酶水解法测定玉米中淀粉含量方法的探讨.docx
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酶水解法测定玉米中淀粉含量方法的探讨
酶水解法测定玉米中淀粉含量方法的探讨
刘海明，王旭艳，高凤宇
（承德避暑山庄企业集团有限责任公司，河北承德067500）
摘 要：
玉米中淀粉含量的测定方法有很多，GB/T5514-2008标准中规定采用酶水解法对玉米中的淀粉含量进行测定，但该方法存在结果偏低、偏差较大的缺点。
本实验对标准中的实验方法及相关条件进行了优化，如玉米称样量、加水量、液化酶用量、液化温度、液化时间、水浴条件、过滤方式、加酸量等，并对实验中存在的问题进行了分析和探讨，优化后的方法适合低脂肪谷物中淀粉含量的测定，具有实用、准确、稳定性好的特点。
关键词：
玉米；淀粉含量；酶水解
玉米是世界三大粮食作物（稻谷、小麦、玉米）之一，也是畜牧业生产的主要原料[1]。
玉米淀粉是淀粉的主要品种，占世界淀粉总量80%[2]。
玉米淀粉主要在玉米胚乳中，由单一的葡萄糖分子脱水聚合而成的，葡萄糖分子以α-1,4-糖苷键，α-1,3-糖苷键，α-1,6-糖苷键链接而成的天然物质，质量分数在70%～80%之间[3]。
近年来，随着玉米淀粉产量的加大，其在食品、制糖、发酵、医药和化工等的增稠剂、甜味剂中应用越来越多[4]。
淀粉含量的测定方法有酸水解法[5]，酶水解法[6]和旋光法[7]等，本文主要针对GB/T5514-2008[8]标准方法，为保证淀粉含量测定的准确性，对标准中的相关环节及存在的问题与不足之处进行了分析探讨，并提出了相关解决方法，为进一步完善酶水解法测定玉米中淀粉含量方法提出了建议。
1材料与方法
1.1材料、试剂及仪器
原料：
玉米（产地：
东北和承德，种类：
粉质和胶质玉米）。
试剂：
淀粉酶溶液（5g/L酶活力为14万U/mL的耐高温a-淀粉酶），碘溶液，甲基红指示液，6mol/L盐酸溶液，200g/L氢氧化钠溶液，碱性酒石酸铜甲液，碱性酒石酸铜乙液，葡萄糖标准溶液，所用试剂均为分析纯，且实验用水应符合GB/T6682中三级水的要求。
仪器与设备：
粉碎机，回流冷凝装置，天平，三角瓶，容量瓶，分样筛：
孔径0.45mm（40目）。
1.2实验原理
淀粉经淀粉酶水解成小分子糖，再用盐酸水解成还原性单糖，最后按GB/T5009.7-2008[9]测定还原糖，并折算成淀粉含量。
1.3实验方法
1.3.1淀粉酶溶液配制
称取耐高温α-淀粉酶0.5g，加100mL水溶解，临用现配。
碘溶液、盐酸溶液和氢氧化钠溶液和甲基红指示剂，均参照GB/T5514-2008中方法进行配制；碱性酒石酸铜甲液，碱性酒石酸铜乙液，葡萄糖标准溶液，均参照GB/T5009.7-2008的方法进行配制。
1.3.2玉米粉液化酶用量和液化时间的确定
称取2.0g的玉米粉4份进行糊化后，分别加入耐高温α-淀粉酶稀释液1mL、2mL、4mL、6mL在75~80℃水浴中进行液化实验（淀粉酶稀释液:
称取14万U/mL耐高温α-淀粉酶0.5g，加100mL水溶解，相当于700U/mL。
临用现配），在不同的时间分别取出上清液和试样中玉米细渣与碘液进行显色试验，细渣需要用玻璃棒进行研磨，通过渣子显色情况来判断细渣中淀粉是否完全液化好。
1.3.3计算
本文中所有实验标定碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖m1＝10.3mg，试剂空白消耗葡萄糖液都是10.2mL。
按GB/T5009.7-2008测定还原糖。
（1）试样中淀粉的计算公式：
X=
式中：
X一试样中淀粉的含量，g/100g；
ml一碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖（以葡萄糖计）的质量，mg；
m一称取试样的质量，g；
V一测定时平均消耗试样溶液的体积，mL；
m2—试剂空白相当于还原糖（以葡萄糖计）的质量，mg；
0.9—还原糖（以葡萄糖计）换算成淀粉的换算系数。
（2）试样中还原糖的计算公式：
X=
式中：
X一试样中还原糖的含量，g/100g；
m一称取试样的质量，g；
m2一标定时体积与加入样品后消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于还原糖的质量，mg。
2结果与分析
2.1玉米称样量和加水量的确定
选择合适的玉米称样量和加水量，对实验结果是很重要的。
标准要求称样量2-5g、加水量50mL，按此方法，我们选择2.7g称样量进行实验，糊化效果不好。
