植物DNA的提取.docx
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植物DNA的提取
实验1植物总DNA制备
原理:
植物细胞中DNA位于细胞核和细胞质中,分离植物总DNA首先要破碎细胞壁,然后用SDS、CTAB、PEX等试剂裂解细胞膜系统,释放DNA到DNA提取介质中。
然后使DNA与蛋白质、多糖、多酚类物质分开,在乙醇或异丙醇作用下沉淀DNA。
目的:
制备用于基因操作的高质量的植物总DNA。
方法:
CTAB法
实验材料:
高粱叶片
试剂:
1.DNA提取缓冲液(DNAextractionbuffer)
①1×CTAB提取缓冲液 2×CTAB提取缓冲液
50mM/LTris.ClpH8.0100mM/LTris.ClpH8.0
0.7M/LNaCl1.4NaCl
10mM/LEDTA20mM/LEDTA
1%CTAB2%CTAB
0.1-2%β-巯基乙醇0.1-2%β-巯基乙醇
②SDS提取缓冲液
100mM/LTris.ClpH8.0
100mM/LNaCl
50mM/LEDTA
2%SDS
2.1×TE:
10mMTris.ClpH8.0;1mMEDTApH8.0
3.3MNaAcpH5.2;预冷的异丙醇
仪器:
水浴锅、离心机、
操作步骤:
操作步骤
①植物叶片2-3g在液氮中研磨,装入2ml离心管中。
②加800ul提取缓冲液,充分混匀。
③65℃水浴60min。
④加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1),充分混匀。
⑤6000rpm离心20min。
⑥取上清,加等体积的氯仿/异戊醇(24:
1),充分混匀。
⑦6000rpm离心20min。
⑧取上清,加1/10体积的3M/LNaAc(pH5.2),0.8×体积预冷的异丙醇,混匀,置-20℃一小时。
⑨勾出或10000rpm离心,沉淀DNA。
⑩70%酒精洗沉淀2次。
⑾风干DNA样品,加适量TE溶解DNA,置-20℃备用。
作业:
1.分离与提取植物总DNA的原理是什么?
2.用CTAB方法制备植物DNA的操作过程中应注意那些事项?
实验3DNA分子的琼脂糖凝胶电泳检测
原理:
琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过糖苷键交替构成的线状聚合物,形成直径为50nm到200nm的三维筛孔通道。
在电场作用下,DNA分子在琼脂糖中迁移。
通过EB染色可以检测DNA的分子大小及质量,可定量、定性地对通过DNA分子进行分析。
试剂:
1.10XTBE(电泳缓冲液)(108gTris,55g硼酸,40ml0.5mol/LEDTA)
2.6X加样缓冲液(0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶液)
3.琼脂糖
4.溴化已锭(EB)
DNA材料:
CTAB或其他方法制备的植物总DNA
仪器:
电泳槽、电泳仪
目的:
检测经提取的DNA质量。
方法步骤:
1用胶带封住塑料托盘的两边。
2配置足量的0.5XTBE,倒入电泳槽中。
3称取0.8g琼脂糖放入三角烧瓶中,加入100ml0.5XTBE,加热融化,加热时防止溶液溢出。
4待温度降至55℃时,加入EB,使终浓度为0.5ug/ml(略)。
5插好梳子。
6将胶倒入托盘,倒入时防止产生气泡。
7待凝胶完全凝结后,拔出梳子,放入电泳槽。
8DNA样品与6X上样缓冲液混合。
9上样。
10接好电源,调整电压为100V,电泳1小时。
11关掉电源,取出凝胶,在凝胶成像系统下观察,或用手提紫外灯下观察。
作业:
1.琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的原理是什么?
