湖南农大《基因工程》复习资料.docx

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湖南农大《基因工程》复习资料

第一章

1.名词解释

基因工程：

是指按照人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质

（DNA片段），在体外切割、拼接形成重组DNA，然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入

到没有该DNA的受体细胞，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出新性状，并能稳定地遗传给下一代。

克隆（名词，Clones）：

从同一个亲代细胞形成的一组细胞。

克隆（动词，Cloning）：

形成大量子细胞的无性繁殖过程，这些子细胞和亲代细胞完全相同，这个过程称

为克隆。

基因：

是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。

2.填空题

基因工程的三大要素为供体、受体和载体。

基因工程是年代发展起来的遗传学的一个分支学科。

其主体战略思想是。

根据受体细胞不同，外源基因表达系统可分为表达系统和表达系统。

基因表达过程包括基因的和两个阶段。

3.问答题

什么是基因工程？

其诞生的理论基础是什么？

基因工程研究的主要内容及战略思想是什么？

基因工程的基本内容和过程：

基因工程的主要研究内容或步骤,也称基本过程（简称为六字方针）：

分、切、接、转、筛、表。

（1）从复杂的生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。

（简称“分”）

（2）在体外，用限制性内切核酸酶切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。

（简称“切”）

（3）在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重

组DNA分子。

（简称“接”）（4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞），并与之一起增殖。

（简称“转”）（5）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。

（简称“筛”）

第二章

1.名词解释

电泳：

是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动

的现象。

转染：

转导：

DNA变性：

DNA复性：

EtBr：

分子量marker：

磷酸二酯法：

磷酸三酯法：

转化：

电激转化：

Southern印渍杂交：

分子探针：

聚合酶链式反应（PCR）:

引物；primer；

感受态细菌（competentcell）；

琼脂糖凝胶电泳；

DNA自动测序；

固相亚磷酸三酯法；

Northern印渍杂交；

盖帽反应（cappingreaction）；菌落PCR；

简并引物；

聚丙烯酰胺凝胶电泳；Western印渍杂交。

2.填空题

在进行琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子从电场的极向极泳动。

核酸杂交是与之间的杂交。

Southern吸印（Southernblot）是指针对分子的杂交；Northern吸印是针对分子的杂交。

PCR通过、、延伸三步骤的循环，使特定的DNA区段得到扩增。

DNA化学自动合成反应进行的方向与DNA酶催化合成的反应方向（一致；不同），是从

（5′→3′；3′→5′）。

用冷的CaCl2处理生长期的大肠杆菌细胞，可诱导细胞进入称为态的生理状态进行遗传转化。

根据采用的克隆载体性质不同，将重组DNA分子导人细菌的方法有、及感染。

小量制备的细菌质粒分子经电泳分离后，同一种分子由于构型不同而常产生两条带纹，其中一条为

构型，另一条为OC构型，电泳迁移率前者于后者。

琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，要观察到DNA条带，应加入染色，它可以在光照射下发射荧光。

DNA分子在电场中的迁移距离和DNA分子的构型和有关，与成反比。

LB液体培养基的主要成分包含、和氯化钠。

Northern吸印是探针与分子间的杂交。

Southern吸印是探针与分子间的杂交。

从大肠杆菌中提取pUC18质粒时，需将细菌接种到含抗生素的液体培养基中生长到生长期，再进行质粒的提取。

PCR反应是在聚合酶作用下进行DNA的复制；DNA链的延伸方向是。

以感受态法转化大肠杆菌时，在温度为时吸附DNA，时摄入DNA。

琼脂糖凝胶电泳可以分离Kb—Kb的DNA分子。

PCR复制DNA的方式与生物细胞内DNA复制方式（相同或不同），是以形式进行的。

普通TaqDNA聚合酶具有酶学活性和5′→3′外切酶活性，但没有

酶学活性，因此在PCR反应的产物中将有错误参入核苷酸的DNA分子。

DNA自动测序将法与技术结合起来，使DNA测序摆脱了对大量单链模板的依赖。

3.问答题

简述PCR技术的原理和过程。

简述PCR引物设计时应注意的主要因素。

简述PCR技术的主要应用领域。

Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?

