病理学教研室教案.docx
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病理学教研室教案
病理学教研室教案
病理学教研室教案
（湛江校区）授课时间：
2006.3.22
课程名称
肿瘤学基础
年级
05
专业、层次
硕士研究生
授课教师
姜汉国
职称
副教授
课型（大、小）
小
学时
2
授课题目（章、节）
细胞凋亡与肿瘤
基本教材或主要参考书
《肿瘤分子细胞生物学》（主编：
陈意生史景泉；人民军医出版社）参考书籍：
《肿瘤学》（第二版，主编：
曾益新；人民卫生出版社）
教学目的与要求：
目的和要求：
掌握细胞凋亡的概念
掌握细胞凋亡与肿瘤形成的关系
掌握细胞凋亡的检测方法
内容与时间安排，教学方法：
内容：
CAI＋传统教学方法＋穿插讨论
随着近二十多年分子生物学技术的发展，经过研究发现细胞凋亡与肿瘤的发生发展关系密切，虽然肿瘤发病的机制仍然不完全清楚，但大家公认由于肿瘤凋亡减少是导致肿瘤形成的主要原因。
有关于细胞凋亡与肿瘤的发生发展的关系成为当代肿瘤基础理论研究中十分活跃的领域，也为肿瘤的治疗提供一个重要的靶点。
本节着重介绍细胞凋亡的概念、
细胞凋亡与肿瘤形成的关系和细胞凋亡的检测方法
教学重点、难点：
重点：
细胞凋亡的概念
细胞凋亡与肿瘤形成的关系
细胞凋亡的检测方法
难点：
细胞凋亡与肿瘤形成的关系
教研室审阅意见：
教研室主任签名：
年月日
基本内容
手段
教学设计和时间分配
概述
一、凋亡研究的历史
1965年，胚胎学家Williams等在研究动物发育过程中，提出PCD（programmedcelldeath）
①PCD是一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的、并受到严格程序控制的正常组成部分；而凋亡是一个形态学概念，描述一种有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。
②多种刺激诱导的细胞凋亡，有些是受程序控制的（PCD），而有些明显是非程序化的，如由细胞毒药物诱导的凋亡过程，并不是清楚地被程序化的过程；靶细胞被细胞毒T细胞诱导凋亡不需要明显地启动基因或合成物质，它们只是细胞对周围环境变化所发生的反应。
③PCD仅存在于发育细胞，而凋亡既可存在于发育细胞，也可存在于成体细胞，如肿瘤细胞等。
二、细胞凋亡的概念
细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。
三、细胞凋亡的生物学意义
在胚胎发育过程中：
①通过凋亡可清除对机体没有用的细胞，如雄性动物的苗勒管；
②清除多余的、发育不正常的细胞，如大脑中没有形成正确连接的神经元，哺乳动物脑的发育过程中20-50%脑神经细胞发生凋亡；
③清除对机体有害的细胞，如对自身抗原起反应的胸腺T细胞，来保证个体的正常发育。
在成年机体中：
①通过凋亡消除衰老的细胞并代之以新生的细胞，从而维持组织器官中细胞数量的稳定，如皮肤、粘膜细胞的更新，月经周期子宫内膜的脱落与增生等；泌乳细胞在婴儿断乳后很快凋亡，代之以脂肪细胞；
②通过凋亡还可清除体内受损伤的或有癌前病变的细胞，防止癌变；
③凋亡还参与构成机体的防御机制，当机体受到病毒感染时，可能通过诱导感染细胞凋亡来清除入侵的病毒。
四、研究细胞凋亡的进展及意义
SCI（ScienceCitationIndex）收录及引用论文检索说明：
全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域：
cellapoptosis,signaltransduction,genomeandpost-genomicanalysis。
美国NIH一份调查报告，目前全球研究最热门的是三种疾病：
cancer,cardiovasculardisease,infectiousdisease:
AIDS,hepatitis
寻找发病机制：
仅在几年前人们研究恶性肿瘤生长因素时注意力全部集中在细胞内部控制细胞分裂的通路上，设想可能由于该过程失控，从而引起肿瘤细胞无限增生。
