油菜花蜂蜜中挥发性成分的提取与特征图谱的建立毕业论文.docx
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油菜花蜂蜜中挥发性成分的提取与特征图谱的建立毕业论文
本科毕业设计（论文）
题目油菜花蜂蜜中挥发性成分的提取与特征
图谱的建立
毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明
原创性声明
本人郑重承诺：
所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。
尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。
对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。
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指导教师签名：
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使用授权说明
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作者签名：
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学位论文原创性声明
本人郑重声明：
所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。
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学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
涉密论文按学校规定处理。
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日期：
年月日
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日期：
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注意事项
1.设计（论文）的内容包括：
1）封面（按教务处制定的标准封面格式制作）
2）原创性声明
3）中文摘要（300字左右）、关键词
4）外文摘要、关键词
5）目次页（附件不统一编入）
6）论文主体部分：
引言（或绪论）、正文、结论
7）参考文献
8）致谢
9）附录（对论文支持必要时）
2.论文字数要求：
理工类设计（论文）正文字数不少于1万字（不包括图纸、程序清单等），文科类论文正文字数不少于1.2万字。
3.附件包括：
任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）。
4.文字、图表要求：
1）文字通顺，语言流畅，书写字迹工整，打印字体及大小符合要求，无错别字，不准请他人代写
2）工程设计类题目的图纸，要求部分用尺规绘制，部分用计算机绘制，所有图纸应符合国家技术标准规范。
图表整洁，布局合理，文字注释必须使用工程字书写，不准用徒手画
3）毕业论文须用A4单面打印，论文50页以上的双面打印
4）图表应绘制于无格子的页面上
5）软件工程类课题应有程序清单，并提供电子文档
5.装订顺序
1）设计（论文）
2）附件：
按照任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）次序装订
指导教师评阅书
指导教师评价：
一、撰写（设计）过程
1、学生在论文（设计）过程中的治学态度、工作精神
□优□良□中□及格□不及格
2、学生掌握专业知识、技能的扎实程度
□优□良□中□及格□不及格
3、学生综合运用所学知识和专业技能分析和解决问题的能力
□优□良□中□及格□不及格
4、研究方法的科学性；技术线路的可行性；设计方案的合理性
□优□良□中□及格□不及格
5、完成毕业论文（设计）期间的出勤情况
□优□良□中□及格□不及格
二、论文（设计）质量
1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？
□优□良□中□及格□不及格
2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？
□优□良□中□及格□不及格
三、论文（设计）水平
