高产γ氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育.docx

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高产γ氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育

高产γ-氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育

叶

（工程大学生物化学工程学院，241000）

摘要

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，简称GABA）是广泛分布于自然界的一种非蛋白质氨基酸，具有镇痛、促进生长激素分泌及预防老年痴呆等生理功能。

为提高GABA产量，本实验应用常温室压等离子体（AtmosphericandRoomTemperaturePlasma，简称ARTP）对实验室已有菌株HX-3-6进行诱变，挑选致死率达到90%以上的菌株进行发酵验证，并通过梯度平板按GABA浓度的高低以及菌落的大小进行初筛，再利用发酵培养基进行复筛并进行遗传稳定性试验。

获得的稳定突变株L-120-1且产量达到5.828g/L，较诱变前产量（4.904）提高18.84%。

以突变株L-120-1为出发菌株进行ARTP诱变，得的稳定突变株90s-高2产量达到6.178g/L，较诱变前产量（5.319g/L）提高16.15%。

最终得到稳定高产GABA的乳酸菌突变菌株90s-高2产GABA比诱变前的HX-3-6菌株产量提高25.98%。

关键词：

乳酸菌；GABA；ARTP；发酵；遗传稳定

Lacticacidyieldγ-aminobutyricacidplasmaBreeding

YeYang

（BiochemicalEngineering,CollegeofEngineering,AnhuiUniversity,Wuhu241000）

ABSTRACT

γ-aminobutyricacid（γ-aminobutyricacid,abbreviatedGABA）isanon-proteinaminoacidsarewidelydistributedinnature,ithasanalgesicandtopromotegrowthhormonesecretionandpreventionofAlzheimer'sandotherphysiologicalfunction.

ToimprovetheproductionofGABA,theAtmosphericandRoomTemperaturePlasma（ARTP）wasusedtomutagenesisHX-3-6（thestrainkeepintheexperiment）,andthenmutationswasusedforfuturefermentationwhosefatalityratewereabove90%,thegradientplatewithGABAandthesizeofthecolonywereusedforthefirstscreening,andthenfermentationmediumwasusedforthenextscreeningtotestthegeneticstabilityofmutantstrainsoflacticacidbacteria.ObtainedstablemutantsL-120-1andtheyieldreached5.828g/L,thanthepre-mutagenicproduction（4.904g/L）improved18.84%,andthentheL-120-1wasmutagenesis,astablemutants90s-high2wasgotandproductionreached6.178g/L,comparedwithbeforemutagenesisproductionincreasein6%.Finallythehighproductionmutant90s-2comparedtothestrainofHX-3-6improved25.98%.

Keyword:

Lactobacillus;GABA;Ferment;Geneticstability

插图清单

图2-1GABA的酶标仪标准曲线…………………………………………………12

图3-1HX-3-6的生长曲线……………………………………………………13

图3-2HX-3-6的诱变致死率曲线图…………………………………………14

图3-3HX-3-6诱变后GABA的产量……………………………………………15

图3-4L-120-1的生长曲线和Ph值曲线………………………………………16

图3-5L-120-1的诱变致死率曲线……………………………………………17

图3-6L-120-1诱变后菌株的GABA产量和OD值的曲线…………………18

表格清单

表1-1实验药品（试剂）……………………………………………………6

表1-2试验仪器……………………………………………………………7

表4-1乳酸菌HX-3-6所测OD600值………………………………………22

表4-2乳酸菌HX-3-6诱变致死率……………………………………………22

表4-3乳酸菌HX-3-6诱变后GABA的产量……………………………………22

表4-4乳酸菌L-120-1所测的OD600和pH值……………………………………23

表4-5乳酸菌L-120-1诱变致死率…………………………………………23

表4-6乳酸菌L-120-1诱变后GABA产量……………………………………23

引言

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是一种广泛分布于动植物体的非蛋白氨基酸，具有许多重要的生理功能。

在植物中，γ-氨基丁酸（GABA）参与了植物抵御逆境胁迫反应，对病虫害的保卫反应等过程。

在动物中，GABA作为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，参与脑循环生理活动，具有降低血压、治疗癫病、镇静安神、促进睡眠、增强记忆力、控制哮喘、调节激素分泌、促进生殖、肾肝功能活化等功能，被广泛的应用于食品、医药等工业。

