国家自然科学基金申请书.docx
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国家自然科学基金申请书
填报说明
一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。
申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。
表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。
外来语要同时用原文和中文表达。
第一次出现的缩写词，须注出全称。
二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。
第三页起各栏空格不够时，请自行加页。
一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。
地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。
三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。
四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究：
—在读（含在职）研究生
—已离退休的科研人员
—申请单位的兼职科研人员
五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。
六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。
七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。
科学部将对此信息保密。
八、国家自然科学基金委员会地址：
北京市海淀区双清路83号，通讯地址：
北京8610信箱。
邮政编码：
100085
一、简表
研
究
项
目
名
称
中文
A
型
禽
流
感
病
毒
致
病
和
免
疫
发
病
机
理
的
研
究
英文
StudiesofpathogenesisandimmunitymechanismofavianinfluenzavirustypeA
类别
A.自由申请B.高技术探索C.青年D.地区
高技术探索
项目主题号
E.重大F.重点H.专项
F
申报学科
名称1
畜禽病理学
名称2
A.基础研究
B.应用基础
代码1
C02030606
代码2
B
申请金额
1
6
0
·.
0
0
万元
起止年月
2003年1月至2006年12月
所用实验室
A.国家重点B.部门开放
实验室编号
A
申
请
者
姓
名
中文
郑世民
性
别
A.男
出生年月
1959年9月
民
族
名称
汉
拼音
Zhengshimin
B.女
A
身份证号
2307
代码
01
专业技术职务
名称
教授
学位
A.博士
B.硕士
C.学士A
博士学位授予国别或地区
国（地区）名
中国
A.院士
B.博士生导师
C.博士后
代码
011
代码
156
所在单位
名称
东北农业大学
系（所）
动物医学院
单位代码
性质
A.高等院校
B.科研机构
C.其它
邮政编码
150030
隶属
关系
名称
黑龙江省
A
申请者电话
（0451）5390405
代码
923
所在地
省（自治区、直辖市）市（县）区街（路）号
项
目
组
总人数
高级
中级
初级
博士
博士生
硕士生
参加单位数
10
7
3
2
姓名
身份证号
专业技术职务
所在单位名称及代码
项目中
的分工
签字
孔宪刚
2395
研究员、博导
哈尔滨兽医研究所
副主持
主要成员（不含申请者）
王君伟
2307
教授、博导
东北农业大学（15003001）
部分实验
刘忠贵
2341
教授、博导
东北农业大学（15003001）
技术顾问
刘胜旺
6207
副研究员
哈尔滨兽医研究所
部分实验
贾永清
副教授
东北农业大学（15003001）
部分实验
高雪丽
讲师
东北农业大学（15003001）
部分实验
葛铭
237041x
讲师
东北农业大学（15003001）
部分实验
姜永厚
2301
讲师
东北农业大学（15003001）
部分实验
杨丽萍
2314
高级实验师
东北农业大学（15003001）
部分实验
－1－
研
究
内
容
和
意
义
摘
要
应
用
免
疫
学
和
病
理
学
新
理
论
与
新
技
述
，
通
过
对
AIV
感
染
雏
鸡
血
液
、
免
疫
器
官
、
局
部
粘
膜
免
疫
组
织
的
细
胞
免
疫
、
体
液
免
疫
检
测
及
组
织