1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义
□优□良□中□及格□不及格
2、论文的观念是否有新意？
设计是否有创意？
□优□良□中□及格□不及格
3、论文（设计说明书）所体现的整体水平
□优□良□中□及格□不及格
建议成绩：
□优□良□中□及格□不及格
（在所选等级前的□内画“√”）
指导教师：
（签名）单位：
（盖章）
年月日
评阅教师评阅书
评阅教师评价：
一、论文（设计）质量
1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？
□优□良□中□及格□不及格
2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？
□优□良□中□及格□不及格
二、论文（设计）水平
1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义
□优□良□中□及格□不及格
2、论文的观念是否有新意？
设计是否有创意？
□优□良□中□及格□不及格
3、论文（设计说明书）所体现的整体水平
□优□良□中□及格□不及格
建议成绩：
□优□良□中□及格□不及格
（在所选等级前的□内画“√”）
评阅教师：
（签名）单位：
（盖章）
年月日
教研室（或答辩小组）及教学系意见
教研室（或答辩小组）评价：
一、答辩过程
1、毕业论文（设计）的基本要点和见解的叙述情况
□优□良□中□及格□不及格
2、对答辩问题的反应、理解、表达情况
□优□良□中□及格□不及格
3、学生答辩过程中的精神状态
□优□良□中□及格□不及格
二、论文（设计）质量
1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？
□优□良□中□及格□不及格
2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？
□优□良□中□及格□不及格
三、论文（设计）水平
1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义
□优□良□中□及格□不及格
2、论文的观念是否有新意？
设计是否有创意？
□优□良□中□及格□不及格
3、论文（设计说明书）所体现的整体水平
□优□良□中□及格□不及格
评定成绩：
□优□良□中□及格□不及格
教研室主任（或答辩小组组长）：
（签名）
年月日
教学系意见：
系主任：
（签名）
年月日
油菜花蜂蜜中挥发性成分的提取与特征图谱的建立
摘要
本论文采用顶空固相微萃取技术萃取油菜花蜂蜜中的挥发性成分，利用气相色谱技术对10种油菜花蜂蜜的挥发性成分进行分析，建立起油菜花蜂蜜挥发性成分的特征图谱。
采用顶空固相微萃取方处理油菜花蜂蜜，筛选萃取时间、萃取温度、Nacl加入量三个条件参数，其中萃取温度的选择分为四个梯度，分别为30℃、40℃、50℃和60℃，萃取时间的选择分为四个梯度，分别为20min、25min、30min和40min，萃取氯化钠的添加量分为0g、0.5g、1.0g和1.5g，确定最优的操作条件，通过气相色谱仪对10种品牌的油菜花蜂蜜挥发性成分进行解析处理，得到色谱图，然后对色谱图数字化处理，通过数据分析找出内参考峰，计算保留值，然后按照一定标准找出共有峰建立油菜花蜂蜜的特征图谱。
最终确定顶空固相微萃取的最优条件是：
萃取温度为40℃，萃取时间为30分钟，加入氯化钠1.0g，此条件下得到蜂蜜的特征共有峰有10个。
关键词：
油菜花蜂蜜顶空固相微萃取气相色谱特征图谱
Extraction and the Characteristic Map of Volatile Composition of Rape Honey
Abstract
Inthispaper,headspacesolidphasemicroextractionrapehoneyextractionofvolatilecomponentsbygaschromatographyfor10kindsofrapehoneyvolatilecompoundswereanalyzedtoestablishthecharacteristicchromatogramrapehoneyvolatilecomponents.
