实验室检查教学提纲.docx

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实验室检查教学提纲

实验室检查

一、血液采集

1.静脉采血；颈静脉、前臂头静脉、后肢隐外静脉、隐内静脉

2.心脏采血；胸右侧第四或第五肋间

抗凝剂：

1.乙二胺四乙酸（EDTA）：

对血红蛋白、血小板计数、血片染色均无影响，通常配成10％溶液，每2滴可使5毫升血液不凝固，但不能用于输血。

2.草酸钾：

优点溶解度大，抗凝作用强，缺点能使红细胞缩小，不适合用于红细胞压积的测定。

3.草酸铵与草酸钾合剂：

草酸钾4克，草酸铵6克，蒸馏水1000毫升，不能用于输血。

4.枸橼酸钠：

常用于血沉测定和输血时的抗凝剂，不适用于血液化学检查，配成3.8％溶液，与采血量以1:

10比例加入

5.肝素：

不宜做纤维蛋白原测定，其抗凝血涂片染色时，白细胞的着染性较差。

血样保存最长期限：

白细胞计数2～3小时，红细胞计数、血红蛋白测定21小时，红细胞沉降率3小时，红细胞压积测定24小时，血小板计数1小时放入冰箱内保存

红细胞计数

红细胞计数：

是指计算每立方毫米血液中所含红细胞的数目。

兽医临床多采用在试管内稀释的血液进行显微镜计数。

目前应用广泛的是血球自动计数仪计数。

实验所需的试剂：

生理盐水、蒸馏水、酒精、乙醚及动物血液等

实验器材：

显微镜、计数板、计数器、血盖片、小试管、5mL吸管、吸（洗）尔球、脱脂棉、擦镜纸等

实验的主要方法及步骤（稀释法）

1.血液的稀释：

用生理盐水作为稀释液，血液作200倍或是400倍稀释

2.寻找计数室：

将计数板盖上血盖片平放在显微镜的载物台上，在低倍镜、暗视野下寻找计数室

3.充液：

将配好的稀释液用吸管吸取一滴充在计数板与血盖片之间，并静置1~2min，等待红细胞全部下沉方可计数

4.计数：

在高倍镜下计数，计红细胞计数室中的四角的及中央的一个总共是5个中方格的红细胞数。

分别按照一定的顺序及压线的原则。

五个中方格分别用：

x1、x2、x3、x4、x5表示。

总数用X表示

5.计算：

每立方毫米血液中所含的红细胞总数用“R”表示

R=（x1+x2+x3+x4+x5）×5×10×血液稀释倍数，其中：

x1~x5为五个中方格的红细胞数，5表时只数5个中方格的数目，故算出1mm2的红细胞数，则要乘以5，10表示：

计数室的深度为0.1mm，要算出1mm的红细胞数,则要乘以10。

注：

各种动物正常数值见书（注意单位）

注意事项

1.所用的器材必须是清洁干燥的

2．吸取液体的量一定要准确，过多或过少都会影其结果

3．使用显微镜一定要规范，将其平放

4.充液时要将稀释液摇匀，量不可过多也不能太少，不能有气泡

5．寻找计数室时光圈要尽量关小，不要关死，否则在高倍镜下就看不到计数室

6．在计数时，不要把杂质和红细胞相混淆，否则就会影响结果

7．五个中方格一定要找准确，特别是中间的中方格的确定

临床意义

红细胞增多：

红细胞和血红蛋白含量增多，绝大多数为相对增多，见于各种因素导致的脱水等

红细胞减少：

红细胞和血红蛋白含量降低，主要是由于红细胞损失过多或生成不足所致，可见于各种贫血和失血、溶血、红细胞生成障碍等

二、白细胞计数

实验试剂

1%～3%冰醋酸或1%盐酸、蒸馏水、酒精、乙醚及动物血液等

实验器材

显微镜、计数板、计数器、血盖片、小试管、0.5mL吸管、吸尔球、擦镜纸等

实验步骤

红细胞计数

白细胞计数

血液稀释

取4mL的生理盐水于小试管中，然后用血红蛋白吸管吸血液10µL，将管外壁的血液擦拭干净，放置于装有生理盐水的小试管中，混匀

白细胞稀释液0.38mL或0.4mL；用沙利氏吸管吸取供检血液20μL，加入试管内，混匀

寻找计数室

将计数板盖上血盖片平放在显微镜的载物台上，在低倍镜下，暗视野下寻找计数室

与红细胞计数相似，只是将镜头调到白细胞计数室中（四角的4个大方格中的任何一个）

充液

将配好的稀释液用吸管吸取一滴充在计数板与血盖片之间，并静置1~2min再计数

同红细胞计数

计数

在高倍镜下计数，计红细胞计数室中四角及中央各一个中方格，总共4个中方格中的红细胞数

用低倍镜计数，计4个角上的4个大方格（共有16×4=64个中方格）的白细胞数，按顺序全部数完

计算

每立方毫米血液中所含的红细胞总数（个/mm3）=（x1+x2+x3+x4+x5）×5×10×稀释倍数

白细胞数（个/mm3）=W/4×10×20=W×50

