实验室检查教学提纲.docx
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实验室检查教学提纲
实验室检查
一、血液采集
1.静脉采血;颈静脉、前臂头静脉、后肢隐外静脉、隐内静脉
2.心脏采血;胸右侧第四或第五肋间
抗凝剂:
1.乙二胺四乙酸(EDTA):
对血红蛋白、血小板计数、血片染色均无影响,通常配成10%溶液,每2滴可使5毫升血液不凝固,但不能用于输血。
2.草酸钾:
优点溶解度大,抗凝作用强,缺点能使红细胞缩小,不适合用于红细胞压积的测定。
3.草酸铵与草酸钾合剂:
草酸钾4克,草酸铵6克,蒸馏水1000毫升,不能用于输血。
4.枸橼酸钠:
常用于血沉测定和输血时的抗凝剂,不适用于血液化学检查,配成3.8%溶液,与采血量以1:
10比例加入
5.肝素:
不宜做纤维蛋白原测定,其抗凝血涂片染色时,白细胞的着染性较差。
血样保存最长期限:
白细胞计数2~3小时,红细胞计数、血红蛋白测定21小时,红细胞沉降率3小时,红细胞压积测定24小时,血小板计数1小时放入冰箱内保存
红细胞计数
红细胞计数:
是指计算每立方毫米血液中所含红细胞的数目。
兽医临床多采用在试管内稀释的血液进行显微镜计数。
目前应用广泛的是血球自动计数仪计数。
实验所需的试剂:
生理盐水、蒸馏水、酒精、乙醚及动物血液等
实验器材:
显微镜、计数板、计数器、血盖片、小试管、5mL吸管、吸(洗)尔球、脱脂棉、擦镜纸等
实验的主要方法及步骤(稀释法)
1.血液的稀释:
用生理盐水作为稀释液,血液作200倍或是400倍稀释
2.寻找计数室:
将计数板盖上血盖片平放在显微镜的载物台上,在低倍镜、暗视野下寻找计数室
3.充液:
将配好的稀释液用吸管吸取一滴充在计数板与血盖片之间,并静置1~2min,等待红细胞全部下沉方可计数
4.计数:
在高倍镜下计数,计红细胞计数室中的四角的及中央的一个总共是5个中方格的红细胞数。
分别按照一定的顺序及压线的原则。
五个中方格分别用:
x1、x2、x3、x4、x5表示。
总数用X表示
5.计算:
每立方毫米血液中所含的红细胞总数用“R”表示
R=(x1+x2+x3+x4+x5)×5×10×血液稀释倍数,其中:
x1~x5为五个中方格的红细胞数,5表时只数5个中方格的数目,故算出1mm2的红细胞数,则要乘以5,10表示:
计数室的深度为0.1mm,要算出1mm的红细胞数,则要乘以10。
注:
各种动物正常数值见书(注意单位)
注意事项
1.所用的器材必须是清洁干燥的
2.吸取液体的量一定要准确,过多或过少都会影其结果
3.使用显微镜一定要规范,将其平放
4.充液时要将稀释液摇匀,量不可过多也不能太少,不能有气泡
5.寻找计数室时光圈要尽量关小,不要关死,否则在高倍镜下就看不到计数室
6.在计数时,不要把杂质和红细胞相混淆,否则就会影响结果
7.五个中方格一定要找准确,特别是中间的中方格的确定
临床意义
红细胞增多:
红细胞和血红蛋白含量增多,绝大多数为相对增多,见于各种因素导致的脱水等
红细胞减少:
红细胞和血红蛋白含量降低,主要是由于红细胞损失过多或生成不足所致,可见于各种贫血和失血、溶血、红细胞生成障碍等
二、白细胞计数
实验试剂
1%~3%冰醋酸或1%盐酸、蒸馏水、酒精、乙醚及动物血液等
实验器材
显微镜、计数板、计数器、血盖片、小试管、0.5mL吸管、吸尔球、擦镜纸等
实验步骤
红细胞计数
白细胞计数
血液稀释
取4mL的生理盐水于小试管中,然后用血红蛋白吸管吸血液10µL,将管外壁的血液擦拭干净,放置于装有生理盐水的小试管中,混匀
白细胞稀释液0.38mL或0.4mL;用沙利氏吸管吸取供检血液20μL,加入试管内,混匀
寻找计数室
将计数板盖上血盖片平放在显微镜的载物台上,在低倍镜下,暗视野下寻找计数室
与红细胞计数相似,只是将镜头调到白细胞计数室中(四角的4个大方格中的任何一个)
充液
将配好的稀释液用吸管吸取一滴充在计数板与血盖片之间,并静置1~2min再计数
同红细胞计数
计数
在高倍镜下计数,计红细胞计数室中四角及中央各一个中方格,总共4个中方格中的红细胞数
用低倍镜计数,计4个角上的4个大方格(共有16×4=64个中方格)的白细胞数,按顺序全部数完
计算
每立方毫米血液中所含的红细胞总数(个/mm3)=(x1+x2+x3+x4+x5)×5×10×稀释倍数
