电泳纯度非还原型SDSPAGE测定标准操作规程.docx
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电泳纯度非还原型SDSPAGE测定标准操作规程
细胞因子电泳纯度(非还原型SDS-PAGE测定标准操作规程依据:
《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围:
适用于细胞因子纯度的检测。
目的:
检测细胞因子蛋白质纯度。
原理:
蛋白质具有不同的电荷和分子量,在经过阴离子去污剂SDS处理后,蛋白质分子上的电荷被中和,在聚丙稀酰胺凝胶电泳时,不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布,电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量。
由于不连续的PH梯度作用,样品被压缩成一条狭窄区带,采用染色液染色,经扫描仪扫描胶片可及时观察结果。
内容:
1材料
1.1样品:
经二人复核批号无误后检测
1.2试剂
甲醇CH
3
OH分析纯
无水乙醇CH3CH
2
OH分析纯
浓盐酸HCl分析纯
甘油C3H
8
O
3
分析纯
硝酸银AgNO
3
分析纯
重铬酸钾K2Cr
2
O
7
分析纯
正丁醇C4H
9
OH分析纯
甲醛HCHO分析纯
丙烯酰胺CH2CHCONH
2
分析纯
甲叉双丙烯酰胺(CH2CHCONH
2
2
CH
2
分析纯
过硫酸铵(NH4
2
S
2
O
8
分析纯
TEMED(四甲基乙二胺(CH3
2
N(CH
2
2
N(CH
3
2
分析纯
甘氨酸C2H
5
NO
2
分析纯
SDS(十二烷基硫酸钠C12H
25
O
4
SNa分析纯
乙酸CH
3
COOH分析纯
碳酸钠Na2CO
3
分析纯
溴酚蓝C19H
10
Br
4
O
5
S分析纯
1.3注射用水:
符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1.4设备
1.4.1扭力天平上海第二天平仪器厂
1.4.2垂直板状电泳槽北京东方仪器厂
1.4.3恒温恒流电泳仪法玛西亚公司
1.4.4快速电泳槽BIORADUSA
1.4.5全自动扫描仪CS-930日本岛津
1.4.6TS-1型摇床
1.5器皿:
500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管3000ml三角瓶、平皿、1000ml烧杯、80ml烧杯,以上器皿经本室洗刷组处理。
2方法
2.1准备工作
2.1.1工作环境:
控制区,确认场地清场合格,摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。
2.1.2调试仪器设备
2.1.2.1恒温恒流电泳仪工作状态良好,已经挂“备用”标志牌。
2.1.2.2全自动扫描仪工作状态良好,已挂“备用”标志牌。
2.1.2.3扭力天平工作状态良好,已挂“备用”标志牌。
2.1.3摘下扭力天平“备用”标志牌,挂“运行中”标志牌。
2.1.4配液:
以下溶液的配制完成后,均需经二人复核无误后,在瓶外贴标签,注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。
2.1.4.1聚丙烯酰胺凝胶母液100ml
用扭力天平准确称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加50ml注射用水溶解后定容至100ml,过滤,置于棕色瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,4℃冰箱放置。
一般不超过1~2个月。
2.1.4.2分离胶缓冲液100ml
用扭力天平准确称取Tris18.15g,溶于80ml注射用水中,溶解后,加浓盐酸调节pH8.8,补加注射用水至100ml,置于250ml瓶中,二人复核,贴签,标明溶液
的名称、浓度、体积、批号、配制日期,4℃冰箱放置。
2.1.4.3浓缩胶缓冲液100ml
用扭力天平准确称取Tris6.05g,溶于80ml注射用水中,溶解后,加浓盐酸调pH6.8,补加注射用水至100ml,置于250ml瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,4℃冰箱放置。
2.1.4.41%SDS50ml
用扭力天平准确称取SDS0.5g,溶于50ml注射用水中,溶解后,置于棕色瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,常温保存。
2.1.4.51%TEMED50ml
用吸管准确吸取TEMED0.5ml,溶于50ml注射用水中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,4℃冰箱放置。
2.1.4.61%过硫酸铵50ml
用扭力天平准确称取过硫酸铵0.5g,溶于50ml注射用水中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,4℃冰箱放置。
2.1.4.7电极缓冲液3000ml
用扭力天平准确称取Tris9g、甘氨酸43.2g、SDS3g,溶于2000ml注射用水中,补加注射用水至3000ml,置于3000ml三角瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,常温贮存。
2.1.4.8固定液500ml
用量筒准确量取甲醇250ml,乙酸50ml,补加注射用水至500ml,置于500ml瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,常温贮存。
2.1.4.9洗液3000ml
用量筒准确量取无水乙醇300ml,乙酸150ml,补加注射用水至3000ml,置于3000ml三角瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,常温贮存。
