兽医微生物学重要知识点汇总.docx
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兽医微生物学重要知识点汇总
兽医微生物学重要知识点汇总
绪言
1、微生物学的定义：
研究微生物形态、生理、遗传变异、生态分布以与其与人类关系的科学，广义的微生物学还包括免疫学，甚至还包括寄生虫学，特别是原虫学。
2、微生物的特点：
①个体微小，需借助显微镜观察，其群体可见。
②结构简单，繁殖快，分布广。
③比较面积大（有利于物质交换，代谢繁殖）。
④易变异，适应性强。
3、微生物的种类：
三型八大类（三菌四体一病毒）
真菌细胞型：
细胞核有核膜、核仁，细胞器完整。
Eg:
真菌。
原核细胞型：
仅有原始核，无核仁、核膜，细胞器很不完善。
DNA和RNA同时存在（拟核/核体）Eg：
细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。
非细胞型微生物：
最小的一类微生物，无典型细胞结构。
只能在活细胞内生长繁殖。
核酸类型为DNA或RNA.Eg：
病毒。
4、微生物学的发展过程
第一阶段——形态学时期：
1683年荷兰吕文虎克首次观察到微生物。
1861年巴斯德否定“自然发生说”；证明发酵由微生物引起的。
第二阶段——生理学与免疫学的奠基时期：
Ⅰ巴斯德（微生物学、生理学与免疫学的主要奠基人）的历史性贡献：
①酒是某种微生物的发酵产物②解决了酒的败坏问题③研究炭疽病、人的狂犬病，确定这些疾病由相应的微生物引起、微生物可以至弱作作预防传染病用，而且对至弱的途径做了示范性的试验④发明免疫学的预防接种⑤发明巴氏消毒法
Ⅱ科赫（建立微生物研究的基本操作技术和对病院细菌的研究，有突出贡献）功绩：
①发明培养基并用于纯化微生物②发明染色观察、显微摄影③科赫法则④证实炭疽病原因--炭疽杆菌发现结核病源菌--结核杆菌
【科赫法则：
①病原微生物应在同一疾病中查见，但在健康动物体内不存在②该病原菌能被分离培养得纯种③该纯培养物接种至易感动物，能产生同样的疾病④自人工感染的实验动物体内能再次分离培养得到相同的病原】
【免疫方法：
注射、口服、点眼、滴鼻、气雾】
第三阶段——近代与现代微生物
理论上取得的成就极其应用价值：
①进入真正意义上的基因工程时代②进行化学治疗腰肌和抗生素的研究③组织移植、免疫耐受的研究，抗原抗体反应在诊断与防治疾病上的应用
技术上的重大创新与其应用价值①电子显微镜的应用②标记抗原或标记抗体的应用③细胞培养、空斑技术、蛋白质与核酸的提纯④核磁共振仪的使用⑤分子克隆、PCR（聚合酶链式反应）、DNA测试、基因组学与电子计算机等技术的应用
微生物学领域的三大进展：
微生物遗传学、免疫学与病毒学
第1篇总论
第一章细菌的形态结构
【内容提要】
细菌个体微小，经染色后在光学显微镜下才能观察。
最常用的是革兰染色法，可讲细菌分为革兰阴性和革兰阳性两大类。
就某种细菌而言，菌体有一定的大小、形态与排列方式。
细菌的基本结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质与拟核等。
革兰阳性菌的细胞壁有较厚的肽聚糖与特有的磷壁酸。
革兰阴性菌有外膜，外膜由外膜蛋白、脂多糖等构成，外膜下有一薄层肽聚糖。
细菌的特殊结构有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等，各有一定的结构与特殊的生理功能，与细菌的致病性与免疫原性有关。
