国家大学生创新性实验计划项目申报表.docx
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国家大学生创新性实验计划项目申报表
国家大学生创新性实验计划项目申报表
项目名称：
人甲状旁腺激素（1-34）二联体与人血清
白蛋白融合蛋白的制备
项目负责（申请）人姓名：
宋佳欢
所在学院：
医药学院
项目所属一级学科：
药学
班级：
护理0701
学号：
26
联系电话：
电子信箱：
江南大学教务处制
项目名称
人甲状旁腺激素（1-34）二联体与人血清白蛋白融合蛋白的制备
项目类型
（）个人项目（√）团队项目
项目实施时间
起始时间：
2008年11月完成时间：
2009年12月
申请人或申请团队
姓名
学院
专业、班级
手机
负责人
宋佳欢
医药学院
护理0701
成员
李文静
医药学院
护理0703
李敏
医药学院
护理0701
叶秀利
医药学院
护理0703
指导教师
姓名
邬敏辰
年龄
46
学院
医药学院
专业技术职务
教授
手机
E-mail
主要成果
邬敏辰，男，2001年毕业于复旦大学生物化学与分子生物学专业，获博士学位。
现主要从事生物化学、基因工程、蛋白质工程的教学和研究工作。
曾主持或参与完成了国家级、省级和企业委托项目30余项，通过科技成果鉴定7项，获科技成果进步奖8项，获多媒体教学成果奖1项，授权和申请专利3项，发表研究论文180余篇，参编和主编著作5部。
其中：
参与完成了国家“八五”和“九五”重点科技攻关项目《碱性脂肪酶中试》和《洗涤剂配套酶制剂—碱性脂肪酶》，1996年获中国轻工业科学技术进步奖三等奖；主持完成了《木聚糖酶基因的克隆、改造及产业化生产》等项目，2006-08年分别获珠海市科学技术奖二等奖（排名第一）、中石化工业协会科技进步奖二等奖2项（排名第一）、无锡市科学技术奖二等奖（排名第一），2007年申请专利2项（排名第一）。
现主持国家自然科学基金资助项目《碱性脂肪酶热稳定性的生物信息学分析及定点突变》。
2002年起，指导本科生、硕士生50余名，协助指导博士生5名。
一、项目简介（研究内容、目的意义、具体目标等）
[目的意义]
以骨吸收和骨形成失衡导致的骨质疏松症是老年人常见的慢性病，所以抑制骨吸收和促进骨形成可有效防治骨质疏松症。
目前抑制骨吸收的药物主要有雌激素和双磷酸盐等，它们可抑制破骨细胞的活性、减少骨钙流失、延缓骨吸收速度，但不能使已遭破坏的骨小梁重建，无法改善骨的强度。
1996年全球骨质疏松症会议认为将来最好的骨质疏松症治疗药物应当是能促进骨形成且无副作用的药物，重组人甲状旁腺激素（rhPTH）药物治疗骨质疏松症的效果已得到肯定。
小剂量、间歇给予PTH不仅能刺激成骨细胞活性、促进骨形成，还能增加骨密度和机械应力；PTH对重度骨质疏松症、已发生骨折和高危骨折患者的治疗尤其有利。
据世界卫生组织的统计，目前全球骨质疏松症患者总数已超过2亿人，其中60%左右的骨质疏松症患者分布在发展中国家和亚洲国家。
依据中国国家统计局公布的人口抽样调查数据以及60岁以上老年人口增长数据，中国老年学学会骨质疏松学会预测国内骨质疏松症患者总数约为：
2006年9000万人；2010年11400万人；2050年将激增至2亿多人。
如果以每位骨质疏松症患者需5000元人民币/年的药费计算，目前国内治疗骨质疏松症药物的市场容量约为5000亿元人民币/年，按其中1%的患者使用rhPTH药物，其销售额将达到50亿元人民币/年[1]。
2002年11月，美国FDA批准了Lilly公司生产的PTH类似物—特立帕肽rhPTH1-34（Teriparatide,重组人PTHN末端1~34个氨基酸）产品上市，商品名为Forteo，用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症和原发性骨质疏松症[2]。
