第九节疏水作用色谱.docx

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第九节疏水作用色谱

第九节疏水作用色谱

疏水作用色谱（HydrophobicinteractionchromatographyHIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。

关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。

此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（HighperformancehydrophobicinteractionchromatographyHP-HIC）。

由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。

目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。

一、疏水作用色谱基本原理

（一）疏水作用

疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。

根据热力学定律，当某个过程的自由能变化（8）为负值时，该过程在热力学

上是有利的，能够自发发生，反之则不能。

而根据热力学公式

△3=△H一T^S（6.9-1）

式中，AG是由该过程的烩变（AH），熵变（笃）和热力学温度（T）决定的。

当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小（笃＜0），致使M为正值，在热力学上不利。

在疏水作用发生时，疏水性溶质分子相互靠近，疏水表面积减少，相当一部分水分子从有序结构回到溶液相中导致熵值增加（笃＞0），引入了负的△G，从而在热力学上有利。

因此非极性分子间的疏水作用不同于其他的化学键，而是由自由能驱动的疏水分子相互聚集以减少其在水相中表面积的特殊作用。

（二）生物分子的疏水性

对于小分子物质，根据其极性的人小可以分为亲水性分子和疏水性分子，一般来说亲水性的小分子是很难与HIC介质发生作用的。

但对于疏水作用色谱的主要对象生物大分子如蛋白质而言，其亲水性或疏水性是相对的，即使是亲水性分子也会有局部疏水的区域，从而可能与HIC介质发生疏水作用，因此能够根据其疏水性的相对强弱不同进行分离。

以蛋白质为例，球状蛋白质在形成高级结构时，总体趋势是将疏水性氨基酸残基包裹在蛋白质分子部而将亲水性氨基酸残基分布在分子表面。

但实际上真正能完全包裹在分子部的氨基酸侧链仅仅占总氨基酸侧链数的20%左右，其余均部分或完全暴露在分子表面。

蛋白质表面的疏水性是由暴露在表面的疏水性氨基酸的数量和种类，以及部分肽链骨架的疏水性所决定的。

因而可以认为蛋白质分子表面含有很多分散在亲水区域的疏水区（疏水补丁），它们在HIC过程中起着重要的作用。

然而研究表明不同的球状蛋白质的疏水表面占分子表面的比例差异并不大，但即使是疏水表面比例非常接近的蛋白质，其在HIC中的色谱行为却可能有很大的差别。

造成这一现象的原因是蛋白质分子表面的不规则性，即使是球状蛋白质，其分子表面也远非平滑球面，而是粗糙而复杂的，由于空间位阻的关系，有些疏水补丁是无法与HIC介质发生作用的，因此蛋白质在HIC中的色谱行为不仅取决于分子表面疏水区的大小和疏水性的强弱，还取决于其疏水区在分子表面的分布。

（二）生物分子与疏水作用色谱介质间的作用

HIC介质是在特定的基质如琼脂糖上连接疏水配基如烷基或芳香基团组成

的。

HIC介质与具有疏水性的生物分子间的作用被认为与疏水性分子在水溶液体系中的自发聚集一样，是由熵增和白由能的变化所驱动的。

盐类在疏水作用中起着非常重要的作用，高浓度盐的存在能与水分子发生强烈作用，导致可以在疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进了疏水性分子与色谱介质的疏水配基之间发生结合。

因此在HIC过程中，在样品吸附阶段采用高盐浓度的溶液，使得目标分子结合在色谱柱中，而在洗脱阶段，采用降低洗脱剂中盐浓度的方式使溶质与色谱介质间的疏水作用减弱，从而从色谱柱中解吸而被洗脱下来。

对于以芳香基团作为疏水配基的色谱介质来说，还存在潜在的发生n-n作用的可能当待分离物质表面具有芳香基时，就会表现出疏水作用和n-n作用的混合分离模式。

较大的生物分子与色谱介质发生结合时的情况是比较复杂的，一般来说每个分子被吸附的过程都会有一个以上的配基参与，换句话说，分子在色谱介质上发生的结合是多点结合。

经研究发现吸附过程是多步反应过程，其中的限速步骤并非酶与色谱介质接触的过程，而是酶在色谱介质表面发生缓慢的构象改变和重新定向的步骤。

（四）疏水作用色谱与反相色谱的区别

从理论上看，HIC和RPC是两种密切相关的液相色谱技术，它们都是基于生物分子表面的疏水区域与色谱介质上的疏水配基（烷基或芳香基）之间的疏水

相互作用，然而在分子水平的色谱机理以及实践层面上这两种技术是有所不同的。

RPC介质上疏水配基的取代程度大大高于HIC介质。

RPC介质可以认为是连续的疏水相，其配基如C4~C18烷基的取代程度通常在数百微摩/rnL凝胶；而HIC介质上配基如C2~C8烷基或简单芳香基的取代程度通常在10~50mmol/mL凝胶围，可以看作是不连续（低密度分布）的疏水相，在与生物分子结合时由一个或数个配基参与。