细菌是原核生物界中的一大类单细胞微生物，它们个体微小，形态结构简单，广义的细菌除一般细菌外，还包括立克次体、衣原体、支原体、螺旋体与放线菌。
复习思考题
1、细菌的大小、基本形态
答：
大小：
细菌个体微小，需染色后在光学显微镜下才能观察到。
细菌大小的度量单位通常是微米。
形态：
形态比较简单，有球状、杆状和螺旋状三种基本形态与某些其他形态。
细菌的繁殖方式都是简单的裂殖，不同细菌裂殖后其菌体排列方式不同。
有特征性的、相对稳定的形态和排列方式的细菌有球菌、双球菌、链球菌、葡萄球菌（四联、八叠）、杆菌、螺形菌
适宜条件下培养的细菌在对数生长期形态典型。
不亮环境或老龄期，会出现与正常形状不一样的个体，称为衰老型或退化型。
但有些细菌即使在适宜的环境中生长，其形状也很不一致，有多形性。
2、菌落的概念，菌落的实际意义
菌落：
某个细菌在适宜的条件下、在适合生长的固体培养基表面或内部，培养后分裂繁殖出巨大的菌体，形成一个肉眼可见的、有一定形态的独立群体。
【单个细菌与其后代组成的“大家族”】
菌苔：
生长的菌落连成一片。
【多个“大家族”】
菌落的实际意义：
菌落肉眼可见，各种细菌的菌落在大小、色泽、质地、表面形状、边缘结构等方面均有个各自的特征。
观察细菌的菌落特征，可推测该细菌的种类，工作中通常通过固体培养基上分离培养的菌落，进行细菌的分离、纯化、传代、计数和鉴定等。
3、细菌的基本结构和特殊结构（绘制细菌结构模式图）
基本结构：
细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核等基本结构。
特殊结构：
荚膜、S层、鞭毛、菌毛、芽孢等。
4、比较革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁的异同
阳性
阴性
厚度
厚15~80nm
薄10~15nm
肽聚糖
多40%~95%
少10%~20%
脂类
少1%~4%
多11%~22%
磷壁酸
√
×
外膜
×
√
脂蛋白
×
√
脂多糖
×
√
5、脂多糖和外膜蛋白的组成与功能
组成
功能
脂多糖（LPS）
（革兰阴性菌所特有，位于外膜的最表面）由类脂A、核心多糖和侧链多糖三部分组成
①能够吸附钙离子、镁离子等阳离子②为噬菌体提供特异的吸附受体
外膜蛋白（OMP）
（外膜中向前的多种蛋白质的统称，按含量和功能分为主要次要两类）
主要OMP:
微孔蛋白、脂蛋白
微孔蛋白：
分子筛作用，与细胞粘附和特定物质摄取有关、受体作用
脂蛋白：
使外膜层与肽聚糖牢固的连接，可作为噬菌体的受体，或参与铁与其他营养物质的转运
6、细菌的遗传物质
拟核和质粒。
遗传物质DNA无核膜包围，分布于菌体中央形成拟核（核体）。
拟核含细菌的遗传基因，其功能是控制细菌的遗传和变异。
质粒在拟核DNA之外，游离的小型双股DNA分子，含细菌生命非必须基因，其功能是控制产生菌毛、毒素、耐药性和细菌素等遗传性状。
质粒能独立复制传给子代。
7、细菌荚膜的概念与主要功能
概念：
某些细菌在其生活过程中，在细胞壁的外周产生一层包围整个菌体、边界清楚的粘液样物质。
主要功能：
①抗吞噬②抗有害物质损伤③营养物质的储存场所（主要含多糖类）与废物排出之地。
8、细菌芽孢的特点与意义
（某些革兰阳性菌在一定的环境条件下，在菌体内形成一个圆形或卵圆形的休眠体，称为芽孢或内芽孢。