2003年11月，NPSPharmaceuticals公司结束了rhPTH1-84的III期临床研究，2004年底向美国FDA提出新药申请的同时，2005年在欧洲提出新药申请；2006年3月FDA向NPSPharmaceuticals公司发出该药物可以被批准的意见书，同年4月欧盟批准该药物上市，用于治疗妇女绝经后的骨质疏松症[1]。
在国内，重庆科润生物医药研发有限公司开发的一种治疗用生物制品I类新药—rhPTH1-84冻干粉针剂，在完成了临床前研究工作的基础上，于2007年5月获得临床研究批件（2007L1219）。
华东理工大学目前已完成了rhPTH1-84的制备、药效学研究、新药安全性评价、质量标准、原液和成品质检项目等。
在临床研究和使用过程中，rhPTH1-34或rhPTH1-84均存在着稳定性差、溶解度低、体内半衰期短以及由于分子量小易被肾小球滤过而导致的药物利用率低等问题。
为了明显提高骨质疏松症患者的骨密度，临床上每天需要皮下注射20-40grhPTH1-34或50-100grhPTH1-84[3]。
在美国及欧洲，通常一个甲状旁腺
激素治疗疗程为18-24个月。
这种治疗费用高、毒副作用严重以及患者频繁注射的痛苦等问题是限制治疗的主要因素[4]。
因此，寻找更稳定的PTH类似物以延长其有效作用时间，从而减少注射次数（如改每日注射为隔日或每周注射）但保留其促进骨质合成的生物活性，是当今PTH用于治疗骨质疏松症的发展方向[5]。
长效蛋白药物的研发已成为对第一代基因工程产品进行二次开发的一个重要方向，常用的技术有：
制备缓释制剂、构建突变体、化学修饰以及构建融合蛋白等，其中以构建融合蛋白技术最为突出[6]。
依据使用目的不同，常用的融合蛋白载体有人血清白蛋白（HSA）、抗体IgG重链Fc段、6HisTag、β-半乳糖苷酶、trpE和谷胱甘肽S-转移酶（GST）等，其中以HSA作为载体构建融合蛋白最具明显的优点[7]。
本研究拟以HSA为载体，将PTH1-34基因串联后进行定点突变，再与人血清白蛋白（HSA）基因融合，并在毕赤酵母GS115中进行高效表达。
[研究内容]
1）人甲状旁腺激素（PTH1-34）和人血清白蛋白（HSA）基因的克隆、测序和序列分析等。
2）人甲状旁腺激素（PTH1-34）二联体基因的构建及定点突变。
3）人甲状旁腺激素（PTH1-34）二联体基因突变体与人血清白蛋白（HSA）基因的融合；融合基因在毕赤酵母GS115中的表达。
本研究可提高融合蛋白药物的药效活性；提高目的基因在毕赤酵母中的稳定性和表达量；为小分子生物活性肽的制备提供参考。
[具体目标]
撰写项目总结报告，申请技术发明专利1项，在SCI或CSCD期刊上发表论文1-2篇，参编著作1部（邬敏辰主编）。
参考文献
[1]重组人甲状旁腺素（PTH1-84）生物制品Ⅰ类新药.（2008-3-4发布）
[2]张颖，彭永德.世界临床药物,2004,25（12）:
725-729
[3]FinkelsteinJS,etal.NEnglJMed,2003,349:
1216-1226
[4]GirotraM,etal.RevEndocrMetabDisord.2006,7:
113-121
[5]KostenuikPJ,etal.JBoneMinerMeab.2007,22（10）:
1534-1547
[6]戚南，马清钧.中国生物工程杂志,2006,26
（2）:
79-82
[7]LucasLH,etal.JAmChemSoc,2004,126（43）:
14258-14266
二、研究技术路线及可行性
[技术线路]
人PTH1-34基因的克隆
hPTH1-34二联体基因的构建
hPTH1-34二联体基因的突变人HSA基因的克隆
hPTH1-34二联体-HSA融合基因的构建
融合基因在毕氏酵母中的表达
[可行性分析]
1）项目在立论上借鉴了国内外生命科学的最新成果和进展，具有可靠的理论依据。
在研究方法上，从基因和蛋白表达两方面采用成熟的技术路线和研究手段。
在酵母表达体系以及蛋白质分离纯化技术方面已有良好工作基础。
项目注重多学科的交叉和互补，并吸收了许多在相关领域有创新学术思想和重要研究成果。
2）课题组的指导老师近几年主要参与了国家攻关计划、国家自然科学基金、部省级科研计划等多项科技计划。
