达托霉素的HPLC的方法学研究.docx
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达托霉素的HPLC的方法学研究
达托霉素的HPLC的方法学研究
摘要
建立达托霉素含量和有关物质的测定方法。
方法以达托霉素和一些杂质为对照品,采用高效液相色谱法进行测定。
色谱条件为色谱柱:
PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm,流速:
1.0ml/min,检测波长:
223nm,进样量:
25µl,柱温:
25℃,梯度洗脱的流动相A:
称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解,用磷酸调pH至3.1,流动相B:
乙腈。
结果使达托霉素的线性、精密度、准确度等达到了要求。
[关键词]含量,有关物质,线性,精密度,准确度,耐用性
目录
摘要3
一、仪器与药品5
二、方法建立与方法描述5
(一)、方法建立5
(二)、方法描述5
三、验证内容7
(一)系统适应性7
(二)降解实验8
(三)专属性8
(四)定量限LOQ和检测限LOD9
(五)线性12
(六)相对校正因子的计算18
(七)精密度18
(八)准确度23
(九)溶液稳定性26
(十)耐用性28
四、结论29
五、典型图谱30
六、参考文献30
一、仪器与药品
电子分析天平
XP205
已校正
高效液相色谱仪
Agilent1200
已校正
磷酸二氢铵
分析纯
上海光铧科技有限公司20121215
乙腈
色谱纯
MerckUN1648
注射用水
每日更新
本厂自制
纯化水
每日更新
本厂自制
达托霉素对照品
P1301,94.7%
本实验室内部标定
水解物
P1301,91.4%
本实验室内部标定
β-异构体
P1301,71.9%
本实验室内部标定
脱水物
P1301,86.6%
本实验室内部标定
达托霉素样品
S130301
浙江海正药业股份有限公司生产
二、方法建立与方法描述
(一)、方法建立
袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS(250×4.6mm,5.0μm);梯度洗脱的流动相A:
乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(30:
70),流动相B:
乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(70:
30);流速1.0mL/min;检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。
由于达托霉素的成品用上述方法使一些杂质分离的效果不是很理想,因此,把磷酸二氢铵缓冲盐的PH值调整为3.1,梯度也有相应的调整,检测波长使通过二极管阵列检测器(DAD)检测,在190nm~360nm区间进行DAD全波段扫描。
通过DAD扫描结果显示样品在223nm附近具有最大吸收,综合考虑确定223nm为高效液相色谱仪检测波长。
由于达托霉素的分子量比较大以及杂质与主峰分离效果综合考虑最终采用PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm色谱柱。
(二)、方法描述
[含量]
色谱柱:
PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm
流速:
1.0ml/min
检测波长:
223nm
进样量:
25µl
柱温:
25℃
进样器温度:
2~8℃
流动相A:
称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解,用磷酸调节pH至3.1
流动相B:
乙腈
流动相:
梯度洗脱
A(%)
B(%)
0
67.5
32.5
45
60
40
50
50
50
55
50
50
56
67.5
32.5
60
67.5
32.5
稀释剂:
注射用水
标准溶液:
精密称取达托霉素对照品25mg于50ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
样品溶液:
精密称取达托霉素样品25mg于50ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
系统适应性:
连续注射5针标准溶液,计算峰面积RSD不大于2.0%。
用下式计算达托霉素中C72H101N17O26的含量:
湿计含量%=
ru
×
Cs×P
×100%
rs
Cu
式中:
Cu,Cs分别是样品溶液与标准溶液的配制浓度(mg/ml)
rs是标准溶液所对应的主峰峰面积
ru为样品溶液所对应的主峰峰面积