未形成芽孢的菌体称为繁殖体或营养体，老龄芽孢将脱离原菌体独立存在，称为游离芽孢）
特点：
①对高温、干燥、辐射、化学药物等有强大的抵抗力。
②含水量低，壁厚而致密，通透性差不易着色，折光性强。
③芽孢内新陈代谢几乎停止，处于休眠状态，但能保持潜在萌发力。
④不是繁殖器官，一个芽孢萌发只产生一个营养状态的细胞。
意义：
①芽孢抵抗力强，可在自然界中存在多年，是重要的传染源，但芽孢并不直接引起疾病，只有发芽成为繁殖体后，才能迅速大量繁殖而致病。
②芽孢抵抗力强，故应以杀灭芽孢座位可靠的灭菌标准。
③可根据其形态位置鉴别细菌
第二章细菌的生长繁殖与生态
【内容提要】
细菌菌体的形成是一个复杂的过程，涉与物质摄取、生物合成、聚合作用（DNA复制，转录、翻译）与组装四个步骤。
菌体以二等分分裂法无性繁殖。
细菌群体的生长繁殖和培养时间呈特定规律，用生长曲线表示，并可分为迟缓期、对数期、稳定期与衰亡期四个阶段。
大多数细菌可在人工培养基上生长。
根据细菌对氧气和温度的需求差异，可将细菌分为需氧菌、厌氧菌、兼性菌以与嗜温菌、嗜冷菌、嗜热菌等。
生化试验系根据细菌传代特点设计，用于细菌鉴定。
自然界中的细菌多以群落存在，生物被膜是一种重要的表现形式，其抵抗力较游离细菌强，其生长受控于密度感应系统。
后者通过信号分子作用，在基因水平完成对细菌群落生长的调控。
微生物种群之间在自然界存在着复杂的相互作用，正常菌群对维护动物健康至关重要。
复习思考题
1、形成细菌个体的代谢过程有何特点？
①细菌生长和繁殖速度极快，超过动物细胞10~100倍
②细菌利用各种化合物作为能源的能力远远强于动物细胞
③细菌对营养的需求比动物细胞更为多种多样，因为他们有多种代谢旁路
④细菌可利用超长流水线式的生产方式生成大分子物质
⑤细菌能生产诸如肽聚糖、脂多糖、磷壁酸等特殊物质
2、物质摄取的方式有哪几种？
各有何特点？
单纯扩散
被动扩散，细胞内外物质最简单的一种交换方式。
细胞膜两侧的物质靠浓度差（浓度梯度）进行分子扩散，不需要能量。
无特异性和选择性，速度较慢，细胞内为溶质浓度一旦达到平衡，扩散便停止。
促进扩散
某些物质与某些位于细胞膜的特异性载体蛋白相结合，然后将其转运至细胞内，这一过程具有特异性和选择性，不需要能量。
主动运输
细菌吸收营养物质的一种主要方式，需要特异性载体蛋白，能将特异性溶质逆浓度梯度泵入细胞，因此需要能量。
基因位转
物质在运输的同时受到化学修饰，从而能愠缘不断输入细胞，此种方式在缺氧环境中最常见，其过程涉与从可溶物向分子的化学变化，需要特异性载体蛋白的参与，需要能量。
3、细菌菌体分裂为什么只需较短时间？
细菌以二等分分裂法进行无性繁殖。
大多数细菌菌体在适宜条件下分裂需要较短时间，是因为在上一轮的复制还未完成时，下一轮的细胞分裂已经启动。
此外染色体DNA存在多个复制叉，可使自带的染色体DNA同时开始部分复制。
4、何谓细菌的生长曲线？
如何确定？
有何意义？
不同时期有何特点？
细菌生长曲线：
将细菌接种在液体培养基并置于适宜的温度下，定时取样检查活菌数，可发现其生长过程具有规律性。
以时间为横坐标、以活菌数为纵坐标，可得出一条生长曲线。
曲线显示了细菌生长繁殖的四个期。
细菌的生长曲线是在体外人工培养条件下观察到的，在动物体内因受诸多因素的制约，未必能出现此种典型的曲线，但对细菌生长规律的研究与实践有重要的参考价值。
以下为各个时期与其特点：
迟缓期
