组织培养的方法和步骤.docx
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组织培养的方法和步骤
组织培养的方法和步骤
日期：
2010年4月1日 来源：
互联网 作者：
植物组培网 点击：
3033
要根据培养目的适当选取材料，选择原则：
易于诱导、带菌少。
要选取植物组织内部无菌的材料。
这一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。
另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。
因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。
培养材料的消毒
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。
第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。
把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。
置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。
易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。
流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。
洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。
当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。
要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。
用70%酒精浸10～30s。
由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。
有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。
处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。
表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使用见表。
第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。
无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：
①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。
②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。
③升汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。
④漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。
⑤在消毒液中加入浓度为0.08—0.12%的吐温20或80（一种湿润剂），可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。
灭菌剂使用浓度（%）持续时间（min）去除的难易效果
次氯酸钙9~105~30易很好
次氯酸钠25~30易很好
氯化汞0.1~15~8较难最好
抗菌素4~50mg/L30~60中较好
制备外植体
将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。
在操作中严禁用手触动材料。
接种和培养
（一）接种
在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种1－2个，以防止交叉污染。
（二）封口
接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。
（三）温度
培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。
增殖
外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。
把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。
增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。
根的诱导
继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。
1个月后即可获得键壮根系。
组培苗的炼苗移栽试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。
一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。
移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。
组织培养中的清洗、消毒灭菌技术
日期：
2010年4月1日 来源：
互联网 作者：
植物组培网 点击：
2190
1、清洗植物组织培养用的各种玻璃器皿，特别是培养瓶和盛培养基的器皿，一定要严格清洗，以防油污、重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。
使用过的玻璃器皿应及时清洗，先将污物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。
玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。
凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。
器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定的地方，便于取用。
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：
物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。
高压灭菌的原理是：
在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。
高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。
常用方法是：
关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。
三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0．1-0．15Mpa时，维持15-20min。
•对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。
而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。
对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。
洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。
高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。
高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。
在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。
培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位。
环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。
在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0．43倍。
培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。
灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）•在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。
冷却后，立即使用。
操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。
干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到160-180~C的温度来杀死微生物。
由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170℃持续90min来灭菌。
干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。
包扎可用耐高温的塑料。
灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。
烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。
干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
过滤灭菌（不耐热的物质）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。
可用无菌的孔径0.20-0.45um的硝酸纤维素膜过滤菌类，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。
使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。
紫外线和熏蒸灭菌（空间）•
（1）紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。
紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。
紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。
（2）熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。
这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。
熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。
冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。
一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。
另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。
还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。
喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。
如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。
3、无菌操作
植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌，而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程，如少有疏忽，都会造成无法挽回的后果，使工作前功尽弃。
工作人员在进行无菌操作是要严守以下几点：
a.入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。
b.入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。
c.操作前要用70的酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。
不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。
每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。
d.必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。
盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。
培养物的不良表现及措施
日期：
2010年4月1日 来源：
互联网 作者：
植物组培网 点击：
2064
一：
培养物的不良及改进
1.培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯
可能原因：
表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。
改进措施：
调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。
2.培养物长期培养几乎无反应
可能原因：
基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。
改进措施：
更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。
3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状
可能原因：
激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。
改进措施：