Headspacesolidphasemicro-extractionsideprocessingrapehoney,screeningextractiontime,extractiontemperature,NaClamount,whichisdividedintofourchoicesextractiontemperaturegradient,respectively30℃,40℃,50℃and60℃,extractiontimeSelectfourgradient,respectively20min25min30minand40min,theamountofsodiumchlorideandextractedinto0g,0.5g,1.0gand1.5g,determinetheoptimaloperatingconditionsbyagaschromatograph10brandstherapehoneyvolatilecomponentsresolvedtogivechromatograms,andthendigitizethechromatogramtoidentifyinternalreferencepeak,calculateretention,andfollowcertainstandardstoidentifycommonpeakestablishrapehoneycharacteristicspectrumdataanalysis.
Finalizeheadspacesolidphasemicroextractionoptimumconditionsare:
extractiontemperatureis40℃,extractiontimewas30minutes,sodiumchloridewasadded1.0g,gethoneyunderconditionscharacterizedbyatotalof10peaks.
Keywords:
RapeHoney;Headspacesolidphasemicroextraction;GasChromatography;Characteristicmap
目录
1绪论1
1.1简述1
1.2蜂蜜鉴定方法的研究进展1
1.2.1感官分析1
1.2.2荧光光谱1
1.2.3高效液相色谱1
1.2.4气相色谱技术2
1.3课题研究内容2
1.3.1研究背景2
1.3.2研究内容2
2实验部分3
2.1实验样品3
2.2实验试剂3
2.3实验器材3
2.4实验方法4
2.4.1顶空固相微萃取提取油菜花蜜挥发性成分方法4
2.4.2气相色谱仪的操作流程4
2.4.3气相色谱条件5
2.4.5挥发性成分的最优提取条件和气相色谱图的获得5
2.4.6色谱图的数字化5
2.5数据处理方法6
3结果和讨论7
3.1萃取条件的优化7
3.2共有内参考峰的确定9
3.3相对保留值的处理结果13
3.4不同油菜花蜂蜜样品的图谱共有峰的分析16
3.5共有峰的保留时间结果17
3.6挥发性成分特征图谱的建立18
4结论20
致谢21
参考文献22
1绪论
1.1简述
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经过在巢脾内转化、脱水、贮存至成熟的过程而成的天然甜物质[1]。
油菜蜜呈浅琥珀色，略混浊、有油菜花的香气，稍有辛辣味，贮放日久辣味减轻，味道甜润，极易结晶，结晶后呈乳白色，晶体呈细粒或油脂状。
白菜型油菜花期早，蜂群越冬后正处于恢复、发展阶段，气候比较寒冷产量不高；甘蓝型和芥菜型花期较晚且气候比较稳定，温度高是油菜蜜的主产期。
油菜蜜是我国的最大众、稳产的蜜种；全年约占蜂蜜总产量40%以上。
强群蜂单花期产量可达5-75公斤或更高，蜜度较低。
我国油菜分布广，尤其是南方地区种植面积很大[1]。
油菜花产蜜量大，蜜呈浅琥珀色，比紫云英蜜略深，有混浊，具有油菜花香味，味道甜润，容易结晶，结晶的油菜蜜白色细腻,属二等蜜[1]。
油菜花蜜清热润燥、舒张血管、行血破气，消肿散结、和血补身的功能[1]。
1.2蜂蜜鉴定方法的研究进展
1.2.1感官分析
蜂蜜的感官辨别主要是由有经验的专家根据不同品种蜂蜜的色泽、状态、气味、滋味等感官性状的不同，对被检样品进行感官评价。
该方法适用于判定蜂蜜是否发酵、异味或含有不纯物质，但是感官分析辨别蜂蜜品种带有一定的主观性、经验性和不确定性。
1.2.2荧光光谱
荧光光谱属于发射光谱，提供了有关荧光分子信息。
荧光光谱技术的灵敏度高于其他光谱技术100-1000倍，可用于判定蜂蜜的植物来源。
蜂蜜中所含的多酚和氨基酸有强烈的荧光团，用荧光光谱有助于鉴定蜂蜜的植物来源，如柑桔蜜的橙皮素[2]，熏衣草蜂蜜所含的特征氨基酸—苯基丙氨酸和酪氨酸，可与桉树蜜区分开[3]。
色氨酸和谷氨酸则有助于分类甘露蜜和花蜜[4]。
1.2.3高效液相色谱