细菌来到新环境的一个适应过程。
菌体增大，代谢活跃，合成并积累所需酶系统。
RNA含量明显增加，但DNA含量无变化。
此时细菌数并不增加。
对数期
细菌此时生长迅速，以恒定的速度进行分裂繁殖，活菌数以几何级数增长，达到顶峰。
生长曲线接近一条斜的直线。
该期的病原菌致病力最强，其形态、染色特性与生理活性较典型，对抗菌药物的作用较为敏感。
稳定期
因营养的消耗、代谢产物的蓄积等，细菌繁殖速度下降，死亡数逐步上升，新繁殖的活菌数与死亡数大致平衡。
该期细菌的形态与生理形状常有改变。
毒素等代谢产物大多在此时产生。
衰亡期
细菌开始大量死亡，死菌数超过活菌数。
细菌菌体变形或自溶，染色不典型，难以进行鉴定。
5、何谓培养基？
种类有哪些？
培养基还是人工配制的基质，含有细菌生长繁殖必需的营养物质。
培养基制成后，通常都要进行灭菌处理。
种类：
按营养组成，状态，功能差异区分
基础培养基
含多数细菌生长繁殖所需的基本营养成分，常用新鲜牛肉浸膏，加入适量的蛋白胨、NaCl、磷酸盐，调节pH至7.2~7.6即成。
营养培养基
在基础培养基内，添加葡萄糖、血液或血清等，即成营养培养基，最常用的是血琼脂平板（在营养琼脂中加入5%的新鲜血液配制成）
液体培养基
在液体培养基中加入1%~2%的琼脂，加热融化再冷却凝固。
用于细菌的分离纯化、菌落观察、生物活性检测等，可制成试管斜面或倾倒平面。
固体培养基
在液体培养基中加入0.5%的琼脂。
可做穿刺试验，观察细菌的运动力。
半固体培养基
鉴别培养基
针对特定菌种设计，根据其特定产物，在培养基中加入特定作用底物或显色指示剂，凭肉眼识别颜色既能鉴别菌种。
Eg三糖铁培养基和麦康凯培养基。
选择培养基
在培养基中加入某些化学物质，对不同细菌分别产生抑制或促进作用，从而可从混杂多种细菌的样本分离出所需细菌。
Eg麦康凯培养基、SS培养基、伊红美蓝培养基等。
厌氧培养基
为培养厌氧菌而设计。
6、试述主要的细菌生化反应的原理与用途。
P28P29
各种细菌能够分解利用的营养物质不同，对相同营养物质的分解产物也不同，据此可以设计特定的生化反映，作为鉴定细菌只用。
细菌的合成代谢产物如毒素、色素等也有一定的鉴别意义，但一般不用生化反应检测。
常用的生化反应有氧化酶实验、触酶试验、氧化发酵（O/F）实验、VP试验与甲基红实验等。
可采用微量法和常量法。
目前一般多用商品化的微量生化试剂检测剂盒。
VP试验
由两学者创建得名。
大肠杆菌和产气杆菌均能发酵葡萄糖，产酸，产气，两者不能区别。
但产气杆菌能使丙酮酸脱落，生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被空气中的分子样所氧化，生成的乙二酰与培养基中含胍基的化合物发生反映，生成红色化合物，是为阳性。
大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，故为阴性。
甲基红试验
在VP试验中，产气杆菌分解葡萄糖，产生的两分子丙酮酸转变为一分子中性的乙酰甲基甲醇，故最终的酸类较少，培养液pH＞5.4。
以甲基红（MR）做指示剂是，溶液呈橘黄色，是为阴性。
大肠杆菌分解葡萄糖时，丙酮酸不转变为乙酰甲基甲醇，故培养基酸性较强，pH≤4.5，甲基红指示剂呈红色，则为阳性。
7、生物被膜有何特点。
生物被膜中的细菌由于被多糖等物质包埋而受到保护，对外环境的抵抗力与对抗生素的抗性均较同种游离的单个菌体强，影响抗生素的疗效和灭菌效果。