或白细胞数（个/L）=W/4×10×20×106

注意事项

与红细胞计数相似，但也有区别：

在计数时，不要把杂质和白细胞相混淆，否则就会影响结果四个大方格的白细胞数之间的误差不能超过20%

临床意义

1.白细胞增多：

可见于多数细菌性感染和炎症，白血病时以白细胞的显著增多为特征

2.白细胞减少：

主要见于某些病毒性传染病，长期应用某些药物等白细胞分类计数

三、白细胞分类计数

实验试剂

瑞氏染色液、缓冲液、蒸馏水、香柏油等

实验器材

载玻片、脱脂棉、玻璃铅笔、吸水纸、染色缸及染色架、试管架、显微镜、擦镜纸、分数计数器等

实验步骤

（一）血涂片的制作

1.取两张载玻片，一张作为载片，选一张边缘比较光滑的玻片作为推片

2.将被检血液滴在载片的右侧

3.右手持推片置于血滴前方，并轻轻向后移动推片，与血液接触，待血液扩散开后，再以30°～40°向前均速推进涂抺，即形成一血膜，迅速自然风干，所涂血片，血液分布均匀，厚度适当，对光观察呈霓虹色，血膜位于玻片中央，两端留有适当空隙（以便注明畜别，编号及日期），血片制作完毕后，即可染色。

注意事项：

涂片时，血滴越大角度越大，推片速度越快则血膜越厚，反之血片越薄。

血片大薄，50％的白细胞集中于边缘或尾部，血涂片过后，细胞重叠缩小均不利于白细胞分类计数。

影响血液涂片分布不均的主要原因：

1．推片边缘不整齐

2.载玻片不清洁

3.推片角度

4.推片速度

（二）血涂片的染色（瑞氏染色法）

1.待血膜干燥后，在血膜的两端用玻璃铅笔划两条竖线

2.把玻片平放在染色架上，滴加瑞氏染液数滴（以盖满血膜为度），染色1~2min

3.加等量的磷酸盐缓冲液，用吸尔球吹匀，再染色3~5min

4.用细小的流水冲洗，吸水纸吸干，待检

姬姆萨氏染色法：

先将血涂片用甲醇固定3~5分，然后置于新配的姬姆萨氏应用液中，染色30~60分取出血片，水洗，吸干，待检

（三）镜检

先用低倍镜找到图像，再用高倍镜观察血膜上细胞的分布情况及染色质量等。

再换用油镜进行观察计数

计数方法：

通常在血片的两端或两端的上下部按二区或四区计数法，有顺序地移动血片，分别记录各种白细胞数，最后计算出各种白细胞所占比例（%）

嗜碱粒细胞

嗜酸粒细胞

杆状核晚幼

分叶核

单核细胞

小淋巴细胞大淋巴细胞

注意事项

1.载玻片应事先处理干净

2.推制血片时用力要均匀，两张玻片不要压得太紧

3.推片的边缘要平整光滑，否则血膜边缘不均匀且不整齐

4.画线是起到防止染色液外溢的作用，对染色效果没有影响

5.滴加瑞氏染液的量不宜太少

两个概念

1.核左移：

分析嗜中性粒细胞的增减变化时，杆状核和晚幼细胞增多，甚至出现髓细胞的比例增高，称为“核左移”

2.核右移：

若分叶核细胞显著增多，并且细胞核分为4～5叶甚至多叶的比例较多者，则称为“核右移”，表示造血机能减退

临床意义

1.嗜中性粒细胞增多：

常见于各种急性感染性疾病、急性炎症及重症烧伤、创伤

2.嗜中性粒细胞减少：

常见于病毒性疾病及各种疾病的重危期（如中毒性休克、胃肠破裂等）

3,嗜酸粒细胞增多：

见于某些寄生虫病、过敏性疾病（荨麻疹等）以及湿疹、疥癣等皮病

4.嗜酸粒细胞减少：

见于某些疾病的重症期，也可见于应用皮质类固醇药物。

嗜酸粒细胞长时间消失，表示预后不良，但消失后又重新出现，则说明病情好转

5.淋巴细胞增多：

见于某些慢性传染病、淋巴性白血病；急性传染病的恢复期、某些病毒性疾病及血孢子虫病等

6.淋巴细胞减少：

当嗜中性粒细胞绝对值增多时，伴随减少的常常是淋巴细胞。

说明机体与病原处于斗争阶段，此后淋巴细胞由少逐渐增多，往往是预后良好的指征

7.单核细胞增多：

原虫病、慢性细菌性疾病以及病毒性疾病（如马传染性贫血）

8.单核细胞减少：

急性传染病的初期和各种疾病的垂危期

嗜碱粒细胞的增多或减少：

此种情况较少见，对其增多、减少的意义尚不是很清楚。

诊断意义不是很大

四、血红蛋白测定

实验原理

红细胞遇酸溶解，游离出血红蛋白，并被酸化为褐色的酸性血红素，稀释后与标准色柱比色，即可求得血红蛋白的含量

实验器材

血红蛋白试纸、血红蛋白标准比色板、血红蛋白吸管、比色管、比色架、小试管、脱脂棉等

实验试剂

3.8%枸橼酸钠、1%盐酸溶液、蒸馏水、酒精、乙醚等

血红蛋白试纸法

测定时，取试纸一条，吸附被检血液一小滴，待血完全浸透后，立即置于所附标准色板的小孔下，肉眼与色板色泽进行比较，选择颜色相同或近似者，即得血液所含血红蛋白的克数沙利氏血红蛋白测定法