说明双脱氧末端终止法测定DNA一级结构的原理与方法。

琼脂糖凝胶电泳能检测DNA分子的哪些特性，其基本原理与影响因素是什么?

说明下列物质在核酸提取纯化中的作用，并说明从生物材料中分离DNA和RNA的简要方法。

苯酚乙醇异丙醇氯仿异戊醇RNaseDNase

简述乙醇沉淀DNA的原理。

用酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是会停留在水相和酚相之间?

核酸分子杂交探针可分为几类？

切口移位（nicktranslation）标记探针的主要步骤有哪些?

说明Southern吸印杂交的原理和步骤。

第三章

1.名词解释质粒；

选择标记基因；穿梭质粒；

接合型质粒；非接合型质粒；

质粒的不亲和性；复制子；

T载体；载体；pYAC；

烈性噬菌体；温和型噬菌体；ori；

多克隆位点（MCS）；；

cos位点；松弛型质粒；严紧型质粒；

λ替换型载体；λ插入型载体；λgt11；

柯斯质粒；粘粒克隆；BAC载体。

2.填空题

λ噬菌体基因组DNA的长度约为kb,是链。

外源DNA片段离开染色体是不能自主复制的。

将与连接，构建成重组DNA分子，外源DNA则可被复制。

就克隆一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：

、、

选择标记基因。

另外，一个理想的质粒载体必须具有较低分子量。

根据质粒在宿主中的拷贝数，细菌质粒可分为质粒和严紧型质粒。

pUC质粒通过对复制原点进行突变，使其在宿主中的拷贝数大大提高，因此它属于

质粒。

与真核生物所有染色体一样，维持YAC（酵母人工染色体）在酵母细胞中的稳定性，YAC必须具有三个基本

结构要素：

分别是端粒，和。

λ噬菌体DNA可以自然形成环状，其原因是在λ噬菌体的线性分子的两端各有一个长度为个碱基的天然粘性末端，这种粘性末端可以自然成环，成环后的粘性末端就叫做。

Cosmid的复制子来源于，cos序列来源于。

YAC载体的最大克隆片段可达kb，BAC载体的最大克隆片段可达

kb。

通常质粒载体可以克隆Kb的DNA片断；Cosmid可以克隆Kb的DNA片断。

pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于pSF2124质粒。

根据质粒是否携带控制质粒接合转移的基因，可将质粒粒分为质粒和接合型质粒，基因工程所用的主要是质粒。

3.问答题

构建质粒载体的基本原则是什么？

在构建质粒载体种主要做了哪些工作?

构建λ噬菌体载体的主要内容是什么？

粘粒载体具有哪些优缺点?

怎样克服其缺点？

列举质粒载体必须具备的4个基本特性。

说明克隆载体、表达载体的区别。

第四章

1.名词解释

同尾酶；同裂酶；Klenow酶；反转录酶；

限制性核酸内切酶；；

DNA连接酶；粘性末端；平末端；

星活性（staractivity）；限制与修饰现象；

回文序列；碱性磷酸酶；DNA聚合酶I；切口平移；

Taq酶。

2.填空题

限制性核酸内切酶是按来源菌种属名和种性词相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、三两个字母取自，第四个字母则用菌株名的第一个字母表示。