电镜下可观察到细菌的生物被膜呈连片状的菌体团块。
研究表明有的细菌如嗜水气单胞菌，治病菌株可形成生物被膜，而非致病菌不形成。
生物被膜的形成手细菌的密度感应系统调控。
8、何谓密度感应系统调控？
举例说明其应用价值。
P30
9、试述益生菌和益生元的概念与应用价值。
某些细菌或真菌有利于宿主胃肠道微生物区系的平衡，能抑制对宿主有害的微生物的生长，用这些微生物制成的制剂称为益生菌或益生素。
饲料或食品中的某些寡糖例如果寡糖（FOS）等成分，不被宿主消化吸收，但等选择性的刺激宿主消化道有益微生物或饲喂的益生菌的生长，对宿主产生有益作用，此类成分叫益生元或益生素元。
益生菌与一生缘亦可联合使用。
二者对动物有一定的保健作用。
10、何谓菌群失调？
保持动物正常菌群有何重要意义？
因患病、外科手术、环境改变和滥用抗菌药物等原因，宿主某个微生物正常菌群中的细菌种类和数量发生改变，对机体造成损失，出现一定病理效应的状态，称为菌群失调。
例如长期连续或短期大量口服大肠杆菌敏感的抗菌药物，杀死了肠道有益大肠杆菌，致使对抗菌药物不敏感的致病性大肠杆菌或其他肠道致病菌借机大量增值，引起肠道疾病。
正常菌群与其宿主之间形成一个共生关系，具体表现在营养免疫和生物拮抗三个方面。
P32
11、试述悉生生物学和悉生动物的概念、实验动物分类（包括定义）以与培育实验动物的意义。
悉生动物学：
是用无菌动物技术研究微生物与其宿主相互关系的生命科学，它是在科学研究与临床医学中应用悉生动物的科学。
悉生动物：
一切生命形态都知道的动物。
根据概念可分为五类，其中无特定病原体动物应用正日趋广泛。
无菌动物
不带任何微生物的动物，即无外源菌动物。
实际上某些内源性病毒或正常病毒很难去除，因此无菌动物事实上是一个相对概念。
无菌动物中还有一种无γ球蛋白动物。
悉生动物
侠义的悉生动物是指无菌动物，广义也指有目的地带有某种或某些已知微生物的动物。
无菌动物带有或接种了一种微生物的动物叫单联悉生动物，带两种微生物者称双联微生物，依次类推，称为三联或多联微生物。
无特定病原体动物（SPF）
是指不存在某些特定的具有病原性或潜在病原性微生物的动物。
例如为了排除某些细菌如假单胞菌属、变形杆菌属、克雷伯菌属等的干扰，可通过无菌动物与这些细菌以外的正常菌群相联系培育SPF动物。
清洁动物
是指动物来源于剖腹产，饲养与半屏蔽系统，其体内外不能携带人畜共患病和动物主要传染病的病原体。
是无菌动物与健康动物纯正的正常微生物群相联系的结果。
普通动物
是指在开放条件下饲养，其体内外存在着多种微生物和寄生虫，但不能携带人畜共患病病原微生物的动物。
培育实验动物的意义：
由于无菌动物不受任何微生物的刺激和干扰，所以可以用于研究动物体内外微生物区系对机体的影响与微生态学研究，可用来研究免疫、肿瘤、病理与传染病的净化等。
由于无菌动物的培育和饲养技术很困难，所以通常用悉生动物代替。
第三章消毒、灭菌与兽医微生物实验室的生物安全
【内容提要】
消毒和灭菌是兽医微生物学实践中的最常用的措施。
常用的火焰灭菌法、热空气灭菌法、高压蒸汽灭菌法、巴氏消毒法与煮沸灭菌法各有特点和实用范围。
可见光中的紫外线和红外线有杀菌作用，光复活作用是一个值得注意的现象。
Γ射线和微波等也常用于灭菌。
滤过除菌应用广泛，制造生物制品等药品的车间的空气需要滤过并要求达到一定的洁净程度。