因此对其作用机理、制备研究己经成为一个热点。

目前主要通过大肠杆菌发酵生产GABA，但大肠杆菌存在着安全卫生方面的极大隐患。

因此通过诱变的方法获得高产GABA的安全性新型菌种具有重要的意义[1~3]。

在食品和医药工业中，利用公认的安全性益生菌——乳酸菌进行发酵生产GABA具有更广泛的前景，目前工业生产的GABA产量较低[4，5]，故为提高GABA产量本实验采用等离子诱变乳酸菌育种选育

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型[6]。

但是紫外诱变育具有育种过程繁重，诱变效果差等问题。

化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行的，它通过化学试剂造成生物的损伤和错误修复，产生突变体[7]。

但是化学诱变育种过程复杂以及具有对人体危害比较大的操作环境。

本实验采用一种新型微生物诱变育种方法--常压室温等离子体（ARTP）诱变育种系统。

ARTP是近几年来发展起来的一种等离子体源，能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子浓度的等离子体射流，等离子体具有气温低、电子温度高的非平衡特性以及活性离子浓度高的特点。

据科学研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代网络显著变化，最终导致微生物产生突变[8]。

ARTP诱变育种系统具有操作安全、过程简单、突变率高、经济环保等优点；所以本实验利用ARTP对产GABA的乳酸菌进行诱变育种将诱变后的突变菌株用含有代产物GABA的培养基进行抗性初筛，再利用发酵培养基进行复筛进行遗传稳定性试验，最终得到稳定高产GABA的乳酸菌突变菌株。

第一章绪论

1.1γ-氨基丁酸的研究现状

GABA在食品中的研究和应用始于上世纪八十年代中期，应用产品以日本茶饮料Gabaron为代表。

用Gabaron茶饮料饲喂患原发性高血压的小白鼠，数周发现其血压由175-180mmHg降低至150mmHg，同时并未发现小白鼠的其它任何生理异常现象[9]。

1994年，Takayo等在研究用水浸泡的米胚芽的氨基酸分布时，发现经过发酵处理的米胚芽中GABA的积累量很高，达到200-300mg/100g[10]。

1996年，富含GABA的米胚芽制品在日本实现了商业化。

神经生理及神经医学的研究表明GABA是一种重要的活性物质，在人脑中，虽然GABA可由脑部的谷氨酸在专一性较强的谷氨酸脱羧酶作用下转化而成，但是年龄的增长和精神压力的加大使GABA的积累异常困难，而通过日常饮食补充可有效改善这种状况，从而促进人体健康[11]。

最近，日本科学家利用米胚芽等原料开发制造的富含GABA的功能食品配料，已经广泛地应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品中。

现在还有报道，应用生物技术制造的高浓度GABA饮料以及利用乳酸菌等制作的富含GABA的食品配料，均可直接作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。

我国有关GABA食品的研究开发报道极少，这方面的研究开发尚属于起步阶段。

1.2常压室温等离子诱变系统

1.2.1ARTP生物育种基本原理

常压低温等离子体是近几年才开始研究的一种新型等离子体源，具有气体温度低、活性粒子浓度高、能量高、操作简便等优点。

基础实验研究表明，常压低温等离子体中的高浓度活性粒子能够作用于微生物的遗传物质，使其在短时间产生致畸突变，是一种效果良好的诱变源[12]。

相比传统的物理诱变方法（如离子束注入、放射线诱变）和化学诱变方法，常压低温等离子体诱变方法具有操作安全、简便、对人体无任何副作用、对环境无污染等特点。

1.2.2ARTP的发展优势

常规的诱变育种方法有化学诱变育种和物理诱变育种。

微生物的诱变育种，主要是以人工诱变的手段来诱发微生物基因突变，从而改变遗传结构和功能，再通过筛选，从很多的变异菌体中筛选出所需的产量高、性状优良的突变株，并且找出最佳培养基及最佳培养条件，使其能在最适环境条件下合成所需产物。

清华大学等离子体健康科技研究组（工程物理系）、环境生物技术实验室（化学工程系）联合思清源生物科技，采用国际先进的常压低温等离子体产生技术，结合近几年的最新研究成果与自动控制方法，联合研制出第二代ARTP生物育种机。

该育种机具有工作稳定、无需预热、操作简便、人机交互性能好等优点，能够在工业环境下产生常压低温等离子体使菌种产生诱变，加快诱变育种进程，提高工业生产效率[13]。

ARTP诱变的研究能够促进等离子体与生物科学的融合和交叉，一方面推动具有多参数、高通量、可控性更强的多通道的常压低温等离子体技术装备的发展与创新，另一方面，通过对不同生物分子及物种的调控与作用方法研究，形成了等离子体生物技术（Plasmabiotechnology）的新研究领域--生命科学。