白细胞数(个/mm3)=W/4×10×20=W×50
或白细胞数(个/L)=W/4×10×20×106
注意事项
与红细胞计数相似,但也有区别:
在计数时,不要把杂质和白细胞相混淆,否则就会影响结果四个大方格的白细胞数之间的误差不能超过20%
临床意义
1.白细胞增多:
可见于多数细菌性感染和炎症,白血病时以白细胞的显著增多为特征
2.白细胞减少:
主要见于某些病毒性传染病,长期应用某些药物等白细胞分类计数
三、白细胞分类计数
实验试剂
瑞氏染色液、缓冲液、蒸馏水、香柏油等
实验器材
载玻片、脱脂棉、玻璃铅笔、吸水纸、染色缸及染色架、试管架、显微镜、擦镜纸、分数计数器等
实验步骤
(一)血涂片的制作
1.取两张载玻片,一张作为载片,选一张边缘比较光滑的玻片作为推片
2.将被检血液滴在载片的右侧
3.右手持推片置于血滴前方,并轻轻向后移动推片,与血液接触,待血液扩散开后,再以30°~40°向前均速推进涂抺,即形成一血膜,迅速自然风干,所涂血片,血液分布均匀,厚度适当,对光观察呈霓虹色,血膜位于玻片中央,两端留有适当空隙(以便注明畜别,编号及日期),血片制作完毕后,即可染色。
注意事项:
涂片时,血滴越大角度越大,推片速度越快则血膜越厚,反之血片越薄。
血片大薄,50%的白细胞集中于边缘或尾部,血涂片过后,细胞重叠缩小均不利于白细胞分类计数。
影响血液涂片分布不均的主要原因:
1.推片边缘不整齐
2.载玻片不清洁
3.推片角度
4.推片速度
(二)血涂片的染色(瑞氏染色法)
1.待血膜干燥后,在血膜的两端用玻璃铅笔划两条竖线
2.把玻片平放在染色架上,滴加瑞氏染液数滴(以盖满血膜为度),染色1~2min
3.加等量的磷酸盐缓冲液,用吸尔球吹匀,再染色3~5min
4.用细小的流水冲洗,吸水纸吸干,待检
姬姆萨氏染色法:
先将血涂片用甲醇固定3~5分,然后置于新配的姬姆萨氏应用液中,染色30~60分取出血片,水洗,吸干,待检
(三)镜检
先用低倍镜找到图像,再用高倍镜观察血膜上细胞的分布情况及染色质量等。
再换用油镜进行观察计数
计数方法:
通常在血片的两端或两端的上下部按二区或四区计数法,有顺序地移动血片,分别记录各种白细胞数,最后计算出各种白细胞所占比例(%)
嗜碱粒细胞
嗜酸粒细胞
杆状核晚幼
分叶核
单核细胞
小淋巴细胞大淋巴细胞
注意事项
1.载玻片应事先处理干净
2.推制血片时用力要均匀,两张玻片不要压得太紧
3.推片的边缘要平整光滑,否则血膜边缘不均匀且不整齐
4.画线是起到防止染色液外溢的作用,对染色效果没有影响
5.滴加瑞氏染液的量不宜太少
两个概念
1.核左移:
分析嗜中性粒细胞的增减变化时,杆状核和晚幼细胞增多,甚至出现髓细胞的比例增高,称为“核左移”
2.核右移:
若分叶核细胞显著增多,并且细胞核分为4~5叶甚至多叶的比例较多者,则称为“核右移”,表示造血机能减退
临床意义
1.嗜中性粒细胞增多:
常见于各种急性感染性疾病、急性炎症及重症烧伤、创伤
2.嗜中性粒细胞减少:
常见于病毒性疾病及各种疾病的重危期(如中毒性休克、胃肠破裂等)
3,嗜酸粒细胞增多:
见于某些寄生虫病、过敏性疾病(荨麻疹等)以及湿疹、疥癣等皮病
4.嗜酸粒细胞减少:
见于某些疾病的重症期,也可见于应用皮质类固醇药物。
嗜酸粒细胞长时间消失,表示预后不良,但消失后又重新出现,则说明病情好转
5.淋巴细胞增多:
见于某些慢性传染病、淋巴性白血病;急性传染病的恢复期、某些病毒性疾病及血孢子虫病等
6.淋巴细胞减少:
当嗜中性粒细胞绝对值增多时,伴随减少的常常是淋巴细胞。
说明机体与病原处于斗争阶段,此后淋巴细胞由少逐渐增多,往往是预后良好的指征
7.单核细胞增多:
原虫病、慢性细菌性疾病以及病毒性疾病(如马传染性贫血)
8.单核细胞减少:
急性传染病的初期和各种疾病的垂危期
嗜碱粒细胞的增多或减少:
此种情况较少见,对其增多、减少的意义尚不是很清楚。
诊断意义不是很大
四、血红蛋白测定
实验原理
红细胞遇酸溶解,游离出血红蛋白,并被酸化为褐色的酸性血红素,稀释后与标准色柱比色,即可求得血红蛋白的含量
实验器材
血红蛋白试纸、血红蛋白标准比色板、血红蛋白吸管、比色管、比色架、小试管、脱脂棉等
实验试剂
3.8%枸橼酸钠、1%盐酸溶液、蒸馏水、酒精、乙醚等