为减少克隆过程中载体分子的自连接，常采用酶对载体进行处理，水解除载体分子两末端的基团。

切口移位（nicktranslation）法标记DNA的基本原理在于利用酶的酶学活性和5′、3′外切酶酶学活性。

EcoRⅤ酶切DNA后，产生具有末端的DNA片段；PstI酶切DNA后，产生具有末

端的DNA片段。

限制性内切酶的切割方式根据其形成末端特点，有三种类型分别是、、在对称

轴处切割产生平末端DNA片段。

3.问答题

什么是细菌的限制—修饰系统，其有何意义？

DNA片断的连接过程中,影响连接反应的因素有哪些？

你了解的基因工程的主要工具酶有哪些，请一一阐述其作用。

说明限制性核酸内切酶的类型及其特性。

限制性核酸内切酶的活性受到哪些因素的影响？

说明DNA连接酶的作用机制及其特点。

说明切口平移法进行DNA标记的原理及步骤。

第五章

1.名词解释转化子；

影印培养；DNA接头；DNA连接子；Tetr；

插入失活；Ampr；Kanr；LacZ′。

2.填空题

研究者感兴趣的外源基因又称，其主要来源途径有：

化学合成，酶促合成cDNA，制备的基因组DNA及技术扩增等。

α-互补进行转化子的蓝白筛选，在培养体系中加入作为基因表达的诱导物，加入作为显色底物。

pBR322质粒上具有Ampr基因和Tetr基因。

若某外源基因插入Ampr基因内，重组质粒具有抗生素抗性表型；某外源基因插入Tetr基因内，重组质粒具有

抗生素抗性表型。

在进行分子克隆时，以质粒为载体构建的重组分子通过方法进入细胞中扩增；而λ噬菌体重组体通过方法进入细胞。

3.问答题

什么是重组子的筛选？

主要有哪些方法？

多种载体中都采用α-互补的方式筛选重组子，简述利用α-互补进行重组子筛选的过程和原理。

什么是α-互补？

怎样利用α-互补进行重组转化细菌的筛选？

简述PUC18/19质粒载体的结构组成，在该载体系统作为蓝白斑方法筛选重组子时，其作用原理是什么？

简述以pUC18为载体进行DNA片断克隆的全过程。

以下是pBR322的结构图，如果利用PstI限制性酶克隆一外源DNA片断，怎样进行这一重组过程？

怎样选择重组的转化菌？

经过PCR扩增获得了某一特定的DNA带，怎样利用T载体将其克隆下来？

某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一个BamHI的切割位点。

现用BamHI切割该载体进行基因克隆，问：

（1）转化后涂布LB平板时应加什么样的抗生素？

（2）培养后长出的菌落有什么样的抗性基因型？

（3）如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体？

如果DNA片断和载体间的粘性末端不能匹配，怎样实现这两种分子的重组连接？

请提出至少两种方法。

进行DNA克隆时，外源DNA片段有哪些主要来源。

如果你完成了一个特殊蛋白的氨基酸序列测定，怎样以其序列为出发点分离其基因。

简述将某一DNA片断定向克隆至pUC19载体中的全过程。

在进行α-互补筛选重组转化菌时，为什么要采用∆M15突变的大肠杆菌作为转化受体菌？

体外连接DNA片断，常用的方法有哪些？

为提高连接效率，可采取哪些措施？

用一限制性内切核酸酶切割Lac+Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突

出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性发挥。

用该酶切割后，用DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac-Tets受体菌，筛选Tetr转化子，问：

转化子具有什么样的Lac基因型?

并说明原因。

第六章

1.名词解释cDNA；

反转录；

高丰度mRNA；低丰度mRNA；基因文库；基因组文库；cDNA文库；随机性片段；

文库筛选（screening）。

2.填空题

构建基因文库时，要使文库具有完整性，文库的大小有N=Ln（1-P）/Ln[1-L/G]，说明文库的大小取决于；和从中分离某一克隆片断的期望概率。

利用λ噬菌体载体构建的genelibrary中，文库是以的形式存在的；用质粒载体构建的genelibrary是以的形式存在的；粘粒载体构建的genelibrary是以的形式存在的。

从基因文库中筛选已知序列基因的常用方法有、和表达文库的免疫学筛选法。

3.问答题

什么是基因组文库?