1.3立题依据与意义

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢的一种抑制性递质，GABA具有降血压、增强记忆力、活化肾功能、改善肝功能、防治肥胖、营养神经细胞等作用等诸多功能[14]，研究通过微生物发酵法获得GABA具有重要意义。

随着GABA的生理功能特性逐渐被人类认识，利用GABA的富集技术开发富含GABA的保健食品必将是一个很有潜力的研究领域，化学合成GABA安全性较差，植物富集GABA含量不高，利用生物合成法中的微生物（乳酸菌）发酵生产GABA显示了广阔的开发前景[15]。

但是乳酸菌发酵产GABA的工业产量不高。

鉴于紫外诱变育种具有育种过程繁重，诱变效果差等问题；化学诱变育种过程复杂以及具有对人体危害比较大的操作环境。

本实验利用新型诱变技术（常压室温等离子体诱变育种系统）对乳酸菌进行诱变育种，从而得到高产GABA的乳酸菌菌种。

1.4本课题主要研究的容

（1）本实验对实验室已筛选出的产γ-氨基丁酸的乳酸菌进行常温室压等离子体诱变，并使用梯度平板对诱变株进行初步筛选。

（2）对大量突变株进行发酵培养复筛，以期获得生长速率快，高产γ-氨基丁酸的乳酸菌。

第2章实验材料

2.1菌种来源

由工程大学生物技术实验室保藏，编号为HX-3-6。

2.2实验药品

表1-1-实验药品（试剂）

药品名称

药品类型

生产厂家

琼脂

生化试剂

国药集团化学试剂

葡萄糖

分析纯

国药集团化学试剂

酵母提取物

生化试剂

国药集团化学试剂

胰蛋白胨

生化试剂

国药集团化学试剂

鱼粉蛋白胨

生化试剂

国药集团化学试剂

吐温

分析纯

国药集团化学试剂

NaCl

分析纯

国药集团化学试剂

MgSO4

生化试剂

试剂四厂

硫酸锰

生化试剂

化学试剂厂

95%乙醇

分析纯

国药集团化学试剂总厂

乙酸钠

分析纯

化学试剂厂

磷酸氢二钠

分析纯

化学试剂厂

丁二酸钠

分析纯

生工生物

柠檬酸三胺

分析纯

国药集团化学试剂总厂

谷氨酸钠

分析纯

吉瑞化学试剂

氢氧化钠

分析纯

国药集团化学试剂总厂

GaCO3

化学试剂

化学试剂厂

苯酚

分析纯

国药集团化学试剂总厂

2.3实验仪器

表1-2-试验仪器

实验仪器

生产厂家

SPX—250BS—Ⅱ生化培养箱

新苗医疗器械制造

ARTP诱变育种系统-

思清源物科技

全自动酶标仪MultiskanFc

塞默非世尔仪器

美菱BCD-181KC冰箱

美菱电器

全自动高压灭菌锅HVE-50

华夏行仪器

SW-CJ-CO型净化工作台

净化设备

DHG—9143BS—Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱

新苗医疗器械制造

LDZX—50KBS立式电热压力蒸汽灭菌锅

金坛市荣华仪器制造

恒温水浴锅HH-2

金坛市杰瑞尔电器

SK—1快速混匀器

金坛市杰瑞尔电器

FC104电子天平

精密科学仪器

PHSJ—3F型实验室pH计

电器

100µl精密微量移液器

GilsonSAS.France

1000µl精密微量移液器

GilsonSAS.France

5000ul精密微量移液器

GilsonSAS.France

80-2离心机

金檀市荣华仪器制造

15W紫外灯

净化设备

实验室pH计PHSJ-3F

精密科学仪器

电炉

丹阳市飞和五金电器厂

可见分光光度计722

佑科仪器仪表

磁力搅拌器SK-1

金坛市杰瑞尔电器

美的电冰箱BCD—195TC

荣氏达冰箱

高通量恒温振荡器CanvicHTS-T008

世平实验设备

不锈钢蒸馏水器

生银医疗仪器仪表

本试验还需用品：

Eppendorf离心管、烧杯、玻璃棒、镊子、试剂瓶、量筒、洗瓶、石棉网、锥形瓶、培养皿、剪刀、白铁锅、酒精灯、试管架、冰袋、试剂勺、涂布棒、甘油管等。

2.4培养基及相关试剂的配制

（1）MRS液体培养基：

鱼粉蛋白胨10g酵母提取物10g葡萄糖5g乙酸钠5g磷酸氢二钾0.2g柠檬酸三胺0.2g硫酸镁0.2g硫酸锰0.05g吐温-800.1mol/L水1000mLpH6.5115℃灭菌25分钟