血红蛋白试纸法
测定时,取试纸一条,吸附被检血液一小滴,待血完全浸透后,立即置于所附标准色板的小孔下,肉眼与色板色泽进行比较,选择颜色相同或近似者,即得血液所含血红蛋白的克数沙利氏血红蛋白测定法
(1)在测定管内加1%盐酸溶液至“2”刻度处
(2)用血红蛋白吸管吸20µL的血液,加入测定管内并混匀,注意不要产生气泡
(3)静置10min,然后向比色管内滴加盐酸溶液并摇匀,再与标准比色管进行比色。
直到比色管内的颜色与标准比色管一致为止
(4)读取液体凹面的刻度,即为血红蛋白的含量
(5)将结果与正常值比较
临床意义
(1)血红蛋白含量增多:
多见于机体脱水而血液浓缩和各种疾病,如腹泻、呕吐等
(2)血红蛋白含量降低:
主要是由于红细胞损失过多或生成不足所致,可见于各种贫血和失血、溶血、红细胞生成障碍等
注意事项
•各种器材必须干净、干燥
•用血红蛋白吸血不能多也不能少
•读数时若管内有气泡,可蘸取酒精少许并接触气泡部位,即会消除
•血红蛋白吸管外壁的液体一定要擦干净,否则结果就会偏大。
•比色的时候一定要用光面比色,另外加盐酸的时候要一滴一滴加,不能过快,否则颜色就会变浅
五、红细胞沉降速率测定
器材与试剂
血沉管和血沉架,魏氏血沉管;
5mL刻度试管,3.8%枸椽酸钠溶液
1.取5mL刻度试管加3.8%枸橼酸钠1mL,再采静脉血4mL,将之混匀
2.用血沉管吸以上血液至“0”刻度处,用脱脂棉擦去管外壁的血液
3.将血沉管垂直放置于血沉架上,并开始计时,每隔15min计红细胞下降的刻度(毫米数),共计数四次值
注意事项
1.血沉管必须垂直放置,如果倾斜血沉会加快
2.血沉管必须是干燥干净的,否则也会影响血沉的速度
3.室温条件要在20℃左右,否则会影响血沉的速度,温度升高,血沉加快;温度降低,血沉减慢
4.血液抗凝剂的比例应为4:
1;否则也会影响结果
临床意义
1.血沉加快:
见于各种贫血、急性全身性感染、各种急性局部炎症、创伤、手术、骨折等细胞受到损伤及某些毒物中毒等
2.血沉变慢:
可见于脱水、高热性疾病、心力衰竭,以及某些引起纤维蛋白原含量严重减低的肝脏疾患等
动物
15min
30min
45min
60min
犬
0.20
0.90
1.20
2.50
猫
0.10
0.70
0.80
3.00
六、血小板计数
原理:
尿素能容解红细胞及白细胞而保存完整形态的血小板,经稀释后在细胞计数室内直接计数,以求的每立方毫米血液内的血小板数。
稀释液中的枸橼酸钠有抗凝作用,甲醛可固定血小板的形态。
试剂:
尿素10.0克,枸橼酸钠0.5克,40%甲醛溶液0.1毫升,蒸馏水加至100毫升。
待上述试剂完全溶解后,过滤,置冰箱可保存1~2周,在22℃~32℃在稀释液变质时,溶解红细胞能力就会降低。
方法:
1.吸取稀释液0.38毫升置于小试管中。
2.用沙利氏吸血管吸取混有EDTA二钠的新鲜血液至20立方毫米刻度处。
3.擦去管外血液,插入试管,吹吸数次,轻轻振荡,充分混匀。
静置20分以上,使红细胞溶解。
4.用毛细细血管吸取一小滴,充入计数室,静置10分,用高倍镜观察
在高倍镜下,血小板呈椭圆形,圆形或不规则折光小体,注意切勿误将尘埃等异物计入。
计算:
1mm³中的血小板个数=X×200
注意事项:
器械必须清洁,稀释液必须新鲜无沉淀,否则影响计数结果。
采血要迅速,以防止血小板离体后破裂,聚集,造成误差。
滴入计数室前要充分振荡,使红细胞充分溶解,但不能振荡过久或过于剧烈,以免破坏血小板,滴入计数室后,应静置一段时间。
在夏季,应注意保持湿度,即将计数板放在铺有湿滤纸的培养皿,在计数板下隔以火柴棒,避免直接接触。
由于血小板体积小,质量较轻,不易下沉,常不在同一焦距的平面上。
因此在计数时,在利用显微镜的微螺旋来调节焦距,才能看清楚。
正常参考值:
犬:
55万个/mm³,猫:
50万个/mm³
临床意义:
1.血小板减少:
生成减少见于再生障碍性贫血,急性白血病,放、化疗时等,血小板破坏增多见于匣发性血小板减少性紫癜、脾功能亢进等;消耗过多见于弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜。
2.血小板增多:
原发性见于原发性血小板增多症、硬骨髓增生综合症等,继发性见于急性感染、急性出血及急性溶血等。