那么很显然，疏水溶质与RPC介质间的作用力要比HIC介质强得多，需要使用有机溶剂梯度等剧烈的洗脱条件才能将溶质从色谱柱中洗脱下来，对于球状蛋白质，在这样剧烈的洗脱条件下往往会发生变性，因此RPC更适合在水-有机溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分子蛋白质的分离纯化。

而HIC过程的洗脱条件要温和得多，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目的，因此HIC既利用了蛋白质的疏水性质，又能够在更为极性和低变性的环境中进行，因而在蛋白质的纯化中有着更为广泛的应用。

尽管这两种技术都是利用生物分子的疏水性质进行分离，但由于在吸附的分子机理上存在差异，它们对于同一组样品的选择性往往是不同的。

例如，有人研究用疏水色谱柱TSKGelPhenyl-5-PW和反相色谱柱SynChropak对12种常见蛋白质进行色谱，对选择性作了比较，如表6.9-1所示，各种蛋白质被洗脱的顺序全然不同。

表6.9-112种蛋白质在疏水色谱柱和反相色谱柱中的选择性比较

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①疏水作用色谱：

色谱柱尺寸55mmX200mm，流动相A为含I.Omol/LNaSO4的1mmol/L

磷酸钾缓冲液（PH7.0），流动相B为10mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），梯度为

20min0~100%B，流速为1mL/min。

②反相色谱：

色谱柱尺寸4.6mmX50mm，流动相A为0.1%TFA水溶液（pH2.0），流动相B为含0.1%TFA的60%异丙醉溶液，梯度为20min0~100%B，流速为1mL/min。

（五）影响疏水作用色谱过程的参数

影响疏水作用色谱过程的因素来自于固定相类型、流动相组成和色谱条件。

1.固定相

固定相条件，包括采用基质的类型、配基的种类和取代程度都会影响对样品的分离效果，这也是色谱时合理选择色谱介质的依据。

疏水配基的种类直接决定着目标分子在色谱时的选择性，是选择疏水作用色

谱介质时首先要考虑的问题。

常见的配基包括烷基和芳香基两大类，其中烷基配

基与溶质间显示出单纯的疏水作用，而芳香族配基往往由于和溶质间存在n-n作用而呈现出混合模式的分离行为。

对于烷基配基，烷基的链长决定着色谱介质疏水性的强弱，同时还影响着色谱介质的结合容量。

在其他条件相同的情况下，HIC介质对蛋白质的结合容量随着烷基链长的增加而增加。

在配基种类确定的情况下，取代程度的高低决定着HIC介质的结合容量和疏水作用强度。

在色谱介质上配基取代程度较低时，随着取代程度的增加。

色谱介质对蛋白质的结合容量会增加，这是由于配基数量的增加使得蛋白质在色谱介质表面的结合位点增多，从而单位体积的色谱介质能够吸附更多的溶质分子。

但是当取代程度达到一定数值后，结合容量就会趋于稳定，此时进一步提高取代程度并不能再增加结合容量。

这是由于空间位阻决定了单位色谱介质表面只能结合特定数量的蛋白质，因此当这些表面饱和后结合容量就不再随取代程度而变化了。

但是需注意的是取代程度的进一步上升将会使得与每个蛋白质发生作用的配基数量增加，从而使蛋白质更为牢固地结合于色谱介质上而难以洗脱。

基质同样会对色谱结果产生影响，具有相同配基种类和取代程度但不同基质的吸附剂会具有不同的选择性。

通常HIC介质所采用的是高度亲水性的基质。

2.流动相

流动相条件对HIC的影响主要表现在所用盐的种类和浓度、流动相的pH，以及其他添加剂的影响。

HIC过程是在高盐浓度下实现样品的吸附，而后在低盐浓度下完成洗脱过程。

显然，流动相中盐的种类和浓度是HIC中至关重要的参数。

不同的离子，特别是阴离子在HIC中的作用是不同的。

有些离子存在于溶液中时会促进蛋白质发生沉淀，它们能够增加疏水作用；而另一些离子的存在却会促进蛋白质的溶解，称为促溶盐类，它们的存在会破坏疏水作用。

Hofmeister系列指出了不同离子对疏水作用的影响（表6.9-2），表中左边的离子能够促进疏水作用，因而经常在HIC中使用，而右边的离子属于促溶离子，它们能破坏疏水作用，有时在对色谱介质进行清洗时可以用来洗脱一些结合特别牢固的杂

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在所用盐的种类已经确定的情况下，盐浓度的高低会影响到溶质分子与色谱介质的结合强度及色谱介质的结合容量。

盐浓度的升高能促进疏水作用，因此HIC通常都是在高盐浓度下加样并完成吸附，而通过降低洗脱剂中盐浓度的方法进行洗脱。

除此之外，色谱过程的起始盐浓度的高低还会影响色谱介质对蛋白质的结合容量。

流动相的pH对色谱行为的影响比较复杂。

多数情况下pH升高会使得疏水作用减弱，而降低pH则增强此作用力，但是对于一些等电点较高的蛋白质，在高的pH下却能够牢固地结合在HIC介质上。

流动相中的其他添加剂主要指能够减弱疏水作用的醇类、去污剂、促溶盐类

等，它们的存在能有效地将溶质分子从HIC介质上洗脱下来，同时它们还会影响分离