γ谷氨酰转肽酶酶学性质的研究.docx

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γ谷氨酰转肽酶酶学性质的研究

γ-谷氨酰转肽酶酶学性质的研究

蒋敏丽,孟佩佩,高鹏,胡立勇

【摘要】目的了解地衣芽孢杆菌菌体细胞中γ-谷氨酰转肽酶的一些基础酶学性质。

方式采纳溶菌酶法破碎细胞壁，经硫酸铵沉淀后透析取得粗酶后，采纳紫外分光光度法测定该酶的酶活力。

结果该酶在25~35℃的温度范围有专门好的耐受性，在碱性条件下维持必然的活性，最适反映温度为45℃，最适反映pH值为，Ca2+、Mg2+等金属离子在适当浓度时对酶活性有增进作用。

结论本实验为利用该酶转化生产茶氨酸提供了依据。

【关键词】γ-谷氨酰转肽酶;酶学性质;茶氨酸

　Abstract:

ObjectiveTounderstandsomebasicpropertiesofγ-glutamyltranspeptidasefromBacillusLysozymewereusedtodisruptthecellwallandammoniumsulfatewereusedtoseparateprecipitationanddialysis,atlastthecrudeenzymewereobtained.UVspectrophotometrywereusedtomeasuredtheenzymeactivity.ResultsThisenzymewaswelltoleranttotemperatureintherangeof25~35℃,butinalkalineconditions,itmaintainedacertainactivity,theoptimumreactiontemperaturewas45℃andoptimumreactionpH,generallytheappropriateconcentrationofmetalions,suchasCa2+,Mg2+,hadapositiveeffectontheactivity.ConclusionThisexperimentcouldbeusedinproductionoftheaninewithγ-glutamyltranspeptidase.

　　Keywords:

　γ-glutamyltranspeptidase;enzymologicalproperty;L-theanine

　　γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP,EC又称γ-谷氨酰转移酶,在生物体内普遍存在,是谷胱甘肽（GSH）代谢的关键酶之一。

该酶还参与了氨基酸的跨膜转运,可特异性催化γ-谷氨酰基的转移反映[1]。

人们对γ-GTP的初期研究局限于该酶在GSH代谢中所起的作用[2]。

随着研究的深切,人们对γ-GTP的催化功能和分子结构有了更多的了解,并发觉其在临床上可作为肝胆疾病的生物标志,被普遍应用于肝病及其他脏器疾病的诊断和预后检测[3-4]。

最近几年来,由于生物技术进展突飞猛进,生物催化与生物转化技术在工业生产中慢慢兴起,利用γ-GTP制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点。

已有报导利用γ-谷氨酰基化（γ-glutamylization）反映合成了GG-DOPA等多种化合物[5-7]。

目前，利用来源于枯草芽孢杆菌、基因工程改造的大肠埃希菌的γ-GTP生产茶氨酸[8]（L-theanine,γ-L-glu-ethylamide）愈来愈受到人们的关注。

该方式利用γ-GTP将L-谷氨酰胺上的γ-谷氨酰基转移到乙胺受体上,催化合成L-茶氨酸。

但利用地衣芽孢杆菌发酵所产的γ-GTP转化合成茶氨酸尚未见报导。

本文利用实验室挑选的γ-GTP高产菌株地衣芽孢杆菌发酵产酶，并研究该菌株所产的γ-GTP的基础酶学性质，为进一步利用地衣芽孢杆菌所产的γ-GTP生产茶氨酸提供依据。

　　1材料与方式

　　要紧材料与试剂

　　菌种：

地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）由本实验室挑选取得。

试剂：

Tris购自北京普博欣生物公司;L-γ-谷氨酰对硝基苯胺、双甘肽均购自广州威佳科技;硫酸铵为国产分析纯。

　　地衣芽孢杆菌的产酶发酵

　　用接种环在活化好的菌种斜面上刮下一环菌种，将其转入到种子培育基，30℃、240r/min摇床振荡培育16h。

以20%接种量转接于发酵培育基（30mL发酵液/300mL三角瓶）中，在30℃下240r/min摇床培育28h后搜集菌体。

　　γ-GTP粗酶的制备

　　γ-GTP发酵瓶培育液离心（4800r/min,10min），弃上清液，用TE缓冲液（Tri-HCl缓冲液,pH，10mol/L）重悬菌体,采纳溶菌酶法和硫酸铵盐析法制备粗酶液。

　　酶对温度的耐受性

　　以TE为缓冲液，不同温度下保留20min，测定酶活力[1]。

　　酶对pH的耐受性

　　采纳Na2HP04柠檬酸缓冲液;、采纳NaAc-HAc缓冲液;采纳磷酸盐缓冲液;、采纳Tris-HCl缓冲液;pH110、采纳甘氨酸-NaOH缓冲液;在25℃下保留30min，测定酶活力。

　　酶的最适反映温度

　　以TE为缓冲液，别离在不同温度下测定酶活力。

　　酶的最适反映pH

　　采纳Na2HP04-柠檬酸缓冲液;、采纳NaAc-HAc缓冲液;采纳磷酸盐缓冲液;、采纳Tris-HCl缓冲液;pH110、采纳甘氨酸-NaOH缓冲液，采纳酶活测试方式检测酶活力。