构建基因组文库时，涉及哪些基本过程?

构建基因文库的目的和意义是什么？

基因文库载体的选择原则是什么？

试述mRNA完整性的确定方法及其对cDNA合成的影响。

合成cDNA第二链的主要策略有哪些?

简述已知序列基因的分离方法。

建树未知序列基因的分离方法。

什么是cDNA文库？

其同基因组文库有何差别？

说明cDNA文库和基因组文库的异同。

构建基因组文库时为什么要制备DNA随机片段？

怎样制备DNA随机片段？

如何从一个文库中筛选出携带目的基因的克隆？

简述其过程。

欲构建水稻花药cDNA文库，简述构建该cDNA文库的基本步骤。

以λgt10构建cDNA文库，包装的噬菌体感染大肠杆菌后形成的噬菌斑既有清亮型斑又有少量浑浊型斑，试

解释其原因。

以λgt11构建cDNA文库，包装的噬菌体感染大肠杆菌后形成蓝色和无色的两种噬斑，试解释其原因。

第七章

1.名词解释

表达载体；

文库筛选（screening）；

Tac启动子；密码子；

SD序列；

染色体步查（Chromosomewalking）；启动子；

35S启动子；T7启动子；密码子；

包涵体；融合蛋白。

2.填空题

根据受体细胞不同，外源基因表达系统可分为表达系统和表达系统。

基因表达过程包括基因的和两个阶段。

Lac启动子受负调控，受的诱导。

3.问答题

要使一外源基因在大肠杆菌中表达出蛋白质产物，要经过哪些基因工程步骤？

在细菌宿主中表达外源蛋白，为何强调对表达基因进行调控？

利用乳糖操作子是怎样对下游基因的表达进行控制的？

什么是融合蛋白？

为什么基因工程发酵生产外源蛋白时常以融合蛋白的形式生产出目标蛋白前体？

真核生物的基因在原核生物（如E．coli）中进行表达，会存在哪些困难？

大肠杆菌表达载体的一般组成是什么？

如何有效的提高外源基因的表达效率？

与原核细胞表达体系相比，真核细胞表达体系的特点是什么？

第八章

1.名词解释Ti质粒；

T-DNA；

转移DNA；

毒性区；Vir区；GUS检测；

三亲交配法；

花粉管通道转化法；共整合载体系统；双元载体系统；

报告基因；转基因植物2.填空题

与T-DNA转移起重要作用的是其两端的各bp的重复序列及位于Ti质粒上编码与T-DNA转移有关蛋白的基因，而与T-DNA上携带的基因关系不大。

植物基因工程中常用的筛选标记基因是。

下列不是农杆菌转化植物的方法有、。

CaMV35S是启动子。

双元载体系统包含载体和载体。

3.问答题

怎样检测转基因植物中外源基因的存在和表达情况？

列举两种方法。

简述利用根癌农杆菌进行植物遗传转化时的主要步骤。

获得转基因植物可以采用哪些方法？

选择其中一种方法详细说明其操作的过程。

进行植物遗传转化主要有哪些常用方法？

你认为哪种方法最为合理？

为什么？

Ti质粒有哪些主要的生物学特点？

这一质粒在基因工程操作中的作用如何？

比较共整合载体系统和双元载体系统的优缺点。

影响外源基因在受体植物中表达的因素有哪些？

植物基因工程发展到今天，你认为目前制约其进一步发展的瓶颈是什么？

当前植物基因工程研究的前沿领域有哪些？

第九章

1.名词解释

动物生物反应器；转基因动物；

胚胎干细胞。

2.问答题

说明通过胚胎干细胞获得转基因动物的基本过程。

简述动物转基因操作的基本过程。

鉴定转基因动物有哪些方法？

基因导入动物细胞的方法有哪些？

试说明各种方法的利弊。

第十章

1.问答题

你认为转基因生物会带来哪些潜在的危险性？

如何对转基因生物进行安全性管理？