P为对照品的含量,%
无水无残溶含量计算公式:
干计含量%=
湿计含量%
1-水分%-残溶%
限度:
以无水无溶剂计算,达托霉素中C72H101N17O26含量应≥93.0%。
[有关物质]
色谱条件和样品溶液同含量。
1%对照溶液:
精密移取含量项下标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
用下式计算各已知杂质、单个杂质和总杂质的含量:
含量%=
ru
×
Cs×P
×100%
rs
Cu
式中:
Cu,Cs分别是样品溶液与1.0%对照溶液的配制浓度(mg/ml)
rs是1.0%对照溶液所对应的主峰响应值
ru为样品溶液中各杂质对应的峰响应值
P为对照品的含量,%
限度:
脱水达托霉素≤1.5%,β异构体杂质≤0.7%,水解物≤0.4%,杂质1(RRT约为0.79)≤0.2%,杂质2(RRT约为0.92)≤0.2%,杂质3(RRT约为0.94)(C9)≤0.6%,杂质4(RRT约为0.96)≤0.5%,杂质5(RRT约为1.07)(C11)≤0.7%,杂质6组(RRT约为1.20~1.25)≤0.6%
单个未知杂质≤0.1%,总杂质≤5.0%
三、验证内容
(一)、系统适应性
系统适应性溶液:
精密称取达托霉素对照品P130125.01mg和25.11mg,分别置于2个50ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度,作为STD1溶液和STD2溶液。
当色谱系统平衡后,分别进1针空白溶液、进样5针STD1溶液和2针STD2溶液,计算RSD%和回收率,结果见表1。
表1.系统适应性结果
STD1的RSD:
≤2.0%
STD2回收率:
98.0~102.0%
序号
STD1峰面积
STD2峰面积
1st
22610.2
22805.0
2nd
22600.9
22695.4
3rd
22595.2
/
4th
22593.9
/
5th
22555.1
/
平均值
22591.1
22750.2
RSD(%)
0.09
0.34
回收率(%)
100.30
结论:
STD1的RSD%为0.09%,STD2的RSD%为0.34%,回收率为100.30%,均满足认可标准,系统适应性良好。
(二)、降解实验
通过对样品溶液及各种强降解条件下的产物使用DAD检测器进行分析,判断方法的专属性及稳定性指示性。
表2降解试验结果
溶液名称
新增杂质相对保留时间(RRT)
酸解
0.2424、0.2513、0.3534、0.4689、0.6032、0.6936、0.7222、0.7858、0.8761、1.5221、1.6449、1.6729
碱解
0.4689、0.6147、0.7766、1.1375、1.4352、1.5695
氧化
0.2424、0.2626、0.2899、0.3358、0.3833、0.3952、0.4294、0.5144、0.5612、0.6032、0.6531、0.6936、0.7276、0.7858、1.0891、1.4950、1.5221、1.5271、1.5372、1.5459、1.5588、1.5695、1.5727、1.6207、1.6263
光照
0.1669、0.1715、0.1777、0.1968、0.2076、0.2178、0.2513、0.3063、0.5144、0.5612、0.6032、0.6302、0.6531、0.6936、0.7222、0.7766、1.5221、1.5459、1.5588、1.6207
避光
0.6032、1.5221
加热
0.6032、0.6936、0.7766、0.7858、0.9771、1.0891、1.1375、1.3630、1.4462、1.4649、1.4950、1.5221、1.5459、1.5695、1.6609、1.6729、1.6972
高湿
0.5612、0.6032、0.6302、0.6936、0.7858、1.1375、1.5221、1.5459、1.5695、1.6207、1.6729
(三)、专属性
水解物单个专属性溶液:
精密称取水解物P13015.327mg于50ml容量瓶中,用乙腈:
水=1:
1溶解并定容至刻度。
β-异构体单个专属性溶液:
精密称取β-异构体P13015.930mg于50ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
脱水物单个专属性溶液:
精密称取脱水物P13015.380mg于50ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
达托霉素样品溶液:
精密称取达托霉素样品S13030125.78mg于50ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