（1）在测定管内加1%盐酸溶液至“2”刻度处

（2）用血红蛋白吸管吸20µL的血液，加入测定管内并混匀，注意不要产生气泡

（3）静置10min，然后向比色管内滴加盐酸溶液并摇匀，再与标准比色管进行比色。

直到比色管内的颜色与标准比色管一致为止

（4）读取液体凹面的刻度，即为血红蛋白的含量

（5）将结果与正常值比较

临床意义

（1）血红蛋白含量增多：

多见于机体脱水而血液浓缩和各种疾病，如腹泻、呕吐等

（2）血红蛋白含量降低：

主要是由于红细胞损失过多或生成不足所致，可见于各种贫血和失血、溶血、红细胞生成障碍等

注意事项

•各种器材必须干净、干燥

•用血红蛋白吸血不能多也不能少

•读数时若管内有气泡，可蘸取酒精少许并接触气泡部位，即会消除

•血红蛋白吸管外壁的液体一定要擦干净，否则结果就会偏大。

•比色的时候一定要用光面比色，另外加盐酸的时候要一滴一滴加，不能过快，否则颜色就会变浅

五、红细胞沉降速率测定

器材与试剂

血沉管和血沉架，魏氏血沉管；

5mL刻度试管，3.8%枸椽酸钠溶液

1.取5mL刻度试管加3.8%枸橼酸钠1mL，再采静脉血4mL，将之混匀

2.用血沉管吸以上血液至“0”刻度处，用脱脂棉擦去管外壁的血液

3.将血沉管垂直放置于血沉架上，并开始计时，每隔15min计红细胞下降的刻度（毫米数），共计数四次值

注意事项

1.血沉管必须垂直放置，如果倾斜血沉会加快

2.血沉管必须是干燥干净的，否则也会影响血沉的速度

3.室温条件要在20℃左右，否则会影响血沉的速度，温度升高，血沉加快；温度降低，血沉减慢

4.血液抗凝剂的比例应为4:

1；否则也会影响结果

临床意义

1.血沉加快：

见于各种贫血、急性全身性感染、各种急性局部炎症、创伤、手术、骨折等细胞受到损伤及某些毒物中毒等

2.血沉变慢：

可见于脱水、高热性疾病、心力衰竭，以及某些引起纤维蛋白原含量严重减低的肝脏疾患等

动物

15min

30min

45min

60min

犬

0.20

0.90

1.20

2.50

猫

0.10

0.70

0.80

3.00

六、血小板计数

原理：

尿素能容解红细胞及白细胞而保存完整形态的血小板，经稀释后在细胞计数室内直接计数，以求的每立方毫米血液内的血小板数。

稀释液中的枸橼酸钠有抗凝作用，甲醛可固定血小板的形态。

试剂：

尿素10.0克，枸橼酸钠0.5克，40％甲醛溶液0.1毫升，蒸馏水加至100毫升。

待上述试剂完全溶解后，过滤，置冰箱可保存1～2周，在22℃～32℃在稀释液变质时，溶解红细胞能力就会降低。

方法：

1.吸取稀释液0.38毫升置于小试管中。

2.用沙利氏吸血管吸取混有EDTA二钠的新鲜血液至20立方毫米刻度处。

3.擦去管外血液，插入试管，吹吸数次，轻轻振荡，充分混匀。

静置20分以上，使红细胞溶解。

4.用毛细细血管吸取一小滴，充入计数室，静置10分，用高倍镜观察

在高倍镜下，血小板呈椭圆形，圆形或不规则折光小体，注意切勿误将尘埃等异物计入。

计算：

1mm³中的血小板个数=X×200

注意事项：

器械必须清洁，稀释液必须新鲜无沉淀，否则影响计数结果。

采血要迅速，以防止血小板离体后破裂，聚集，造成误差。

滴入计数室前要充分振荡，使红细胞充分溶解，但不能振荡过久或过于剧烈，以免破坏血小板，滴入计数室后，应静置一段时间。

在夏季，应注意保持湿度，即将计数板放在铺有湿滤纸的培养皿，在计数板下隔以火柴棒，避免直接接触。

由于血小板体积小，质量较轻，不易下沉，常不在同一焦距的平面上。

因此在计数时，在利用显微镜的微螺旋来调节焦距，才能看清楚。

正常参考值：

犬:

55万个/mm³,猫：

50万个/mm³

临床意义：

1.血小板减少：

生成减少见于再生障碍性贫血，急性白血病，放、化疗时等，血小板破坏增多见于匣发性血小板减少性紫癜、脾功能亢进等；消耗过多见于弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜。

2.血小板增多：

原发性见于原发性血小板增多症、硬骨髓增生综合症等，继发性见于急性感染、急性出血及急性溶血等。