有一定贡献，但是局限性。
寻找治疗方法：
肿瘤、心脑血管病、慢性炎症、免疫系统疾病，这些威胁性最大的疾病都是以细胞损伤和细胞失控为关键环节的慢性病。
所以细胞保护和细胞调节药物比杀伤药物的前景要开阔的多。
第二节细胞凋亡的形态学、生化改变
一、细胞凋亡的形态学变化：
细胞体积缩小，胞浆凝缩，内质网变疏松并与胞膜融合，核糖体、线粒体等聚集，但结构无明显改变，染色质逐渐凝聚成新月状附在核膜周边，嗜碱性增强，细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂，胞膜仍完整。
然后，胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体（apoptoticbodies）。
最终，凋亡小体被周围具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解。
凋亡小体（apoptoticbody）：
凋亡细胞通过发芽、起泡等方式脱落形成一些大小不等，内含胞质、细胞器及核碎片的膜包小体。
凋亡小体形成机制：
①凋亡细胞内聚集的染色质块，经核碎裂形成大小不等的染色质块（核碎片），然后整个细胞通过发芽（bybudding）、起泡（byzeiosis）等方式形成一个球形的突起并在其根部绞窄而脱落形成一些大小不等，内含胞质、细胞器及核碎片的膜包小体，
②通过分隔机制：
在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并脱落形成凋亡小体。
③凋亡细胞内线粒体、内质网等细胞器和其他胞质成分一起被内质网膜包裹形成自噬体，并与凋亡细胞膜融合后，自噬体排除细胞外成为凋亡小体。
④有些细胞在凋亡过程中并不通过上述方式形成若干个凋亡小体，而仅仅发生核固缩和胞质浓缩，成为单个致密小体，也被成为凋亡小体。
二、细胞凋亡的分子生物学变化
①胞内Ca2+浓度增高
②琼脂糖凝胶电泳180-200bp倍数的梯状条带（ladder）
Ca2+、Mg2+依赖的核酸内切酶核小体180-200bp
③生物大分子的合成依赖于新的RNA和蛋白质合成
三、凋亡与坏死的区别：
细胞凋亡与坏死的区别
第三节细胞凋亡的诱导、抑制因素
一、诱导细胞凋亡的因素
①物理因素紫外线、γ射线导致的DNA损伤可引起细胞凋亡；对胸腺细胞加热至43℃后快速回到37℃，也可触发细胞凋亡的发生。
②激素糖皮质激素，对淋巴细胞具有诱导作用。
③细胞因子某些靶细胞表面具有肿瘤坏死因子（TNF）受体，可受TNF的诱导发生凋亡；转化生长因子β1（TGF-β1）对肝细胞有诱导凋亡作用。
④免疫因素细胞毒T淋巴细胞（CTL）可分泌粒酶，引起靶细胞发生凋亡。
⑤细胞毒药物多种抗肿瘤药物通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程，可导致细胞凋亡。
阿霉素、顺铂是DNA损伤剂；
放线菌素D是大分子合成抑制剂；
VP-16是拓扑酶抑制剂。
⑥微生物因素细菌、病毒等致病微生物及其毒素可诱导细胞凋亡。
HIV感染时，可致大量CD4+淋巴细胞凋亡。
二、抑制细胞凋亡的因素
①细胞因子如造血集落刺激因子（CSF）、神经生长因子（NGF）、红细胞生成素（EPO）等，这些因子具有抑制细胞凋亡的作用。
②蛋白激酶C激活剂激活蛋白激酶C而抑制凋亡细胞死亡。
③微量元素锌Ca2+、Mg2+依赖的核酸内切酶可因受到锌的强烈抑制而减少细胞凋亡。
④激素某些激素（睾丸酮、雌激素等）可防止靶细胞凋亡。
睾丸酮对前列腺细胞、雌激素对子宫平滑肌细胞可防止靶细胞凋亡。
⑤其他因素药物苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、EB病毒、及中性氨基酸也具有抑制细胞凋亡的作用。
第四节细胞凋亡的信号传递系统及相关调控基因
一、细胞凋亡的信号传递系统的基本环节
凋亡信号传递系统是错综复杂的网络系统，它常与细胞增殖分化过程中的信号传递相偶联，至少在两种信号传递间存在部分共同通道。