混合溶液:
精密称取达托霉素样品S13030125.85mg于50ml容量瓶中,分别加入各单个专属性溶液5.0ml,用稀释剂溶解并定容至刻度。
分别进样空白溶液、各单个专属性溶液和混合溶液,考察空白溶液在各组分保留时间处是否存在干扰,相邻各组分间分离度,结果见表3。
表3专属性
理论塔板数≥2000
相邻组分间分离度≥1.0
水解物
β-异构体
达托霉素
脱水物
单个组分保留时间(min)
29.697
31.783
35.068
39.943
混合溶液各组分保留时间(min)
29.725
31.777
34.776
40.028
相对保留时间(RRT)
0.85
0.91
1.0
1.15
与相邻前一个色谱峰间分离度
1.08
1.52
1.83
1.11
与相邻后一个色谱峰间分离度
1.73
1.36
3.00
2.72
理论塔板数
29805
32487
25316
44523
结论:
各组分间分离度和理论塔板数均满足认可标准,专属性良好。
(四)、定量限LOQ和检测限LOD
1、定量限LOQ
(1)、未知杂质定量限
标准溶液:
精密称取达托霉素对照品P130125.39mg于50ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
1.0%对照溶液:
精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
未知杂质LOQ溶液:
精密移取1.0%对照溶液1.5ml于100ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
连续注射6针定量限溶液,计算峰面积RSD%和信噪比S/N,结果见表4-1。
表4-1未知杂质LOQ检测结果
LOQ浓度
序号
峰面积
S/N
未知杂质
Conc:
0.0721µg/ml
相当于主峰浓度0.0144%
1st
4.50242
12.0
2nd
4.20262
12.5
3rd
4.16507
12.1
4th
4.38089
12.3
5th
4.24095
11.0
6th
4.34012
13.7
平均值
4.30535
/
RSD%
2.94
/
RSD%≤5.0%,信噪比S/N:
10~15,LOQ≤0.05%
结论:
未知杂质LOQ浓度为0.0721µg/ml,峰面积RSD%为2.94%,信噪比均在10~15,均满足认可标准。
(2)、已知杂质定量限
水解物储备溶液:
精密称取水解物P13019.736mg于50ml容量瓶中,用乙腈:
水=1:
1溶解并定容至刻度。
水解物定量限储备溶液:
精密移取水解物储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
β-异构体储备溶液:
精密称取β-异构体P13019.011mg于20ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
β-异构体定量限储备溶液:
精密移取β-异构体储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
脱水物储备溶液:
精密称取脱水物P130113.584mg于20ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
脱水物定量限储备溶液:
精密移取脱水物储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
已知杂质定量限溶液:
分别精密移取水解物定量限储备溶液8.0ml、β-异构体定量限储备溶液5.0ml、脱水物定量限储备溶液3.5ml,置于同一100ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
连续注射6针定量限溶液,计算峰面积RSD%和信噪比S/N,结果见表4-2~4-4。
表4-2水解物LOQ检测结果
LOQ浓度
序号
峰面积
S/N
水解物
Conc:
0.0712µg/ml
相当于主峰浓度0.0142%
1st
2.98211
10.8
2nd
3.00327
10.6
3rd
3.01177
10.3
4th
3.06674
10.2
5th
3.03898
11.3
6th
2.85349
12.0
平均值
2.99273
/
RSD%
2.48
/
RSD%≤5.0%,信噪比S/N:
10~15,LOQ≤0.05%
表4-3β-异构体LOQ检测结果
LOQ浓度
序号
峰面积
S/N
β-异构体Conc:
0.0810µg/ml
相当于主峰浓度0.0162%
1st
3.22056
11.3
2nd