高效液相色谱（HPLC）特征图谱技术与化学计量学相结合的方法，由此可以建立了洋槐蜜、油菜蜜和荆条蜜的HPLC特征图谱,确定了这三种单花蜜的花源酚酸标识物,并结合化学计量学的方法对蜂蜜的植物源及掺假进行了分析鉴定[5]。
该研究为蜂蜜的花源鉴定以及掺假研究提供了依据。
1.2.4气相色谱技术
气相色谱在蜂蜜品种鉴定中主要用于蜂蜜挥发性成分的分离、鉴别。
测定多种蜂蜜中的芳香性成分并进行分析，发现每种蜂蜜有各自的色谱图以及特征化合物，因此，利用色谱图确定蜂蜜的蜜源种类似乎可行。
迄今为止，约有600种挥发性化合物在许多蜂蜜类型中被鉴定出。
AlissandrakisE等研究发现，与单花蜜特殊气味有关的挥发性物质一般来源于对应的植物[6]。
通过溶剂萃取，改良的“Likens-Nickerson”蒸汽蒸馏法和溶剂萃取，动态顶空萃取（DHS），固相微萃取以及气体传感器等萃取方法研究单花蜜中的挥发性物质成分，将挥发性物质作为分类单花蜂蜜的特征标记，是目前研究的热门课题之一[7]。
BianchiF等用动态顶空萃取样品，GC-MS法测定分离出草莓蜜中的28个芳香化合物，其中α-异佛尔酮，β-异佛尔酮和酮代异佛尔酮被认为是草莓蜜的特征标记[8]。
动态顶空萃取法是花粉分析的有效替代方法，尤其用于处理如草莓蜜这种花粉含量少的蜂蜜样品。
1.3课题研究内容
1.3.1研究背景
我国是世界养蜂大国，由于我国国土辽阔、地理气候优越以及蜜源植物丰富，不仅蜂蜜产量居世界首位（年产约20万吨），而且蜂蜜品种种类和数量繁多，分布广泛。
据不完全统计，我国能被蜜蜂利用的蜜源植物约5000种以上，能取到商品蜜的蜜源植物有100多种[6]。
根据国际食品法典委员会蜂蜜标准、欧盟蜂蜜指令及其他相关规定，蜂蜜种类依据来源、生产方式或外观划分[15-16]。
最常见的划分是依据蜜蜂所采集的蜜源植物种类而分的，主要蜜源是单一植物的称作单花种蜂蜜，采自多种植物的为杂花蜜或百花蜜。
不同蜜源植物来源的蜂蜜的成分主要取决于植物类型、植物花期、气候、蜂群强弱以及取蜜时间等，不仅在感官和内在品质上有一定的差异，而且其营养效果也有所不同[6]。
1.3.2研究内容
以康思农油菜花蜜为实验对象分别固定氯化钠的量、萃取时间、萃取温度，采取平行实验，得出最优的萃取条件，再以最优条件对其他九种样品进行实验，得到在不同条件下的9种气相色谱图以及不同品牌油菜花蜂蜜下的9种气相色谱图，并由此建立油菜花蜂蜜中挥发性成分的特征图谱。
2实验部分
2.1实验样品
样品均为淘宝、京东销售的产自全国的不同品牌的油菜花蜜。
表1不同品牌蜂蜜样品
蜂蜜品牌
产地
生产日期
编号
暖民
四川成都
2015年02月10日
Y1
雷允上
浙江宁波
2015年02月25日
Y2
康思农
湖北武汉
2014年07月27日
Y3
蜂献
安徽安庆
2014年12月11日
Y4
葆丰
重庆渝北
2015年02月09日
Y5
刘氏
安徽安庆
2015年01月29日
Y6
越贡
浙江绍兴
2015年01月13日
Y7
丁氏
云南昆明
2015年02月17日
Y8
精灵子
重庆云阳
2015年01月21日
Y9
藏原蜜语
青海西宁
2014年10月16日
Y10
2.2实验试剂
蒸馏水（实验室自制），NaCl（分析纯）。
2.3实验器材
表2主要实验器材
主要设备
厂家
85-2型恒温磁力搅拌器
上海司乐仪器有限公司
鹤寿一次性无菌注射器
常州悦康医疗器材有限公司
EL2001电子天平
梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
57328-U型PDMS萃取头
SUPELCO
GC-2014CATF
日本岛津有限公司
CBM-102GCsolution工作站
日本岛津有限公司
2.4实验方法
以油菜花蜜为实验对象，对别于市场购买10种不同商家的油菜花蜜。
总共测定10个样品的特征性图谱，分3阶段经行，第一阶段是优化条件，以一种蜂蜜为实验对象，利用顶空固相微萃取技术，改变萃取条件已达到最优数据，其中萃取条件主要是NaCl的量，萃取温度，萃取时间3个因素，其中NaCl为0g，0.5g，1.0g，1.5g。
萃取温度为30℃，40℃，50℃，60℃。
萃取的时间为20min，25min，30min，40min。
第二阶段为用优化条件针对剩下的9组样品进行分析，这里每组样品只需一组最优数据。
第三阶段是整合分析实验数据，最后得到在不同条件下以及不同品牌蜂蜜下油菜花蜜的气相色谱图，并由此建立油菜花蜜中的挥发性成分特征图谱[17]。
2.4.1顶空固相微萃取提取油菜花蜜挥发性成分方法