在白蛋白重组共表达方面有着丰富的经验，这将为本项目的实施提供有利的保障。
三、项目特色与创新性
多年来有关人甲状旁腺激素、融合蛋白、毕赤酵母表达系统、药效学、药代动力学等的研究都取得了突飞猛进的发展，但对PTH长效药物的研究还有很多工作要做。
本项目的实施具有以下特色与创新性：
1）首次设计和构建人甲状旁腺激素（PTH1-34）二联体基因；
2）首次对人甲状旁腺激素（PTH1-34）二联体基因进行定点突变；
3）首次将人甲状旁腺激素（PTH1-34）二联体基因突变体与人血清白蛋白（HSA）基因进行融合；
4）首次将融合基因在毕赤酵母GS115中的表达。
四、项目进度安排
08.11-09.01：
查阅文献，实验方案设计；人甲状旁腺激素（PTH1-34）和人血清白蛋白（HSA）基因的克隆、测序和序列分析等。
09.03-09.06：
人甲状旁腺激素（PTH1-34）二联体基因的构建及定点突变。
09.07-09.10：
人甲状旁腺激素（PTH1-34）二联体基因突变体与人血清白蛋白（HSA）基因的融合；融合基因在毕赤酵母GS115中的表达。
09.11-09.12：
撰写总结报告、科研论文，申请发明专利等。
五、预期成果
课题组4名本科学生（2年级）在医药学院邬敏辰教授（博士）、吴静副教授（博士）和徐静娟讲师（硕士）的直接指导下进行本项目的研究。
通过项目的实施，调动学生学习的主动性、积极性和创造性；激发学生的创新思维和创新意识；培养学生发现问题、思考问题和解决问题的能力。
同时在项目实践中逐步掌握分子生物学、基因工程、药学等学科的基本理论与技术，实现多学科交叉的科研创新。
项目预期成果为：
申请技术发明专利1-2项，在SCI或CSCD期刊上发表论文1-2篇，参编著作1部（邬敏辰主编）。
六、经费预算
序号
支出科目
金额（单位：
元）
1
材料试剂费
10000
2
测试化验费
3000
3
论文版面费
2000
4
申请专利费
4000
5
差旅费
1000
合计
20000
七、导师推荐意见
宋佳欢等4名本科学生自2007年9月入学以来，一直在本人的指导下学习生物化学与分子生物学的基础理论与实验方法。
一年多来，已较熟练地掌握了生物化学与分子生物学的操作流程与技术，如PCR技术、基因克隆技术、基因和蛋白质序列分析方法和蛋白质表达技术等，初步了解了研究方案及技术路线的设计。
我深信，通过本项目的实施，能更好地调动学生学习的主动性、积极性和创造性；激发学生对科学研究或创造发明的浓厚兴趣；培养学生发现问题、思考问题和解决问题的能力。
同时在项目实践中更好地掌握分子生物学、基因工程、药学等学科的基本理论与技术，实现多学科交叉的科研创新。
宋佳欢等学生发表的研究论文：
[1]ZhangShu-Fei,SongJia-Huan,WuMin-Chen,etal.MutationbreedingofAspergillusnigerstrainLW-1forhigh-yield-mannanaseproduction[J].ChineseJournalofAgriculturalBiotechnology.2008,5
（2）:
153-158
[2]孙军亭,李文静,邬敏辰.S179C突变提高宇佐美曲霉木聚糖酶（XynII）热稳定性的研究.2008,34（7）:
55-58
签名：
邬敏辰
2008年10月22日
八、学院推荐意见
同意推荐
学院负责人签名：
李秋萍学院盖章：
2008年10月23日
九、评审专家意见
专家组长签名：
年月日
十、学校意见：
学校负责人签名：
学校公章
年月日
仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。
Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;notforcommercialuse.
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