3.19458
12.1
3rd
3.43469
11.5
4th
3.29001
10.8
5th
3.10069
12.4
6th
3.14882
13.2
平均值
3.23156
/
RSD%
3.67
/
RSD%≤5.0%,信噪比S/N:
10~15,LOQ≤0.05%
表4-4脱水物LOQ检测结果
LOQ浓度
序号
峰面积
S/N
脱水物
Conc:
0.1029µg/ml
相当于主峰浓度0.0206%
1st
3.91158
12.0
2nd
3.83876
12.7
3rd
4.08405
12.4
4th
3.99076
12.2
5th
3.96843
13.7
6th
4.01022
14.8
平均值
3.96730
/
RSD%
2.13
/
RSD%≤5.0%,信噪比S/N:
10~15,LOQ≤0.05%
结论:
水解物LOQ浓度为0.0712µg/ml,峰面积RSD%为2.48%;β-异构体LOQ浓度为0.0810µg/ml,峰面积RSD%为3.67%;脱水物LOQ浓度为0.1029µg/ml,峰面积RSD%为2.13%,信噪比S/N均在10~15,均满足认可标准。
2、检测限LOD
(1)、未知杂质检测限
未知杂质检测限溶液:
精密移取未知杂质定量限溶液3.0ml于10ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
连续注射2针检测限溶液,计算信噪比S/N,结果见表4-5。
表4-5未知杂质检测限结果
LOD浓度
序号
峰面积
S/N
Conc:
0.0216µg/ml
相当于主峰浓度0.0043%
1st
1.31658
3.4
2nd
1.23401
3.1
平均值
1.27530
/
S/N:
2~5
结论:
未知杂质LOD浓度为0.0216µg/ml,信噪比S/N均在2~5,满足认可标准。
(2)、已知杂质检测限
已知杂质检测限溶液:
精密移取已知杂质定量限溶液3.0ml于10ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
连续注射2针检测限溶液,计算信噪比S/N,结果见表4-6~4-8。
表4-6水解物检测限结果
LOD浓度
序号
峰面积
S/N
Conc:
0.0214µg/ml
相当于主峰浓度0.0043%
1st
0.698758
2.5
2nd
0.882716
2.6
平均值
0.790737
/
S/N:
2~5
表4-7β-异构体检测限结果
LOD浓度
序号
峰面积
S/N
Conc:
0.0243µg/ml
相当于主峰浓度0.0049%
1st
1.24539
3.4
2nd
1.11254
3.4
平均值
1.17897
/
S/N:
2~5
表4-8脱水物检测限结果
LOD浓度
序号
峰面积
S/N
Conc:
0.0309µg/ml
相当于主峰浓度0.0062%
1st
0.949185
2.8
2nd
1.26179
2.7
平均值
1.10549
/
S/N:
2~5
结论:
水解物LOD浓度为0.0214µg/ml,β-异构体LOD浓度为0.0243µg/ml,脱水物LOD浓度为0.0309µg/ml,信噪比S/N均在2~5,均满足认可标准。
(五)、线性
(1)、含量线性
200%线性储备液:
精密称取达托霉素对照品P130149.21mg于50ml容量瓶中,用稀释剂溶解并定容至刻度。
线性溶液:
精密移取200%线性储备液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml,分别置于5个10ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度,即得到40%、80%、100%、120%、160%线性溶液。
每份溶液进样2针,记录数据,做线性回归曲线,求相关系数R、截距百分比(截距/100%含量浓度对应的峰面积×100%)。
结果见表5-1。
表5-1.达托霉素含量线性结果
R≥0.999
截距百分比≤3.0%
浓度(mg/ml)
峰面积
平均峰面积
40%溶液
0.1864
8811.59668
8793.04639
8774.49609
80%溶液
0.3728
17491.2
17464.6
17438.0
100%溶液
0.4660
22034.8
22031.2
22027.6
120%溶液
0.5592
26455.8
26450.7
26445.5
160%溶液
0.7456
35709.7
35704.9
35700.0
线性方程
Y=48119x-341.5
相关系数R
R=0.9999
截距百分比
1.55%
图1.达托霉素含量线性
结论:
达托霉素含量线性曲线相关系数R=0.9999,截距百分比1.55%,线性方程Y=48119x-341.5,在0.1864~0.7456mg/ml浓度范围内线性关系良好。
(2)、未知杂质线性
以未知杂质的限度0.5%(2.5µg/ml)对应的浓度为100%。
标准溶液和未知杂质定量限溶液:
同4.4.1.1“未知杂质定量限”项下“标准溶液和未知杂质定量限溶液”。
未知杂质线性储备溶液:
精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中,用稀释剂稀释至刻度。
未知杂质线性溶液:
精密移取未知杂质线性储备溶液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml,分别置于6个10ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度,即得到40%、80%、100%、120%、160%、200%线性系列溶液。
每份溶液进样2针,记录数据,做线性回归曲线,求相关系数R、截距百分比(截距/100%含量浓度对应的峰面积×100%)。
结果见表5-2。
表5-2.未知杂质线性结果
R≥0.99
截距百分比≤15.0%
浓度(µg/ml)
峰面积
平均峰面积
LOQ溶液
0.0721
3.85645
3.85113
3.84580
40%溶液
0.9618
45.14171
44.47160
43.80148
80%溶液
1.9235
89.02863
88.49642
87.96421
100%溶液
2.4044
110.87798
110.74789
110.61780
120%溶液
2.8853
135.99603
135.44470
134.89336
160%溶液
3.8471
179.34697
179.50304
179.65910
200%溶液
4.8089
232.37053
231.83741
231.30428
线性方程
Y=47.815x-1.9822
相关系数R
R=0.9995
截距百分比
1.79%
图2未知杂质线性曲线
结论:
达托霉素未知杂质线性曲线相关系数R=0.9995,截距百分比为1.79%,线性方程Y=47.815x-1.9822,在0.0721~4.8089µg/ml浓度范围内线性关系良好。
(3)、已知杂质线性
杂质储备溶液:
同4.4.1.2“已知杂质定量限”项下“各杂质储备溶液”的配制。
已知杂质定量限溶液:
同4.4.1.2“已知杂质定量限”项下“已知杂质定量限溶液”的配制。
1000%线性储备溶液:
分别精密移取水解物储备溶液10.0ml、β-异构体储备溶液7.0ml、脱水物储备溶液10.0ml,置于同一100ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度。
已知杂质线性溶液:
精密移取1000%线性储备溶液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml,分别置于6个50ml容量瓶中,用稀释剂定容至刻度,即得到40%、80%、100%、120%、160%、200%线性系列溶液。
每份溶液进样2针,记录数据,做线性回归曲线,求相关系数R、截距百分比(截距/100%含量浓度对应的峰面积×100%)。
结果见表5-3~5-5。
表5-3.水解物线性结果
R≥0.99
截距百分比≤15.0%
浓度(µg/ml)
峰面积
平均峰面积
LOQ溶液
0.0712
3.43870
3.27398
3.10926
40%溶液
0.7119
35.14776
35.40132
35.65487
80%溶液
1.4238
70.30833
70.77040
71.23246
100%溶液
1.7797
89.23345
88.65933
88.08520
120%溶液
2.1357
104.00508
103.48459
102.9641
160%溶液
2.8476
138.96315
138.82312
138.68309
200%溶液
3.5595
168.99667
168.63343
168.27019
线性方程
Y=47.613X+1.7836
相关系数R
R=0.9995
截距百分比
2.01%
图3.水解物线性曲线
表5-4β-异构体线性结果
R≥0.99
截距百分比≤15.0%
浓度(µg/ml)
峰面积
平均峰面积
LOQ溶液
0.0810
3.69919
3.58714
3.47509
40%溶液
0.9070
43.8074
42.94102
42.07464
80%溶液
1.8141
87.70026
87.77949
87.85872
100%溶液
2.2676
108.70023
108.26199
107.82375
120