2.1.4.10重铬酸钾溶液200ml
用扭力天平准确称取重铬酸钾10g,加注射用水至200ml;加浓HNO
3
2ml摇匀溶解,置于棕色瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制
日期,常温保存。
2.1.4.11硝酸银溶液200ml
用扭力天平准确称取硝酸银0.4g,加注射用水至200ml,置于棕色瓶中,避光保存,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,限当次试验使用。
2.1.4.12显色液3000ml
用扭力天平准确称取Na2CO
3
18g,加注射用水至3000ml,溶解后,加0.6ml甲醛,
置于3000ml三角瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,常温贮存。
2.1.4.13终止液500ml
用吸管准确吸取乙酸5ml,溶于500ml注射用水中,置于500ml瓶中,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,常温贮存。
2.1.4.14样品处理液(非还原型10ml
用扭力天平准确称取Tris0.303g、SDS0.8g、溴酚蓝0.189g,溶于2ml注射用水中,加入甘油4ml,浓HCl0.189ml,加注射用水定容至10ml,二人复核,贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,4℃冰箱放置。
4℃贮存。
2.1.5样品准备:
将样品自冰箱内拿出,放置室温融化后,将样品与样品处理液按3:
1(V/V的比例混匀,沸水处理3~5分钟,待用。
2.2操作过程
2.2.1.1分离胶(13.5%制备
聚丙烯酰胺胶母液14.4ml,分离胶缓冲液8ml,1%SDS3.2ml,注射用水3.2ml,
1%过硫酸铵1.6ml,1%TEMED1.6ml,制成胶量32ml。
2.2.1.2浓缩胶(4.5%的制备
聚丙烯酰胺凝胶母液2.4ml,,浓缩胶缓冲液4ml,注射用水4.8ml,1%SDS1.6ml,
1%过硫酸铵1.6ml,1%TEMED1.6ml,pH6.8,成胶量16ml。
2.2.1.3灌胶
灌胶时先将电泳槽阳极侧用透析纸包上,在电泳槽内加满水,靠水压封住阳极侧缝隙,以免胶溶液漏出;在两玻璃板间加分离胶,加胶完毕后,用注射器沿玻璃板在液面上覆盖一层(约0.3cm高正丁醇;待胶凝固后,将电泳槽内注射用水及
胶表面的正丁醇倒掉,并用滤纸吸干;向电泳槽内加入电极缓冲液、在浓缩胶位置插上梳子,在分离胶上加浓缩胶,待胶凝固后抽去梳子。
2.2.2加样:
将处理后样品按每孔不少于5ug的蛋白量,加入样品槽内.2.2.3电泳:
打开电泳仪,摘下“备用”标志牌,挂“运行”标志牌,调定电流,起始电流15mA,待指示线跑至分离胶处,改电流为25mA,电泳时间约为2.5小时,待指示剂至底线处,停止电泳,关闭电泳仪,摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。
2.2.4染色
电泳完毕后取下胶片,置于5倍胶体积的固定液内12h(或室温振荡30分钟;洗液洗三次,每次10分钟,37℃摇床内振荡;取5ml重铬酸钾母液加入200ml注射用水中,将胶片置其中,避光,振荡10分钟;用注射用水洗数次至黄色本底变白;加入新配制的0.2%AgNO
3
溶液白炽灯下照射30分钟;水洗五次;显色液500ml中加甲醛0.35ml,待样品蛋白带及分子量蛋白带清晰后弃去显色液加入终止液。
2.2.5扫描
2.2.5.1打开扫描仪,摘下“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。
2.2.5.2对胶片进行扫描,同时记录下扫描结果。
2.2.5.3关闭扫描仪,摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。
2.2.6摘下场地“使用中”标志牌,挂“待处理”标志牌。
3结果判定
3.1判定标准:
染色后胶片经扫描仪扫描,样品蛋白带含量应在95%以上,二聚体量不超过5%。
3.2判定结果填写记录。
4清场
4.1需要低温贮存的液体放入冰箱,避光的液体放入阴暗处。
4.2称药之后将药品瓶盖盖紧,放回药品柜。
4.3关闭扭力天平,清洁干净后放回原处,挂“备用”标志牌。
4.4清洁工作台面,用专用抹布擦净,地面用专用拖布拖净。
4.5用过的玻璃器皿用纯化水冲洗干净后返回洗刷组。
4.6填写清场记录。
4.7清场后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后,摘下“待处理”标志牌,挂“清场合格”标志牌。
5注意事项5.1本实验所用SDS需高纯度SDS,如不纯需重结晶。
5.2样品必须经沸水处理3-5分钟,以免有亚稳聚合物存在。
附:
SDS-PAGE(快速电泳准备工作同前。
1制胶1.1分离胶制备:
(13.5%)聚丙烯酰胺凝胶母液7.2ml,分离胶缓冲液4ml,1%SDS3.2ml,注射用水1.6ml,1%过硫酸铵0.8ml,1%TEMED0.8ml,制成胶量16ml。
1.2浓缩胶的制备(4.5%聚丙烯酰胺凝胶母液1.2ml,浓缩胶缓冲液2ml,注射用水2.4ml,1%SDS0.8ml,1%过硫酸铵0.8ml,1%TEMED0.8ml,pH6.8,成胶量8ml。
1.3灌胶:
先将分离胶液加入制胶器内,上面加一薄层正丁醇,待胶凝固后,在浓缩胶位置上插梳子,在分离胶上加浓缩胶,待胶凝固后抽去梳子。
2预电泳:
打开电泳仪,摘掉“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。
恒定电压200V,时间30分钟。
3上样将处理后样品按每孔不少于5ug的蛋白量,加入样品槽。
4电泳恒定电流40mA,电泳时间1h。
指示