　　金属离子对酶活力的阻碍

　　在反映体系中别离加入各类金属离子，终浓度均为5mmol/L，采纳酶活测试方式检测酶活力。

　　2结果

　　酶对温度的耐受性

　　γ-GTP对40℃及以上温度的耐受性较差，当温度达到50℃时，通太短时刻的保留,酶活力大体丧失。

但在25~35℃的温度范围有较好的稳固性，专门是在常温下，通过20min的保藏，酶活力大体未变。

因此该酶的保藏条件比较简单，适合工业生产茶氨酸。

见图1。

[PSc1781;S*2〗图1γ-谷氨酰转肽酶对温度的耐受性Figure1Temperaturetoleranceofγ-GTP　　酶对pH的耐受性

　　γ-GTP对酸性环境的耐受性很差，在pH低于时，短时刻保留后酶活力大体丧失，而在碱性条件下，最高能够耐受的环境而维持较高的酶活力。

其中是其最正确的保藏pH。

因此能够选用的缓冲液保留该酶。

见图2。

　　[PSc1782;S*2〗图2γ-谷氨酰转肽酶对pH的耐受性Figure2TolerancetopHofγ-GTP

　　酶的最适反映温度

　　γ-GTP对温度的适应性很强，在37~55℃以下均具有较高的酶活力，其中在45℃时酶活力最高。

因此能够确信依照γ-GTP酶活力检测方式取得γ-GTP的最适反映温度为45℃。

见图3。

　　酶的最适反映pH值

　　γ-GTP对酸性环境适应力很差，而在弱碱性条件下表现出较高的酶活力，其中在时酶活力最高。

因此能够确信依照γ-GTP酶活力检测方式取得γ-GTP的最适反映pH为。

见图4。

　　金属离子对酶活力的阻碍

　　在反映体系中加入5mmol/L的各类金属离子除亚锡离子外均会对酶的活力有增进作用。

但在金属离子中，一价金属离子钾离子和钠离子和三价金属离子铁离子和铝离子的加入对酶的增进作用明显低于二价金属离子锰离子、钙离子和镁离子。

另外，添加重金属离子亚锡离子由于会引发蛋白质的变性，致使酶活力消失;有的金属离子如锰离子、镁离子等可较大程度的提高酶活力，这可能是由于这些金属离子会对γ-GTP的活性中心产生阻碍的缘故。

见图5。

[PSc1783;S*2〗图3γ-谷氨酰转肽酶最适反映温度Figure3Optimumreactiontemperatureforγ-GTP[PSc1784;S*6/7〗图4γ-谷氨酰转肽酶最适反映pH　　Figure4TheoptimumreactionpHforγ-GTP[PSc1785;S*2〗图5不同金属离子对γ-谷氨酰转肽酶酶活力的阻碍Figure5Effectsofvariousmetalionsontheactivityofγ-GTP

　　在一样情形下，适合的金属离子及适合的浓度会对酶的催化活性产生增进作用，但如果是反映体系中金属离子浓度太高，反而会对酶蛋白产生迫害作用。

为此，可选择对γ-GTP阻碍较大的镁离子研究浓度与酶活力的关系。

　　Mg2+浓度对酶活力的阻碍比较显著。

在低于mmol/L的浓度范围内，酶活力随着Mg2+浓度的增加而增高，当浓度达到mmol/L时酶活力最高，尔后，酶活力随着Mg2+浓度上升而缓慢下降。

由此可见，在图5所涉及的金属离子（除亚锡离子外）尽管在5mmol/L的浓度下对酶活力均有增进作用，但在不同浓度下有些金属离子也会对酶起到抑制作用。

见图6。

　　[PSc1786;S*2〗图6镁离子浓度对γ-谷氨酰转肽酶活力的阻碍Figure6EffectsofMg2+concentrationonγ-GTP

　　3讨论

　　地衣芽孢杆菌所产生的γ-GTP在25~35℃的温度范围有较好的稳固性，在50℃的温度下保留20min酶活力大体丧失，这为进一步利用该酶转化生产茶氨酸时的温度条件提供了依据。

该酶对酸性环境无耐受性，适宜在碱性条件下保留，在pH低于11的碱性条件下保留30min，酶活力大体无损失。

利用γ-GTP生产茶氨酸需要反映体系pH为10[9]，而该酶在此pH下比较稳固，说明地衣芽孢杆菌所产生的γ-GTP适合于酶法转化生产茶氨酸。

　　依照γ-GTP酶活力检测方式取得地衣芽孢杆菌所产γ-GTP的最适反映温度为45℃，最适合反映pH为，在金属离子浓度为5mmol/L的情形下，钾离子、钙离子和镁离子等金属离子对酶的活力均无损害，其中有些金属离子（Mn2+,Ca2+）的存在对酶活力增进作用较大（见图5），在酶转化生产茶氨酸选择适合的离子浓度对酶活力的提高有较大的增进作用，如当镁离子浓度为mmol/L时酶活力提高了%。

　　本文仅对γ-谷氨酰转肽酶的基础酶学性质进行了初步研究，有关催化动力学常数，和利用该酶生产茶氨酸的适合工艺条件还有待进一步的探讨。

【参考文献】

　[1]MEISTERA,TATESS.γ-Glutamyltranspeptidase[J].MethodsinEnzymology,1981,77:

237-253.

　　[2]TALALAYPS.GlutathionebreakdownandtranspeptidationreactioninProteusvulgaris[J].Nature,1954,174（4428）:

516-517.

　　[3]BENINIF,PIGOZZIMG,POZZIA,etofserumgamma-glutamyltranspeptidaseactivityisfrequentinchronichepatitisC,andisassociatedwithinsulinresistance[J].DigLiverDis,2020,41（8）:

586-590.

　　[4]李公祥,孙宗钦.肾脏疾病患者尿液γ-谷氨酰转肽酶的测定[J].职业与健康,2003,19（11）：

57.

　　[5]HIDEYUKIS,YOKOK,HIDEHIKOofthebittertasteofaminoacidsthroughthetranspeptidationreactionofbacterialγ-glutamyltra