第一个环节为各种触发因子与细胞膜受体结合触发凋亡反应。
各种触发因子可称为凋亡的第一信号系统；
第二个环节激活传导通路如钙、cAMP促进凋亡基因的表达；
第三个环节是通过改变细胞某些凋亡相关基因的表达，激活核酸内切酶促进细胞凋亡。
二、细胞凋亡信号转导系统的特点
①多样性不同种类的细胞有不同的信号转导系统
②偶联性同一信号，在不同条件下，既可引起细胞凋亡，也可引起细胞增殖
③同一性不同的诱导细胞凋亡的因素可以通过同一信号转导系统触发细胞凋亡，
提示切断某一信号转导途径，有可能影响多种诱导凋亡因素引起的细胞凋亡
④多途径同一凋亡诱导因素可经多条信号转导途径触发细胞凋亡
这意味着如要完全阻抑某一诱导细胞凋亡因素的作用，必须同时切断多条相关的信号转导途径。
三、细胞凋亡相关基因
细胞凋亡是由一系列基因控制并受复杂信号调节的细胞自然死亡现象。
最早、最完整来自对一种线虫（caenorhabditiselegans，CE）体细胞研究。
ced-3、ced-4的激活是CEPCD始动或继续所必需的。
ced-9可抑制线虫体细胞PCD的发生。
bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-celllymphoma/leukemia-2）的缩写。
230kb,bcl-2蛋白的生理功能主要是遏制细胞凋亡，延长细胞寿命，对细胞周期和分化不产生影响，这对于维持体内某些需长期生存的细胞如神经元、免疫记忆细胞、造血干祖细胞等的寿命具有重要意义。
一般认为bcl-2通过抑制诱导凋亡的信号而在肿瘤中发生作用。
并且bcl-2还可防止或延迟由辐射，糖皮质激素，热休克和多种化疗药物所诱导的凋亡。
bcl-2基因家族：
bcl-x、Bax等。
bcl-x有两种基因产物bcl-xl（抑制凋亡）和bcl-xs（促进凋亡）。
bcl-2和Bax蛋白水平高低与凋亡调控直接相关：
Bax增高，促进细胞凋亡；bcl-2增高，抑制细胞凋亡。
根据bcl-2蛋白高表达能保护细胞死亡而不是使细胞增生，认为bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的新型癌基因。
作为转录调节因子，c-myc蛋白一方面激活那些介导细胞增殖的基因，另一方面也激活介导凋亡的基因，给细胞两种选择：
增殖或凋亡。
双信号假说：
认为c-myc是第一信号，有介导细胞增殖或凋亡两种潜能。
如第二信号促进增殖，则细胞增殖；如第二信号抑制增殖，则细胞凋亡。
P53基因参与细胞凋亡的调节机制是，DNA损伤后激活了野生型P53基因，诱导细胞进入G1静止期，直到损伤DNA修复，如果损伤不被修复，P53就活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发生凋亡。
P53是Bax的正调因子、bcl-2的负调因子。
第五节细胞凋亡与肿瘤
一、肿瘤发病学中的细胞凋亡机制可能有：
①诱导凋亡基因的失活突变或抑制凋亡基因的过度表达；
②化学致癌剂、病毒通过影响凋亡机制而致癌；
③前癌细胞凋亡机制不全；
④机体免疫应答诱导肿瘤细胞凋亡的功能不全；
⑤宿主细胞粘附因子、生长因子等抑制肿瘤细胞凋亡；
⑥肿瘤细胞通过对生存信号的依赖性降低及竞争力增强等逃避凋亡，促进肿瘤转移与恶化。
二、细胞凋亡与肿瘤治疗
临床应用的放疗、化疗、热疗以及一些生物治疗的目的主要是引发细胞凋亡。
抗癌药物用于治疗肿瘤有两方面的作用：
抑制瘤细胞的增殖和促进瘤细胞的死亡。
阿霉素、顺铂是DNA损伤剂；放线菌素D是大分子合成抑制剂；VP-16是拓扑酶抑制剂。
以激素诱导细胞凋亡治疗某些肿瘤，如应用糖皮质激素可引起胸腺瘤、恶性淋巴瘤等瘤细胞凋亡；
以激素撤退诱导肿瘤细胞凋亡，如去除雄性激素诱导前列腺癌细胞凋亡，临床用雌激素治疗前列腺癌；用抗雌激素——多米酚、莫本芬可以阻断雌激素对乳腺癌生长的刺激作用，并可诱导乳腺癌细胞凋亡。
将凋亡基因导入肿瘤细胞的转基因治疗是一种很有前途的肿瘤基因治疗方法，例如将P53转入肿瘤细胞诱导瘤细胞凋亡。
基因及其产物诱导肿瘤细胞凋亡还可用一定的核苷酸序列（反义核苷酸）阻止那些抑制细胞凋亡的相关癌基因表达的治疗，也可诱导肿瘤细胞凋亡。