化学消毒剂的功效易受环境因素的影响，抗生素等用于细菌感染的治疗。
细菌素对同种或类似细菌有一定的抑杀作用。
根据从事的病原微生物的危害性的差异，兽医微生物实验室通常通常分为生物安全等级1~4级（BSL1~4）4种规格，BSL~4是最高安全级别。
我国农业部将动物病原微生物分为一至四类，一类危害性最大。
复习思考题
1、灭菌、消毒、防腐、无菌的概念？
答：
（1）灭菌：
杀灭物体上所有微生物的方法，包括杀灭细菌芽胞霉菌孢子在内的全部病原微生物和非病原微生物。
（2）消毒：
杀灭物体上病原微生物的方法，仅要求达到消除传染性的目的，而对非病原微生物与其芽胞、孢子并不严格要求全部杀死。
（3）防腐：
阻止或抑制物品上微生物生长繁殖的方法，微生物不一定死亡。
（4）无菌：
无菌为不存在活细菌的意思。
防止或杜绝细菌进入动物、人或其他物品的方法称为无菌操作。
2、物理消毒灭菌方法主要有哪些？
如何合理选用？
答：
（1）热力灭菌法：
高温灭菌法是最古老、作用最大、应用最广、使用最简便以与效果最可靠的灭菌方法。
热力使蛋白质中的氢键破坏使之变性或凝固，使双股DNA分开为单股，活化核酸酶使单股DNA断裂。
细菌繁殖体对其最为敏感，其次的真菌和病毒，细菌芽胞对热有很强的抵抗力作用。
热力灭菌法分为干热灭菌和湿热灭菌两大类，在同一温度下后者的效力比前者大，这是因为湿热中菌体蛋白较易凝固、湿热穿透力比干热强、蒸汽变为液态时可释放大量潜热迅速提高被灭菌物体的温度。
（2）辐射灭菌法辐射包括电磁波辐射和粒子辐射。
辐射除可被一些产色素细菌利用作为能量源外，对多数细菌有损害作用。
（3）超声波杀菌法
超声波裂解细胞的主要机制：
它通过水发生空（腔）化作用，在液体中造成压力改变，应力薄弱区形成许多小空腔，逐渐增大，最后崩裂。
有残存，费用颇大，故未应用于消毒灭菌。
目前主要用于裂解细胞，提取细胞组分进行研究。
（4）滤过除菌法
概念：
是通过机械、物理阻流作用将液体或空气中的细菌等微生物除去的方法。
适用条件：
通常不能除去病毒、支原体、细菌L型等微生物。
糖培养液、各种特殊的培养基、血清、毒素、抗毒素、抗生素、维生素、氨基酸等不能加热灭菌的液体常用滤器过滤除菌。
此外，还可以进行病毒的分离。
利用空气过滤器可以进行超净工作台、无菌隔离器、无菌操作室、实验动物室以与疫苗、药品、食品等生产厂房的空气滤过除菌。
（5）干燥与低温抑菌法
干燥→失水→新陈代谢障碍→菌体蛋白质变性或盐类浓度增高→死亡
利用高浓度的盐溶液或糖溶液保存食品，是由于高浓度的溶液吸取菌体内的水分，造成微生物的生理性干燥而达到抑菌的目的。
类型
概念
方法、灭菌机制
条件
干热灭菌法
火焰灭菌法
以火焰直接灼烧杀死物品中病原微生物的方法
灼烧（直接用火焰灭菌）
适用于耐烧的接种针（环）、金属器具、试管口等的灭菌
焚烧（直接点燃或者焚烧炉内焚烧）
常用于烧毁的物品，如患病动物尸体、病畜禽的垫料与其他污染废弃物等
热空气灭菌法
利用干热灭菌器，以干热空气进行灭菌的方法
在干热情况下，由于热空气的穿透力较低，需在160℃维持2h才能达到杀死所有微生物与其芽胞、孢子的目的。
适用于高温下不损坏、不变质、不蒸发的物品，如各种玻璃器皿、瓷器、金属器械等
湿热灭菌法
煮沸消毒法
常压下煮沸10~20min可杀死所有细菌的繁殖体，芽胞长需煮沸1~2h才能被杀死。
若在水中加入2％碳酸钠或2％~5％石炭酸，可以提高沸点，增强杀菌力
外科手术器械、注射器、针头以与食具等多用此法消毒