病
理
学
、
超
微
病
理
学
、
细
胞
因
子
的
检
查
，
全
面
系
统
地
研
究
AIV
感
染
导
致
鸡
群
严
重
死
亡
的
机
理
及
感
染
鸡
体
全
身
免
疫
、
粘
膜
免
疫
和
细
胞
因
子
免
疫
调
节
的
变
化
，
为
禽
流
感
的
防
制
提
供
科
学
依
据
，
填
补
该
领
域
研
究
的
国
内
外
空
白
。
主题词
1.主题词数量不多于三个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）。
中文
A
型
禽
流
感
病
毒
致
病
机
理
免
疫
机
理
英文
AvianinfluenzavirustypeA/pathogenesismechamism/immunitymechamism
简表填写要求
一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。
简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。
高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。
二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。
三、部分栏目填写要求：
项目名称——应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。
基础研究——指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。
应用基础研究——指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。
申报学科——申请项目所属的最基础学科。
如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。
申请金额——以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。
起止年月——起始时间从申请的次年1月算起。
终止时间为完成年度的12月。
所用实验室——系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。
所在单位名称及代码——按单位公章填写全称。
例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所”。
全称中的数字，一律写中文，例如：
中国航天工业总公司第七○一所。
首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。
参加单位数——指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位），以阿拉伯数字表示。
项目组主要成员——指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。
本栏双线右侧内容不输入计算机。
研究内容和意义——摘要与主题词均录入软盘。
－2－
二、立论依据
（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）
对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；
对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。
流感病毒（influenzavirus）在病毒分类上被列为正粘病毒属（orthomyxovirus），属RNA病毒，可根据核蛋白的抗原特异性划分为A、B、C三型，而在动物中能引起发病者，仅限于A型流感病毒。
禽流感（AvianInfluenza，AI）是由A型禽流感病毒（AvianInfluenzaVirusTypeA）引起的多种禽类和野生鸟类的一种急性、高度致死性传染病。
1878年Perroncito首次报道了意大利鸡群爆发该病，被称为“鸡瘟”（Fowlpest或Fowlplague），也叫真性鸡瘟。
该病被国际兽医局动物流行病组织（OIE）确定为I类烈性传染病。
19世纪末至20世纪初，本病主要发生于欧洲许多国家和地区，故又叫做欧洲鸡瘟。
目前，世界许多养禽国家均有该病发生或流行的报道。
我国自1994年由陈伯伦等首次从广东省发病的鸡群中分离到Hg亚型的A型禽流感病毒以来，四川、宁夏、新疆等地区也分离到该病病毒。