细胞凋亡与肿瘤的防治
是否经过治疗后发生凋亡，肿瘤化疗疗效的标志之一
增加凋亡指数与增生指数的比值已成为新的治疗目标
能否同时诱导细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的新标准
诱导细胞凋亡
目前治疗肿瘤新设想—诱导凋亡
导入野生型p53抑制肿瘤增生
下调突变型p53、bcl-2的活性与表达，减弱其对细胞凋亡的抑制
抑癌基因引入瘤细胞，降低致瘤性，使肿瘤逆转为正常细胞
引入某些细胞因子，抑制肿瘤恶性表型，使细胞丧失致瘤性
应用点突变技术，使异常表达基因失活或修复突变基因
导入药物敏感基因，有助于细胞凋亡
凋亡与其他疾病
一、细胞凋亡异常增加相关疾病
神经系统退行性病变
骨髓发育不良综合征
缺血性损伤心梗、肾小球肾炎
肝病变病毒性和酒精性肝炎
AIDS
二、细胞凋亡过度减少相关疾病
自身免疫性疾病：
SLE、GN
肿瘤：
激素依赖性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和淋巴造血肿瘤
各种病毒感染：
腺病毒、疱疹病毒
第八节细胞凋亡的检测方法
一、形态学观察方法
●HE染色、光镜观察：
圆、核深染、胞质浓缩、染色质团块状、膜“出芽”
●AO染色、荧光显微镜观察：
⑴活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光
⑵凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，膜有“凋亡小体”
●台盼蓝染色：
细胞不着色，活体或凋亡细胞；细胞着色，死亡细胞
●透射电镜：
⑴细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集、细胞器集中
⑵细胞膜起泡和出“芽”
⑶凋亡小体和凋亡小体被吞噬细胞吞噬
二、DNA凝胶电泳
●检测原理：
凋亡细胞DNA断裂有规律，180~200bpDNA片段；坏死细胞DNA断裂无规律
●结果判断：
活细胞，一条区带；凋亡细胞，梯状条带；坏死细胞，血抹片状连续性条带
●存在问题：
⑴不特征
⑵凋亡无DNA断裂
⑶灵敏性差，需106细胞
三、酶联免疫吸附法（ELIS-A）核小体测定
●原理：
DNA断裂有核小体，核小体由组蛋白和DNA片段构成
●方法简单，操作容易
●敏感性高，可检测5×102细胞
四、流式细胞仪定量分析
●原理：
凋亡细胞膜通透性介于正常细胞和坏死细胞之间
●特点：
⑴检测细胞数量大，较准确
⑵可作许多相关分析
⑶可确定凋亡细胞所处细胞周期
检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
●正常细胞不着色，荧光很浅
●凋亡细胞主要摄取Hoechs，强蓝色荧光
●坏死细胞主要摄取PI（碘化丙啶）红色
DNA片段原位标记法
●原理：
荧光素、地高辛或生物素标记的DUTP和TdT与凋亡细胞裂解后3`羟基端结合
●原位缺口转移
●原位缺口末端标记技术
检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法
●原理：
细胞凋亡早期细胞内侧磷脂酰丝氨酸迁移至细胞膜外侧；磷脂结合蛋白V同其有高度结合能力
●结果判断：
⑴正常细胞AnnexinV、PI均
低染
⑵凋亡细胞AnnexinV高染，PI
低染
⑶坏死细胞AnnexinV、PI均
高染
●应用价值
⑴灵敏，假阳性低
⑵简单省时
⑶结果可靠，是目前最为
合理的方法
概述和历史演变的进展5分钟
细胞凋亡的概念和细胞凋亡的生物学意义10分钟
细胞凋亡的形态学、生化改变
重点和难点20分钟
细胞凋亡的诱导、抑制因素5分钟
细胞凋亡的信号传递系统及相关调控基因10分钟
细胞凋亡与肿瘤重点和难点20钟
细胞凋亡的检测方法
10分钟
小结
复习思考题、作业题
下次课
预习要点
实施情况及分析
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