减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。
4.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢
可能原因：
细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。
改进措施：
减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。
5.侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织
可能原因:
枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。
改进措施：
减少激素用量，采用较老化枝条。
二：
培养物的不良表现及改进措施（继代培养阶段）
1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高
可能原因：
细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。
改进措施：
增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。
2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化
可能原因：
细胞分裂素用量过多，温度不适宜。
改进措施：
减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。
3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化
可能原因:
生长素用量偏高,温度偏高。
改进措施：
减少生长素用量，适当降温。
4.叶粗厚变脆
可能原因：
生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。
改进措施：
适当减少激素用量，避免叶片接触培养基。
5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来
可能原因：
细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。
改进措施：
适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式。
6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽
可能原因：
细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。
改进措施：
减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度，更换封瓶纸的种类。
7.幼苗淡绿，部分失绿
可能原因：
无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。
改进措施：
针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。
8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中
可能原因：
瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。
改进措施：
及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。
三：
培养物的不良表现及改进措施（生根阶段）
1.培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织
可能原因：
生长素种类、用量不适宜；生根部位勇气不良；生根程序不当；PH值不适，无机盐浓度及配比不当。
改进措施：
改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液培养生根等。
2.愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。
可能原因：
生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。
改进措施：
调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度，附加VB2或PG等减少愈伤，改变生根培养程序等。
组培苗的褐化问题
日期：
2010年4月1日 来源：
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植物组培网 点击：
2034
很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。
影响褐变的因素很多，植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程度的影响褐变的程度。
一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。
培养基中含酚过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。
6-苄氨基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）也有诱导褐化的作用。
强光和高温同样会促进褐化现象。
为了防止外植体的褐变，需要选取酚类化合物含量较低的实验材料，选择无机盐含量较低，不加肌醇的培养基，并在较弱的光线或黑暗的条件中进行培养。
在培养基中加入抗氧化剂是防止褐变的有效措施。
常用的抗氧化剂有抗坏血酸（VC）、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。
可用抗氧化剂溶液预先处理外植体，或者在抗氧化剂溶液中切割和剥离外植体。
必要时还可以将几种抗氧化剂结合使用。
也可以将抗氧化剂加入到培养基中。
另一种方法是在培养基中加入0.5～1％的活性炭，吸附对生长有抑制作用的褐色醌类物质。
应当注意的是：
活性炭也能吸附培养基中的激素类物质，影响茎尖的分化和生长，因此在使用活性炭的场合，需要适当提高培养基中激素的浓度。
还有一种办法是不断地（每隔1～2d）将培养物转移到新鲜的培养基上，以摆脱老培养基中褐色物质的不利影响。
在使用液体培养基的情况下，这种方法相当有效。
1.在培养基中添加活性碳可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化。
对形态发生和器官形成有良好作用。
一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高是吸附力减弱，甚至会解吸附。
通常使用浓度为0.5-10g/L。
加入活性炭后使培养基变黑，对一些植物诱导生根有利。
大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加些琼脂。
很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶。
2.植物外植体组织在接种时的切割面会溢泌一些酚类物质，在接触空气中的氧气后其会氧化为相应的醌类物质，产生可见的茶色、褐色或黑色，此即谓“酚污染”。
在木本植物，尤其是热带木本植物及少量草本植物中，此现象较为严重。
常用的防治措施如下：
A.试用抗酚类氧化的药剂（半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。
该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。
用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间）
B.适当降低培养基温度。
C.接种后先进行一定时间的暗培养。
D.及时转接入新鲜培养基。
E.选择切取外植体部位等。
经验之谈：
1、易发生褐化的作物在进行组织培养时，先进行预培养（即培养在基础培养基中）2~3天（如果分泌物多，如利用花魔芋的球茎进行组织培养时，适当延长预培养时间并多次更换培养基），再培养到添加了激素的培养基上。
组培苗的玻璃化问题
日期：
2010年4月1日 来源：
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1876
在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。
这种试管苗生长异常现象就是P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（Vitrification）。
是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。
玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材；生根困难，移栽后也很难成活。
植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50%以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。
（一）玻璃苗发生的因素
琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。
Daniel G. W. Brown认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。
碳源不仅为芽的形成提供能量，而且也起渗透调节作用，主要影响培养基的渗势（Salisbury等）。
随琼脂浓度及纯度的增加，培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。
Debergh等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的形成，Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。
刘思颖等（1988）测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的1.9倍，含水量为正常苗的2.09倍—2.21倍。
自由水和高湿度可能与肉质嫩梢的形成有关。
Davis等研究表明，液体培养是导致玻璃化的主要原因。
可以断定，试管苗玻璃化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变态。
许多学者证明培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。
Debergh曾用14C-KT研究表明，随琼脂浓度的增加，KT利用率降低。
同时也证明，随BA浓度的增加，玻璃化率增加。
Bornman等用14C-BA研究表明，14C-BA的积累与不定芽分化和玻璃化是同步的。
玻璃化苗的一个重要特征是叶脉明显加长，而GA3也有类似效应，也许GA3促进了细胞过度生工，从而导致玻璃化。
生长素可以改变细胞壁的机械特性，使其具有更大的可塑性。
许多研究表明，非受伤的物理和化学协迫可以增加乙烯的合成。
玻璃化被认为是一种非受伤协迫条件下形态上的反应。
玻璃苗苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性低于正常植株。
在协迫条件下乙烯的快速合成，又通过抑制氨基环丙烷羧酸（ACC）酶的形成，对乙烯起反馈调节作用。
通过改善气体交换防止玻璃化形成，可能与克服乙烯反馈抑制有关。
一种与膜有关的过氧化物酶直接或间接掺入ACC合成乙烯。
现已证明，IAA-氧化酶体系至少在乙烯合成的最后一步起作用。
IAA含量降低将进一步通过IAA调节S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化成ACC这一过程，从而降低了乙烯形成。
Kevers等曾证明，对于玻璃苗，碱性过氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。
但总可溶性过氧化物酶活性增加，仅限于碱性提取物。
有人认为，玻璃化的形成主要是膜的效应而与核酸无关。
乙烯促进了叶绿素分解及细胞的畸形发展。
乙烯处理破坏了膜的结构，随着细胞壁解离，细胞内积累有在量纤维素及泡状物质。
可见，乙烯对玻璃化的影响，与改变组织的生理生化及纤维结构有关。
Hakkart F. A. 等认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。
密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一（陈国菊等1992，李云等1996）。
培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素。
有人发现不同部位的节段外植体与玻璃化有关，以留兰香基部节段所形成的试管苗玻璃苗严重，中部茎段次之，茎尖最好（柴明良）；重瓣丝石竹中部茎段出现玻璃苗较多，基部茎段较少，茎尖没有（郭达初）。
郭东红等（1989）认为瑞香茎尖外植体大小与玻璃化相关，茎尖外植体越小，出现玻璃苗比率越大。
（二）玻璃苗发生的机理
Kevers等的试验表明，苹果砧木M7等的玻璃苗是由于过氧化物酶——吲哚乙酸氧化酶系统控制的乙烯过饱和的影响，并认为细胞激动素和NH4+离子的过剩是一种最初的胁迫，受胁迫的试管苗在乙烯过剩的空气中，抑制了乙烯的生物合成，结果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性过氧化物酶的活性，从而妨碍组织木质化，导致形成玻璃苗。
一种诱导协迫（过多的细胞分裂素和NH4+），可以通过酚含量的快速化调节不断增加的过氧化物酶活性。
乙烯的大量形成又对其自身起反馈抑制作用，结果PAL和酸性过氧化物酶活性降低，从而抑制木质化过程的进行。
糖用于氨基酸的合成，纤维素含量降低。
由于缺乏纤维素和木质素，壁压降低，从而细胞过分吸水，并导致玻璃化。
张洪胜等认为在试管
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