从该病发生的世界历史上看，本病属于一种毁灭性的疾病，每次严重爆发都给养禽业带来重大的经济损失，例如1983—1984年，美国为了扑灭宾州发生的禽流感，曾花费了6000万美元；1997年底，香港政府为扑灭该病，将境内140多万只鸡全部扑灭；巴基斯坦1998年7月以来的半年内，仅禽流感一项损失了90亿巴基斯坦卢比。
目前，低致病力和中等毒力的AI已在我国十几个省或地区发生和流行，且有逐渐扩大的趋势，并潜伏着高致病力AI爆发和流行的可能威胁，禽流感警钟已鸣，亟待防范。
一、禽流感病毒及其生物学特性国内外研究进展
禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus,AIV）属正粘病毒科（othomy-xoviridase）流感病毒属的A型流感病毒，其基因组为单股负链分节段RNA，核衣壳呈螺旋对称，外包囊膜，其上有纤突。
该病毒根据其表面抗原即血凝素（Hemagglutimn,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidare,NA）的抗原特性分为不同的亚型，迄今为止，已发现HA至少有15种，分别以H1—15命名，NA至少有9种，分别以N1-9命名。
其中高致病性禽流感（HighlyPathogenioAvianInfluenza,HPAI）都是由H5和A7亚型引起。
1.禽流感病毒的分子生物学特性
AIV基因组为分节段单股RNA病毒。
该病毒最显著的生物学特性是血清亚型众多，变异频繁，这与本病毒在转录和复制过程中易于发生基因重排有关，AIV抗原性的改变主要由两个方面引起，即抗原漂移（antigenicdrift）和抗原转变（antigenicshift）。
基因组的点突变是造成抗原漂移的分子基础，尤其是HA和NA的点突变导致较小范围的抗原性改
－3－
变；基因组的缺乏、插入或重排导致抗原改变，造成较大范围抗原性的改变，产生新型毒株或其毒株毒力明显改变。
2.禽流感病毒基因组结构及其功能
A型禽流感病毒有8个基因组片段，分别以片段1、片段2…片段8分别编码基质蛋白M1、M2和非结构蛋白NS1、NS2。
该病毒基因组的特点是，其8个基因片段的3’和5’末端具有高度保守性，即核苷酸序列相同。
同时，在5’末端的13个核苷酸序列和3’末端的12个核苷酸序列中有些可反向互补。
遗传学和生物化学实验证实，3’和5’末端保守的核苷酸序列是病毒转录的重要识别部位，其该区域的反向互补序列，与病毒的复制有关。
8个基因片段中，片段1—3分别编码病毒多聚酶PB1、PB2和PA；片段4和6分别编码血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），而且这两个片段的变异比较高，不同的血清亚型其序列差异比较大，既使同一亚型其序列也不尽相同；片段5编码核蛋白（NP），为病毒的核衣壳蛋白，片段7编码基质蛋白M1和M2；片段8编码NS1和NS2两个非结构蛋白。
3.病毒基因编码蛋白的结构与功能
蛋白质是流感病毒粒子的主要组成成分（70%—75%），具有重要的功能，如病毒基因复制所需酶，感染细胞时与受体结合的纤突以及维持病毒形态的基质膜都是由蛋白质组成的。
随着生物技术的不断发展，对蛋白质结构和功能的研究不断深入，目前对流感病毒HA和NA的三维结构研究最多，了解的也最清楚，其受体结合位点及抗原决定簇的结构与位置也已掌握。
这些成绩，要归功于定点突变技术、X线晶体衍射技术和反向基因遗传技术的广泛应用。
现在对大多数禽流感病毒蛋白质的功能已经掌握。
我们确信，随着研究的不断深入与技术手段的不断改进和提高，流感病毒蛋白质的其它功能将会不断确定。
4.A型流感病毒的分子生物学
动物的种类不同，其感染A型流感病毒后临床表现各异，即使来自于不同A型流感病毒分离株的同一亚型，对同一动物的致病性也存在很大差异。
一般来说，哺乳类动物感染A型流感病毒后，病毒主要在呼吸道上皮细胞增殖，故临床表现主要以局部呼吸道症状为主；而禽类感染A型流感病毒后，其临床症状与病毒毒力密切相关，如非致病力毒株或低致病力毒株，病毒只在局部粘膜（如消化道、呼吸道）上皮细胞内增殖，故不表现或只表现轻微的临床症状；如果感染高致病力毒株，病毒常常侵入全身各器官组织，引起严重的临床症状，甚至造成大批死亡。
A型流感病毒感染动物有机体后，首先依赖HA吸附于宿主细胞膜表面的受体上，然后经过蛋白酶的作用，将HA切割为HA1和HA2，从而完成病毒的脱壳过程。
HA对蛋白酶的敏感性与病毒的致病力密切相关，HA对蛋白酶的敏感性越高，其病毒的致病力也越强。
故HA的可切割性是流感病毒毒力强弱的主要决定因素。