巴氏消毒法
以较低温度杀灭液态食品中的病原微生物或特定微生物，而又不严重损害其营养成分和风味的消毒方法
①.低温维持巴氏消毒法：
在63~65℃维持30min；
目前主要应用于葡萄酒、啤酒、果酒、牛乳等食品的消毒。
超高温巴氏消毒法的鲜乳在常温下保质期可长达半年。
②高温瞬时巴氏消毒法：
在71~72℃保持15s；
③超高温巴氏消毒法：
在132℃保持1~2s。
加热消毒后迅速冷却至10℃以下（冷击法）
流通蒸汽消毒法
是利用一个标准大气压下100℃的流通蒸汽进行物品消毒，又称常压蒸汽消毒法
100℃的蒸汽维持30min足以杀死细菌的繁殖体，但细菌的芽胞和真菌孢子不能被全部杀灭。
该法常用阿诺德流通蒸汽灭菌器或蒸笼。
流通蒸汽灭菌法
利用反复多次的流通蒸汽间歇加热以达到杀灭所有微生物的方法，又称间歇灭菌法或丁达尔灭菌法
在流通蒸汽灭菌器内进行第一次流通蒸汽灭菌后，将物品移植37℃保温箱中保温过夜，待芽胞萌发出芽，次日以同样的方式再进行一次灭菌和保温过夜，如此连续3次以上，可达到完全灭菌的效果。
此法常用于一些不耐高温的培养基，如鸡蛋培养基、血清培养基、糖培养基的灭菌。
如将物品在70~80℃加热1h。
连续6次，也可达到灭菌目的，且可不破坏血清等物质。
根据灭菌对象不同，温度、加热时间、次数，均可适当增减。
高压蒸汽灭菌法
用高压蒸汽灭菌器进行灭菌的方法。
在103.4kPa蒸汽压下，于121.3℃维持15~20min，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。
是应用最广、最有效的灭菌方法。
凡耐高温、不怕潮湿的物品，如各种培养基、溶液、玻璃器皿、金属器械、敷料、橡皮手套、工作服和实验小动物尸体等均可。
类别
概念
方法、灭菌机制
条件
非电离辐射
可见光
是指红外线和紫外线之间的肉眼可见的光线，波长400~800nm
可见光具有微弱的杀菌作用，若将某些染料如结晶紫、美蓝、汞溴红、伊红、沙黄等加到培养基或涂在外伤表面，能增强可见光的杀菌作用，这一现象称为光感作用。
一般在有氧的情况才出现光感作用。
（染料激活氧或染料氧化起杀菌作用）
光感作用对原生动物、细菌、毒素、病毒和噬菌体等均有灭火作用。
革兰阳性菌对光感作用比阴性敏感，美蓝、汞溴红、伊红仅作用于革兰阳性菌，而沙黄则作用于革兰阴性菌。
日光
直射日光有强烈的杀菌作用
多数微生物在直射日光的照射下半小时到数小时即可死亡。
芽胞往往须经20h才可死亡。
效果影响因素众多。
实际生活中，日光对被污染的土壤、牧场、畜舍、用具等的消毒以与江河的自净作用均有重要意义
紫外线
紫外线波长200~300nm部分具有杀菌作用，其中265~266nm杀菌力最强。
紫外线损害DNA构型，干扰DNA的复制和转录；使空气中的分子氧变为臭氧，释放出氧化能力强的氧原子。
实验室通常使用的紫外线杀菌灯，杀菌力强而稳定
紫外线的穿透力弱，故只能用于微生物实验室、无菌室、手术室、传染病房、种蛋室等的空气消毒，或用于不能用高温或化学药品消毒的表面消毒；光复活作用。
红外线
红外线是波长为0.77~1000微米的电磁波，尤以1~10微米的热效应最强
利用红外线烤箱灭菌。
无需空气传导，可是照射物体表面迅速升温。
灭菌作用与干热相似，灭菌时间、所需温度亦同
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