（2）MRS固体培养基：

鱼粉蛋白胨10g酵母提取物10g葡萄糖5g乙酸钠5g磷酸氢二钾0.2g柠檬酸三胺0.2g硫酸镁0.2g硫酸锰0.05g琼脂20～25g水1000mLpH6.5115℃灭菌25分钟

（3）含GABA的MRS固体培养基：

鱼粉蛋白胨10g酵母提取物10g葡萄糖5g乙酸钠5g磷酸氢二钾0.2g柠檬酸三胺0.2g硫酸镁0.2g硫酸锰0.05g琼脂20～25gGABA60g水1000mLpH6.5115℃灭菌25分钟

（4）发酵培养基：

酵母提取物5g胰蛋白胨5g葡萄糖10g丁二酸钠5g1%的谷氨酸钠水1000mLpH6.5115℃灭菌25分钟

（5）生理盐水溶液：

1.8gNaCl溶于200mL蒸馏水。

115℃灭菌25min。

（6）硼酸缓冲液1.525g硼砂和0.247g硼酸溶解后定容至100mL。

（3）谷氨酸钠溶液：

0.1g的谷氨酸钠加入100mL的无菌水中，配制用于对照的谷氨酸钠溶液。

第3章实验方法

3.1对乳酸菌HX-3-6进行ARTP诱变育种

3.1.1乳酸菌HX-3-6生长曲线的测定

（1）菌种的活化：

将标准储备菌株取出，并恢复至室温后，按10%（v/v）接种量接种1mL乳酸菌于装有9mL的MRS液体种子培养基的50mL三角瓶中，静置于30℃培养箱中培养24h待用。

（2）乳酸菌生长曲线绘制：

取出上述活化后的菌悬液，按10%（v/v）接种量接种接种1mL菌悬液到装有9mLMRS液体培养基的50mL三角瓶，置于30℃培养箱中培养，每隔3h用分光光度计在600nm条件下测得菌液OD值，并以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制乳酸菌的生长曲线。

同时用pH计对乳酸菌菌悬液的pH值进行测定。

3.1.2ARTP诱变

（1）菌悬液的制备：

将标准储备菌株取出，并恢复至室温后，按10%（v/v）接种量接种1mL乳酸菌于装有9mlL的MRS液体种子培养基的50mL三角瓶中，静置于30℃培养箱中培养待用，取1mL待用菌液于1.5ml的离心管中，5000r/min离心5分钟，离心后去除上清液加入1mL的无菌水使用振荡器震动摇匀，制成菌悬液备用。

（2）ARTP诱变操作：

在无菌操作台上使用20μL移液枪吸取上述制备好的菌悬液10μL到灭菌的小铁片上（共做8组），8组菌液用ARTP进行诱变处理的时间分别为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s。

常压室温（ARTP）等离子诱变育种装置，在本实验中使用条件如下所述；供电电源：

220V，50Hz，电压波动围≤5%，气体流量选用10SLM，温度20～40℃以下，功率200W。

用镊子将待处理样品载片放置到旋转定位台上方菌片固定圆形凹槽，之后调节旋转定位台高度，使待处理样品距离等离子体发生器出口为3mm，样品放置完毕后，关闭操作室门，选择照射时间。

3.1.3后培养及平板计数

（1）后培养：

将诱变后的载有菌液的小铁片迅速放入装有1.5mLMRS液体培养基的离心管中，然后将诱变的乳酸菌放入恒温培养箱中30℃培养2h。

（2）平板计数：

2h后取出诱变菌液使用振荡器将离心管中的菌液混匀，用1000μL移液枪吸取0.5mL置于装有4.5mL生理盐水的7mL离心管中，依次稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，取稀释倍数10-4、10-5的两个梯度菌悬液（0s取稀释倍数为10-5、10-6的两个梯度菌悬液涂布平板），用200μL移液枪吸取100μL加入MRS平板，涂布均匀，每个稀释度做三个平行。