准确称取4.00g蜂蜜样品，加入容量瓶中；加入1ml的蒸馏水；加入氯化钠，加入转子，旋紧盖子；用250ml的烧杯加入适量的水，放在磁力搅拌器上加热，作为恒温水浴；用温度计测量水温，待水浴温度恒定后，将PDMS萃取头插入容量瓶至适当位置，再将容量瓶放入恒温水浴中，并用试管架固定好萃取器；调试磁力搅拌器的转动速度，使得转子稳定转动即可，伸出萃取头，开始挥发性成分的采集，并记时；采集完成后，收起萃取头，最后将提取好的萃取器插入气相色谱仪中进行分析。
2.4.2气相色谱仪的操作流程
开机：
◆先开氮气阀门，开电脑，打开工作站，打开仪器开关，打开信号采集器，顺时针打开尾吹氢气和空气旋纽。
◆控制面板打开程序文件。
点击System,打开GC。
工作站点击“采集参数”，“单次分析”，“样品记录”，设置数据存储路径。
◆等进样口、色谱柱、检测器3个地方温度升到设定温度，打开氢气和空气钢瓶阀门，控制面板上DET，按“点火”键。
◆进样，同时按下绿色按纽“START”，同时点击工作站“开始”和按下信号采集器的通道键，直到采集完成。
关机：
◆先关尾吹氢气和空气旋纽，逆时针旋转。
◆点击SYSTEM，关闭GC。
等进样口、色谱柱、检测器3个地方温度低于100度时，关仪器电源，关氮气阀门。
◆关工作站，关电脑，关信号采集器。
色谱柱净化：
再较长时间不使用气相色谱仪之后，下一次使用需进行260度净化15分钟（基线不平则继续升温净化）。
2.4.3气相色谱条件
气相色谱仪（日本岛津GC-2014C），配有FID氢火焰离子检测器、美国Restek毛细管柱（30m×0.32mm，0.25μm），进样口为双填充INJ+，以及TCD热导检测器[15]。
对色谱分析中的分离温度进行了优化。
为缩短蜂蜜中各挥发性组分的保留时间，提高分离度，同时降低峰宽，选择程序升温体系。
兼顾分离效果和色谱峰形，选择的最佳升温梯度为：
初始化温度为50℃保持3min；第一阶段以5℃/min的升温速度升至200℃，并保持5min；第二阶段以8℃/min的速度升温至240℃，并保持15min，平衡时间为3min[16]。
进样口的温度设定为250℃，检测器的温度为260℃，载气为99.9%高纯度氮气，载气流速是1.2mL/min，采样时间为5min。
2.4.5较适条件下挥发性成分的提取和气相色谱图的获得
在萃取头已经提取了挥发性成分之后，将萃取头插入气相色谱仪的进样口中，开始进样，萃取头在采集30min之后取出，取出后的萃取头继续进行下一样品挥发性成分的提取。
气相色谱的具体操作可以参照2.42，等工作站走完整个流程，得出气相色谱图，并且标识上蜂蜜样品的信息，便于10种蜂蜜的区分。
2.4.6色谱图的数字化
实验过程中的数据分析过程，是为了对蜂蜜样品色谱图进行比较，然而单纯的通过肉眼来观察分析，是很难精确的分析出共有峰以及得到准确的特征图谱的[18]。
所以就必须将这些色谱图进行数字化，由此得到每个样品图谱的数字化信息数据，得到的数字化信息就能够用计算机进行分析比较，并将比较的结果进行量化表述，这样来获得不同蜂蜜样品的共有峰，从而获得油菜花蜂蜜的特征图谱[18]。
从一张色谱图中可以的获得三个主要信息：
一是保留值（即为气相色谱图的保留时间）；二是峰强度（即是色谱图的峰面积或峰高）；三是半峰宽，由此可以判断色谱分离时的柱效[18]。
在这样的三个信息中，保留值和峰强度是判断识别和鉴定油菜花蜂蜜样品挥发性气体中复杂组分的主要依据，是本论文数据分析的重要数据源，将样品色谱图中的保留值和峰强度进行数字化，之后得到的称之为色谱特征谱。
2.5数据处理方法
采用origin7.0进行萃取条件优化试验数据分析，采用Excel2010软件对10种油菜花蜂蜜样品的内参考峰的获取、相对保留值、共有峰保留时间等数据进行处理[18]。
3结果和讨论
本论文研究中将保留值和峰强度进行数字化的最简单的方法，就是直接用气相色谱的保留时间的数值来表示保留值，用峰高或峰面积来表示峰强度[18]。
但是，用这种数字化方法得到的数字化色谱特征谱，由于色谱本身存在着很大的缺陷而无法使用，这一缺陷就是色谱的保留值受到很多因素的影响。
就是将色谱条件，如柱温、流动相的流速、流动相的组成，进样量等等进行严格控制，但它们的一些微小变化也会影响保留值的变化，更何况一些无法控制的因素的变化，如柱料填充状况的变化、室温的变化、流动相中易挥发成分的挥发等等，都将使色谱保留值发生变化[18]。
所以直接用保留值进行比较，将会产生很多错
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