2.写出琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的实验流程。
实验2目的DNA分子的PCR扩增
1实验原理
1.1聚合酶链式反应(PCR)的基本构成
PCR基本原理是以单链DNA为模板,4种dNTP为底物,在模板3’末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中,加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg2+等。
(1)模板DNA的变性
模板DNA加热到90~95℃时,双螺旋结构的氢键断裂,双链解开成为单链,称为DNA的变性。
(2)模板DNA与引物的退火
将反应混合物温度降低至37~65℃时,寡核苷酸引物与单链模板杂交,形成DNA模板-引物复合物。
退火时间一般为1~2min。
(3)引物的延伸
DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA链互补的新链。
延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。
1.2PCR反应的五个元素
参与PCR反应的物质主要为五种:
引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
引物:
引物设计应遵循以下原则:
(1)引物长度。
长度要求在15~30bp,常用为20bp左右,引物过短时会造成Tm值过低,在酶反应温度时不能与模板很好的配对;引物过长时又会造成Tm值过高,超过酶反应的最适温度,且合成长引物还会使费用大大增加。
(2)引物碱基构成。
引物的G+C含量以40~60%为宜,因为G+C含量过高或过低都会直接造成Tm值的过高或过低,都不利PCR反应的进行。
ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
(3)引物二级结构。
应尽量避免引物内部出现二级结构,并且两条引物间不能形成互补结构,特别是3’端的互补,否则形成引物二聚体,PCR扩增中产生非特异的条带。
引物自身也应无回文对称结构(限制性酶切位点除外),防止形成茎环结构。
(4)引物3’端序列。
3’端碱基要求与模板严格配对,连续配对的碱基数超过15bp,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
(5)引物中酶切位点的引入。
引物中一般会引入一至两个酶切位点,便于后期的克隆实验,特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中,PCR克隆基因时已将后续方案设计完毕。
(6)引物的特异性。
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。
(7)引物量。
反应体系中引物的常用浓度为0.1~1pmol/μl,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体,过低则扩增效率会降低。
酶及其浓度
TaqDNA多聚酶是耐热DNA聚合酶,是从水生栖热菌(Thermusaquaticus)中分离的。
具有5’-->3的聚合酶活力,5’-->3’的外切核酸酶活力,无3’-->5’的外切核酸酶活力,会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸(通常为A,故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体),在体外实验中,TaqDNA聚合酶的出错率为10-4~10-5。
此酶具有以下特点:
(1)耐高温,在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上,在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%,而在95℃下反应2小时后为原来的40%。
(2)在热变性时不会被钝化,故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。
(3)一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb,且特异性也较高。
一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u(总反应体积为50μl时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度
在PCR反应中,dNTP应为50~200μmol/l,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
模板DNA
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂(酚与氯仿)抽提除去蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸,该核酸即可作为模板用于PCR反应。
模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~10ng/μl,实验中模板浓度常常需要优化,一般可选择几个浓度梯度(浓度差以10倍为一个梯度)。
在PCR反应中,过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。
Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/l为宜。
Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
1.3PCR反应条件
温度与时间的设置:
标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸。
1.4PCR反应特点
(1)强特异性
PCR反应的特异性决定因素为:
A.引物与模板DNA特异性的结合;
B.碱基配对原则;
C.TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性;
D.靶基因的特异性与保守性。
(2)高灵敏度
PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10-6g)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。
(3)快速简便
PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在PCR仪上进行变性-退火-延伸反应,反应一般在2~4小时完成。
扩增产物常用电泳分析,操作简单易推广,如采用特殊PCR仪(荧光时时定量PCR仪)则可全程监测PCR反应的结果,故耗时将更短。
(4)低纯度模板
DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
1.5PCR结果异常分析
(1)非特异性扩增产物的出现
A.背景DNA与引物同源性高。
可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对对扩增产物DNA再次进行PCR扩增。
B.退火温度太低。
引物和模板的配对是一个动态过程,分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。
退火温度太低,造成引物与模板的非特异性位点部分配对而解离不下来,这种不正确的配对,进入PCR反应过程就可扩增出非特异性的产物DNA。
提高退火的温度将可改善结果。
C.过量的酶、引物和模板DNA可使PCR反应造成混乱,强行扩增出非特异性产物DNA,适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。
(2)无特异性扩增产物带
A.引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类,造成引物降解。
B.模板DNA制备时模板已降解。
C.Taq酶有失活或有杂酶污染。
D.缓冲液条件不当。
E.引物不正确。
2实验目的:
通过该实验了解PCR反应原理,掌握PCR操作的基本步骤以及对PCR反应结果的分析。
3试剂与器材
1).试剂
(1)模板DNA
(2)TaqDNA聚合酶
(3)10×缓冲液
(4)dNTP(2.5mM)
(5)Primer1(10pmol/μl)
(6)Primer2(10pmol/μl)
2).器材
(1)eppendorf管PCR专用薄壁管(200μl)
(2)枪头
(3)移液器
(4)离心机PCR反应液混合后离心
(5)PCR仪
(6)超净工作台提供洁净操作区用于PCR加样
4实验步骤
(1)按如下体积加样进行PCR反应:
1#2#
总体积50μl50μl
ddH2O28.5μl26.5μl
10×buffer(含Mg2+)5μl5μl
dNTP(2.5mM)4μl4μl
Primer1(10pmol/μl)5μl5μl
Primer2(10pmol/μl)5μl5μl
染色体DNA2μl4μl
Taq酶(5U/μl)0.5μl0.5μl
(2)充分混匀后按下列条件进行反应:
95℃5min
95℃30s
57℃1min30个循环
72℃1min
72℃5min
4℃10hs
(3)取40μl采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况。
5作业
1)简述PCR反应的基本原理。
2)分析PCR反应体系中各成分对扩增结果的影响。