将涂布后的平板倒置放入恒温培养箱中，30℃培养72h。

（3）ARTP致死率的计算：

培养72h后对平板上的菌落进行计数，并与相对应浓度的对照组菌落数目进行对照，按照公式：

致死率=（对照组-诱变菌落数）/对照菌落数，计算致死率。

3.1.4突变株的筛选

（1）梯度平板的制备：

在无菌操作台，先将平板倾斜15度左右放置，倒入约10mLMRS琼脂培养基，待凝固后放回水平位置，再倒入等体积的含有GABA浓度为60g/L的MRS培养基，凝固后形成梯度平板备用。

（2）突变菌株的初筛：

将诱变后菌株分别稀释10-4、10-5涂布梯度平板，将涂布后的梯度平板倒置放入恒温培养箱中，30℃培养72h（0s不需要涂布梯度平板）。

培养72h后按GABA浓度以及菌落的大小挑选单菌落；验证菌落大小和抗GABA浓度高低与菌株产GABA的相关性。

（3）突变菌株的复筛：

对突变菌株利用发酵培养基进行复筛，发酵条件为装液量50mL的250mL的三角瓶。

在恒温培养30℃静置培养72h；72h后在640nm条件利用酶标仪测突变菌株发酵产GABA的产量。

3.1.5GABA含量的测定

取1ml发酵液于1.5mL离心管中10000r/min离心2min，吸取0.5mL上清液用无菌水稀释10倍备用。

取0.8mL备用液于平底试管中。

再依次分别加入1mol/L的碳酸钠溶液0.2mL，0.2ml/LPh10.0的硼酸盐缓冲液0.75mL，6%的重蒸苯酚2.5mL，混匀后加入次氯酸钠（NaClO）溶液2mL，混匀后放置4～8分钟，然后沸水浴10min，立即冰浴20min，待溶液出现蓝绿色后，加入4mL60%的乙醇溶液，混匀后室温3放置20min，待上述溶液制作好后，从每组溶液中吸取200μL加入到酶标板上，用酶标仪在640nm条件下对每组溶液进行GABA的含量测定；用酶标仪测定GABA的标准。

图3-1GABA的酶标仪标准曲线

3.1.6菌种保藏

对反复筛选并经过多次传代得到的高产GABA的乳酸菌突变菌株用甘油管在-70℃进行冷冻保种。

3.2对乳酸菌L-120-1进行ARTP诱变育种

3.2.1菌种来源

L-120-1是原始菌株HX-3-6菌株经过ARTP诱变处理后，筛选得到的遗传性及产量稳定的突变菌株。

3.2.2实验操作基本流程

菌种的活化→乳酸菌生长曲线绘制→菌悬液的制备→ARTP诱变操作→后培养→平板计数→ARTP致死率的计算→突变菌株的筛选→GABA含量的测定→菌种保藏。

第4章结果与讨论

4.1乳酸菌HX-3-6ARTP诱变结果

4.1.1HX-3-6生长曲线的测定

图4-1HX-3-6的生长曲线

图表分析：

乳酸菌HX-3-6乳酸菌经过活化处理后，使用分光光度计在A600条件下制成HX-3-6乳酸菌生长曲线如图4-1所示，由图可以看出，菌体在接种培养后经过短暂的适应期进入对数生长期，约在18h左右进入对数后期，此期间菌体生长代旺盛且稳定是诱变的最佳时机。

同时可以看出菌株约在21h后进入稳定期。

4.1.2乳酸菌HX-3-6致死率测定

图4-2HX-3-6的诱变致死率曲线图

由图4-2可以看出：

HX-3-6乳酸菌经过ARTP诱变处理后，乳酸菌诱变致死率随着菌株诱变时间的增长而增大。

90s的致死率在77.81%，120s的致死率在91.2%；实验中挑取致死率达到90%的菌株进行筛选，以期获得高产菌株。

4.1.3HX-3-6诱变后GABA含量的测定

图4-3HX-3-6诱变后GABA的产量

由图4-3可以看出，经过第一次诱变之后发现，与对照组相比大部分经过诱变的菌株产GABA的产量有所提高；其中120-1GABA的产量为5.828g/L；GABA产量最高的突变菌株l-120-1较诱变前产量提高18.84%。

并经过多次传代产量稳定。

4.2乳酸菌L-120-1ARTP诱变结果

4.2.1L-120-1生长曲线的绘制

图4-4L-120-1的生长曲线和pH值曲线

乳酸菌L-120-1生长曲线如图4-4所示，由图可以看出，菌体在接种培养后经过短暂的适应期进入对数生长期，约在14h左右进入对数后期，此期间菌体生长代旺盛且稳定是诱变的最佳时机。

同时可以看出菌株约在18h后进入