumphosphatebuffer

100ml的10*GY，4℃保存

2.如配制MMH，可在上述的BMG中用100ml的10*M取代100ml的10*GY即可，4℃保存，可保存2个月.

2。

7BMGY和BMMY

BufferedGlycerolcomplexMedium,BufferedMethanolcomplexMedium（含有1％yeastextract,2%peptone,100mMpotassiumphosphatepH6.0，1.34％YNB;4X10-5％生物素1％glycerolor0.5％methanol）

1.溶解10g的