由于玉米含淀粉含量一般在60%以上，根据实验和定容时的稀释倍数最后我们选择称取2g玉米粉试样，加水量70mL时能够达到较好的糊化效果。
2.2洗涤与不洗涤玉米粉对淀粉含量测定的影响
按照GB/T5514-2008标准中7.3.1项，比较玉米粉进行洗涤（去除脂肪、可溶性糖）和不洗涤时其淀粉含量情况，测定结果如表1。
表1洗涤与不洗涤条件下淀粉含量的测定结果
玉米种类
水分
（%）
称样量
（g）
消耗葡萄糖
的体积（mL）
玉米淀粉
含量（%）
折14%水时玉米淀粉含量（%）
备注
承德玉米1#
13.8
2.008
9.00
63.6
63.4
*
2.018
9.20
61.9
61.8
#
东北玉米1#
13.1
2.007
8.90
64.3
63.6
*
2.006
9.15
62.6
62.0
#
东北玉米2#
12.9
2.001
9.00
63.8
63.0
*
2.006
9.40
60.9
60.1
#
注：
备注项不洗滤标注“*”，洗滤标注“#”
由表1可以看出，同一玉米样品不洗涤时，其淀粉含量比洗涤时高出1.6-2.9%，由此可以看出洗涤造成了淀粉的损失，致使测定结果偏低（标准中标注试样中脂肪含量很少时，可不用乙醚洗涤脂肪）。
2.3玉米中还原糖含量的测定试验
玉米中还原糖含量测定结果如表2。
表2玉米中还原糖含量的测定结果
玉米种类
称样量（g）
消耗葡萄糖的体积（mL）
还原糖含量（%）
承德玉米1#
2.005
9.60
0.87
承德玉米2#
2.000
9.65
0.81
承德玉米（陈化粮）
2.000
9.80
0.63
东北玉米1#
2.006
9.60
0.87
承德胶质玉米
2.006
10.10
0.25
承德粉质玉米
2.006
9.80
0.63
由表2可知，不同玉米所含的还原糖有所不同，含量范围在0.2~0.9%之间。
因此，结合表2和表3，建议称取试样2份约2g（精确至0.001g）分别于150mL三角瓶中，一份测定淀粉含量，另一份测定玉米中可溶性糖含量。
可溶性糖的测定是加100mL水浸泡半小时，用滤纸过滤、洗涤并定容至250mL，按GB/T5009.7测定其还原糖m0。
计算淀粉含量时可以减去可溶糖折淀粉的量，即玉米淀粉含量为X-0.9m0，可以省掉洗滤步骤，提高结果准确性。
2.4液化酶用量和液化所用时间的确定
GB/T5514-2008中要求液化温度为55~60℃，液化时间为1h，未注明是中温或高温淀粉酶。
鉴于酒精行业所用均为耐高温淀粉酶，通过文献资料[10]可知，耐高温α-淀粉酶液化的最佳温度是75~80℃（玉米液化液的温度）。
本实验采用耐高温α-淀粉酶，按照1.3.2对液化酶用量和液化时间进行优化，结果如表3、表4。
表3不同液化时间试样上清液遇碘液的变色情况
加酶体积（mL）
液化时间（min）
5
20
40
60
1
淡蓝色
棕色
浅棕色
浅黄色
2
棕色
浅棕色
浅黄色
浅黄色
4
浅棕色
浅黄色
浅黄色
浅黄色
6
浅棕色
浅黄色
浅黄色
浅黄色
表4不同液化时间试样中细渣遇碘液的变色情况
加酶体积（mL）
液化时间（min）
5
20
40
60
1
渣子蓝色
大部分渣子蓝色
小部分渣子显蓝色
渣子为棕黄色
2
渣子蓝色
小部分渣子蓝色
个别渣子显蓝色
渣子全为浅棕色
4
大部分渣子蓝色
小部分渣子蓝色
渣子全为浅棕色
渣子全为浅黄色
6
大部分渣子蓝色
个别渣子显蓝色
渣子全为浅黄色
渣子全为浅黄色
通过实验结果可以看出，糊化好的试样液化完全的标准应是液化液中的玉米细渣遇碘液变为浅黄色。
根据上述实验加入4mL淀粉酶稀释液能使2g玉米粉糊化液60min液化完全，为保证60min试样彻底液化完全，酶液的加入量应该过量。
因此，为保证更好的液化，本实验采用添加耐高温α-淀粉酶溶液6mL，液化温度75~80℃，液化时间60min。
2.5液化试样过滤方式的探讨
GB/T5514-2008中7.3.5步骤中过滤采用的是抽滤，本实验对采用抽滤与脱脂棉过滤定容液化试样中淀粉含量的测定进行了比较（此实验加盐酸溶液选择15mL，水解1h），结果如表5。
脱脂棉过滤和抽滤方式下，淀粉含量差别不大，而脱脂棉过滤操作更简单，因此，建议采用脱脂棉过滤。
表5不同抽滤方式液化试样中淀粉含量的比较
玉米种类
水分（%）
称样量（g）
消耗葡萄糖的体积（mL）
淀粉含量（%）
折14%水时玉米淀粉含量（%）
备注
承德玉米1#
12.4
2.008
8.85
64.6
63.4
a
2.008
8.88
64.4
63.2
b
承德玉米2#
12.6
2.009