Wood等（1993）和Some等（1996）分别研究了H5和H7亚型AIV血凝素裂解位点的氨基酸序列，分析了氨基酸组成与病毒致病力的关系，结果发现高致病力毒株比低致病力毒株，其裂解位点有较多（3-4个）碱性氨基酸插入，所有低致病力的病毒分离株，其裂解位点均无碱性氨基酸。
并且，同为高致病性的H5和H7亚型AIV，其裂解位点的氨基酸序列有也不完全一致。
Veg等研究了H7亚型各病毒分离株和定点诱变的突变株H4裂解位点的氨基酸序列，结果发现蛋白内切酶能识别的最短氨基酸序列为—R—X—K/R—R（X代表任意一种氨基酸）。
Walker等对A/Turky/1378/85（H5N8）及其诱变株HA裂解位点的氨基酸序列研究时发现，在酶切位点附近有糖基化结构存在时，酶切的最大限度（10%）需要5个连续碱性氨
－3—1－
基酸碱基的插入；位于HA1酶切位点上游的脯氨酸（P）其活性非常重要，如被置换，HA的可裂解性下降，病毒活力减弱，HA1末端的精氨酸是蛋白内切酶识别特异氨基酸部位，如该氨基酸发生置换，HA则不能裂解。
Horimoto等对AIV血凝素裂解活性与病毒毒力的相关性研究发现，裂解位点碱性氨基酸的缺失或被非碱性氨基酸置换，可降低病毒毒力和在MDCK细胞上的蚀斑形成能力。
同时还证明具有HA裂解活性的蛋白内切酶能增强AIV感染细胞的能力，提高细胞和动物有机体对AIV的易感性。
另外，一些外源性（如胰蛋白酶、纤维蛋白酶等）的识别精氨酸残基的蛋白内切酶也将HA裂解为HA1和HA2，从而使低致病力AIV的感染性增强，金黄色葡萄球菌也能分泌一种可裂解流感病毒HA的蛋白酶。
小鼠实验证实，当流感病毒与金黄色葡萄球菌混合感染时可导致肺脏大面积病变，提示禽类即使感染低致病力AIV时，如并发其它细菌混合感染，有可能使AIV的致病性增强。
总之，HA基因及其产物是流感病毒致病力的主要决定因素，而NA、M、PA、PB1、PB2、NP以及NS等对维持病毒毒力起一定作用。
5．A型流感病毒对宿主的特异性
自然条件下流感病毒对感染宿主有一定的特异性，依此可将病毒分为不同的群，如人流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒等。
但流感病毒的种属特异性并不十分严格，已发现流感病毒在不同种属动物间可传播，如禽流感病毒H1N1亚型和人流感病毒H3N2亚型毒株均可从猪体分离到；H1N1亚型流感病毒也可感染人。
郭元吉对人甲型流感病毒在我国动物中的分布进行了调查研究，结果从北京的鸡血清中检测到H1N1抗体；从丹东的鸭中检测到Hsw1N1和H1N1以及H2N2抗体；从上海的鸭中分离到H6N4亚型AIV；从广西的鸭中分离出H6N8、H2N3亚型病毒，从野鸟中分离到H10N9、H6N5等11个亚型病毒。
后来又从吉林患呼吸道疾病的马中分离到与AIV相似的H3N8亚型流感病毒；1997年香港禽流感H5N1亚型从感染禽开始，随后波及到人，先后有18人感染发病并致6人死亡，引起全世界恐慌。
Banks等（1998）报道，从一患结膜炎的妇女体内分离到一株与AIV同源性很高的H7N7亚型流感病毒，郭元吉等（1999）从香港人体内首次分离到H9N2亚型AIV。
流感病毒对宿主的特异性受多种因素的影响，每个基因片段的产物都可能起一定的作用。
但HA是宿主特异性的主要决定因素。
目前已知的15个HA亚型都可以从禽类中分离到，以前从人体分离到的主要是H1、H2和H3，最近几年来才从人体内分离到H5、H7和H9流感病毒。
猪体内分离到的主要是H1和H3，马流感病毒常见的是H3和H7亚型。
为什么会出现这种情况，其根本原因还不清楚。
流感病毒的NA对宿主特异性也有一定影响。
目前NA亚型在禽类中都能分离到，但在哺乳动物NA亚型有一定的分布，如人流感和猪流感病毒分为N1和N2，马流感病毒主要为N7和N8。
A型流感病毒的其它产物（如PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、MS1、MS2等）对宿主特异性的决定也起一定的作用。
总之，流感病毒对宿主的特异性是以HA为主的多种基因产物综合作用的结果，是一个十分复杂的尚未明了的问题。
二、禽流感免疫防御研究的现状及存在的问题
禽流感是多种禽类和鸟类的一种I型烈性传染病。
自1878年首次在意大利鸡群中暴发以来，已在美洲、欧洲、亚洲、非洲、澳大利亚、意大利等世界上许多养禽国家和地区发现有该病流行或暴发。
由于AIV血清型众多，变异性极强，即抗原性常常发生漂移和转变，这就为其防制带来很大的困难。
目前对禽流感的预防主要靠疫苗免疫，世界上开发研制的禽流感疫苗主要有灭活全病毒苗、亚单位疫苗、重组活载体疫苗和核酸疫苗等，有些疫苗
在美国和墨西哥AI大暴发后防止疫情扩散和蔓延中发挥了一定的作用。