8.70
65.7
64.6
a
2.009
8.65
66.0
64.9
b
承德玉米3#
11.6
2.026
8.65
65.6
63.9
a
2.026
8.60
65.9
64.1
b
注：
备注中脱脂棉过滤标注为“a”，抽滤标注为“b”
2.6水浴温度的确定
本实验分别采用水浴锅内水微沸状态和全部沸腾时，对玉米淀粉含量进行测定并比较（玉米样水分11.6%），结果如表6。
表6微沸和全沸条件下淀粉含量的测定结果
玉米产地
水浴状态
称样量（g）
消耗葡萄糖的体积（mL）
玉米淀粉含量（%）
折14%水时玉米淀粉含量（%）
承德玉米3#
微沸
2.007
9.02
63.4
61.7
承德玉米3#
全沸
2.009
8.71
65.7
63.9
注：
此实验加盐酸溶液选择15mL，水解1h。
通过实验结果可以看出，水浴温度对玉米淀粉含量影响很大，水浴锅内水全部沸腾时，淀粉含量提高2%左右，水解更彻底。
2.7加酸量的确定
按标准中7.3.6步骤，本实验采用水分为10.8%的东北玉米3#样（1等），分别添加盐酸溶液5mL、10mL，水解1h、1.5h、2h和加盐酸溶液15mL水解1h进行不同加酸量和不同水解时间的实验，结果如表7。
表7不同加酸量和水解时间对玉米淀粉含量的影响
玉米样品
称样量（g）
加酸量（mL）
水解时间（h）
消耗葡萄糖的体积（mL）
玉米淀粉含量（%）
折14%水时玉米淀粉含量（%）
东北玉米3#
2.004
5
1
9.12
62.8
60.5
东北玉米3#
2.004
5
1.5
8.69
66.0
63.8
东北玉米3#
2.007
5
2
8.64
66.3
63.9
东北玉米3#
2.004
10
1
8.69
66.0
63.8
东北玉米3#
2.008
10
1.5
8.55
66.9
64.5
东北玉米3#
2.007
10
2
8.45
67.8
65.4
东北玉米3#
2.014
15
1
8.41
67.9
65.5
由表7可以看出，当盐酸溶液的加入量为5mL时，其淀粉含量测定值均比较低；加入量为10mL水解2h和加入量为15mL水解1h的淀粉含量基本一致，且达到最高值。
从化验用时和节能方面考虑，应选择加盐酸溶液为15mL，水解1h。
按GB/T5514-2008方法中的步骤与优化后的条件：
称样量2.0g左右，加水70mL，糊化20分钟，稍冷后加入6mL耐高温α-淀粉酶溶液在75~80℃水浴上加热液化1h，将酶解完全的试样加热至沸，冷却后移入250mL容量瓶中，定容、摇匀、用脱脂棉过滤；取滤液50mL加15mL盐酸溶液，其它操作步聚同GB/T5514－2008中的7.3.6和7.4对两个样品中的淀粉含量进行重复性试验，实验结果如表8，由表8可知，两种方法的相对偏差均在5%以内，均符合标准规定；优化后的方法测定结果与我单位的生产实际相符，具有相对偏差更小，重复测定稳定性好的优势。
表8优化前后淀粉测定结果比较
方法
玉米样品
水分（%）
称样量（g）
消耗葡萄糖的体积（mL）
玉米淀粉含量（%）
折14%水时玉米淀粉含量（%）
相对
偏差（%）
GB/T5514-2008
承德玉米2#
13.1
2.040
9.52
59.1
58.5
1.7
2.017
9.60
59.3
58.7
1.3
2.015
9.19
62.0
61.4
3.2
东北玉米4#
15.1
2.006
9.62
59.5
60.3
0.2
2.012
9.80
58.2
59.0
2.0
2.000
9.50
60.4
61.2
1.7
优化后
承德玉米2#
13.1
2.016
8.80
64.8
64.1
0.5
2.076
8.50
65.1
64.4
0
2.009
8.75
65.4
64.7
0.5
东北玉米4#
15.1
2.030
8.90
63.6
64.4
0.9
2.042
9.05
62.2
63.0
1.3
2.001
9.08
63.2
64.0
0.3
3结论
通过对GB/T5514-2008中玉米淀粉含量的测定方法进行探讨。
实验结果表明，称取玉米粉试样2g，不进行洗涤，加水量70mL时，糊化效果较好。
糊化试样加入耐高温α-淀粉酶溶液6mL，液化温度为75~80℃，液化时间1h，将酶解液加热至全部沸腾，冷却后采用脱脂棉过滤定容后，加盐酸溶液为15mL，水解1h时，方法相对偏差远小于5%，符合标准规定，本方法适合低脂肪的谷物的淀粉含量的测定，具有实用、准确、稳定性好的特点。
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