但高效、安全、实用的禽流感疫苗的研制仍然是世界养禽业关注的焦点。
下面就几种主要禽流感疫苗的优缺点作一简介。
1．灭活全病毒疫苗
灭活全病毒疫苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚增殖的尿囊液，再辅以佐剂而成。
其特点是安全性好，抗原组分齐全，免疫原性较强，不出现毒力返强和变异危险，能够经受同亚型AIV的攻击。
缺点是：
抗原量由注射剂量决定，因此必须注射比活疫苗高出数倍的毒量，另外还需要佐剂，增加了其成本；其次，灭活疫苗必须每个动物免疫接种，需要大量人力，并且禽易产生应激反应，从而造成生产性能降低，同时由于防疫人员的流动和对禽的直接接触，易造成疫病扩散；第三，灭活全病毒疫苗接种动物AI血清学检测呈阳性，不能与自然感染相区别，影响AI疫情监测和防制措施的制定。
我国已研制出针对HPN2亚型的AIV灭活油乳剂疫苗并投入商品化生产，已在许多省（市）推广使用。
2．亚单位疫苗
亚单位疫苗是由提取AIV具有免疫原性的HA蛋白，辅以佐剂而成。
特点是：
安全性好，能刺激机体产生足够的免疫力。
缺点是：
免疫保护持续时间短，且成本高。
3．重组活载体疫苗
重组活载体疫苗是利用对禽类致病性很弱的疫苗病毒或禽痘病毒作载体，构建表达HA的重组病毒，因此重组病毒作为疫苗，它可在动物体内复制并不断表达出HA蛋白，从而诱导禽类产生针对AIV的免疫保护力。
是一种很有发展前途的疫苗。
4．核酸疫苗
核酸疫苗（Nucleicacidvaccine），又称基因疫苗（Genevaccine）或DNA疫苗（DNAvaccine），是利用病原的保护性抗原基因构建真核表达质粒，再将质粒DNA用肌肉注射或基因枪直接导入机体细胞，使外源基因通过机体内源性表达系统表达并提呈给免疫系统，从而诱发产生特异性的免疫应答。
核酸疫苗是近年来新兴的一种疫苗，目前正处于试验研究阶段，因其免疫保护效率低及其他一些尚未克服的困难存在，其实际应用尚需时日。
5．存在的问题
禽流感的预防主要仍赖于疫苗，综合国内外的研究，从目前来看，无论是灭活疫苗还是活疫苗均存在以下几点问题；
首先，AIV的15种HA亚型均可造成禽流感暴发。
虽然历史上造成严重损失的都是H5或H7亚型，但每一次暴发至少15种可能亚型均需考虑，预防免疫须由病原分离和鉴定结果来确定，盲目用苗可能起不到预防免疫的效果。
其次，疫苗的使用，将代替传统的封锁、扑杀、净化、控制和扑灭禽流感，但接踵而来的是没有症状的病禽或感染的禽肉将进入商业贸易，会使地区与地区或国家与国家之间产生禽类贸易的负面影响。
再次，疫苗使用的可能潜在危险。
正如Hinshow等实验报道的那样，疫苗的使用有可能使高致病力变异毒株出现。
在禽类中以鸡和火鸡对禽流感病毒最为易感，其次为珠鸡、野鸡和孔雀；目前已经充分确定全世界在野鸟，尤其是在水禽中存在流感病毒。
感染病毒禽及其尸体是主要传染源，常常通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜传染；吸血昆虫也可传播病毒。
病鸡的卵可带毒，常使出壳后的雏鸡大批死亡，其它年龄鸡感染后发病率和死亡率均很高。
－3—3－
由此可见，禽流感既可水平传播，也可经卵垂直传播。
AIV感染禽体后，可引起呼吸、消化、生殖和神经等多种系统的结构、机能破坏，母鸡产蛋量明显下降、肉鸡生长发育迟缓，该病潜伏期一般3—5天，常突然爆发，流行初期的急性病例，可不出现任何明显症状，鸡只突然死亡，严重时死亡率可高达100%。
综合目前国内外对该病的研究，主要集中在流行病学调查、病原的分离鉴定、特异性诊断、病原的分子生物学以及疫苗的研制等，特别是在病原的分子生物学和疫苗的研制方面做了大量的工作，并取得了一定的成绩。
但对AIV的致病机理和免疫发病机理，迄今未见研究报道，例如，对AI的临床症状和病理学变化只是处于一种简单的描述，尚缺乏深入系统的研究，对其免疫病理学的研究认为，局部IgA可起作用，在感染病毒的恢复中，体液与细胞免疫均起作用，但体液和细胞免疫在AIV感染中到底发挥什么作用、怎么发挥作用均不清楚。
另外，研究最活跃的是细胞毒性T淋巴细胞（CTL），认为CTL在活病毒感染中发挥作用，对灭活的流感病毒CTL无作用，究其机理，目前仍不明了。
根据AI的发病特点（起病急、流行快、死亡率高等）及造成的严重损失，对AIV的致病机理和免疫发病机理进行全面、深入细致的研究是十分必要的。
因此，本项研究以SPF鸡为实验动物，应用病理学和免疫学新理论及新技术，全面、系统、深入地研究A型禽流感的致病机理，免疫发病机理以及细胞因子的相互作用、调
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