湖州师范学院 基因工程复习提纲.docx

湖州师范学院 基因工程复习提纲.docx

《湖州师范学院 基因工程复习提纲.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《湖州师范学院 基因工程复习提纲.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

湖州师范学院基因工程复习提纲

基因工程复习重点

一、载体PTXBⅠ

Ori原核生物复制起点

T7promotorT7启动子是最强的启动子，指导转录起始。

Lacopterator乳糖操纵基因，可被LacI编码的阻遏蛋白结合抑制转录。

SD原核生物翻译起始时核糖体的识别序列位于mRNA上

MCS多克隆位点可插入外源基因，不影响其复制。

内含多个酶切位点、如图。

Intein内含肽

CBDchitinbindingdomain（几丁质结合位点）可与Tag（亲和标记）结合

Stopcode终止密码子

Amp氨苄抗性基因可用作抗性筛选的重要标记

LacI乳糖调控基因编码阻遏蛋白

二、质粒提取原理：

答：

三种溶液：

溶液1：

50mmol/l葡萄糖---维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；

25mmol/lTri·Cl（pH8.0）---维持pH;

10mmol/lEDTA（pH8.0）------螯合Ca2+,DNase失活，保护DNA

溶液2：

0.2mol/NaOH----------核酸变性（pH>12或pH<3）（解链）

1%SDS-----------------蛋白变性，裂解细胞。

溶液3：

7.5mol/LNH4AC（pH7.6）-------沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。

其它溶液：

（1）2MNH4AC------------------------------沉淀蛋白，溶解核酸；

（2）异丙醇-----------------------------沉淀质粒

（3）70％乙醇----------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。

（4）RNase--------------------------------除去细菌RNA

过程及作用：

（1）1.5ml菌液，12000rpm*1min,弃上清（repeat）－－收集细菌

（2）溶液1（200ul）,剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液

（3）溶液2（400ul），温柔混匀，冰中5min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性

（4）溶液3（300ul）,温柔混匀，冰中10min;－－－－－－－质粒复性

（5）13000rpm*5min,取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA

（6）540ul异丙醇，室温10min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒

（7）14000rpm*10min,弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质

（8）100ul2MNH4AC

（9）13000rpm*5min,取上清；

（10）100ul异丙醇，室温10min;

（11）14000rpm*10min,弃上清；

（12）70%乙醇500ul,14000rpm*10min,弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分

（13）烘干10-30min,－－－－－－－－－－－－－－－－－除去乙醇

（14）50ulddH2O（含0.1mg/mlRNase）,37°C*30min.－－－－除去细菌RNA

（15）电泳鉴定

三、连接反应

答：

1、总体积为10ul；

2、16℃连接过夜；（为什么是16℃？

答：

连接反应包括两步一是将碱基50%连接（变性）：

Tm=2（A+T）+4（G+C），一般在8℃左右。

二是将连接末端、DNA连接酶最适温度在37℃左右。

综上，要两个同时很好的进行，就将温度调到16℃左右。

）

3、基因mol/载体mol≈10;【平端≈15】

四、重组克隆的筛选，各方法的优缺点。

答：

1、抗性筛选；

原理：

利用载体上具有的抗性基因，进行筛选。

优点：

可确定有无载体转入。

缺点：

不能保证外源基因插入，空载体不能被检测出来。

2、蓝白斑筛选；

原理：

LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。

（需要IPTG诱导表达）－－蓝斑；外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行α互补－－白斑。

优点：

未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选

缺点：

无法确定基因插入的方向；基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分LacZ失活，将产生α互补，产生蓝斑。

3、酶切电泳筛选（*）；

原理：

选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断的大小。

优点：

可鉴定外源基因的重组和插入方向。

缺点：

结果可靠但操作比较麻烦；无法检测基因内部的突变。

4、PCR筛选；

原理：

通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒

优点：

可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量检测重组子。

缺点：

不能检测基因插入方向；不能检测基因内部突变。

5、测序验证；

原理：

选取阳性克隆，送公司测序；

优点：

最可靠的检测方法。

可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。

缺点：

价格贵，适于1～2个克隆的验证。

6、表达筛选；

SDS-PAGE

原理：

小量诱导表达；全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳；重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。

（需加不诱导的对照）

优点：

可检测外源基因的表达。

（一般基因的插入，方向，读框都正确）

缺点：

无法筛选不能有效表达的重组质粒。

亲和筛选：

原理：

50ml菌液诱导表达，超声破菌，用少量亲和beads吸附上清；

SDS-PAGE检测，在特点位点将出现一条蛋白带。

优点：

适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测；比SDS-PAGE筛选更灵敏（富集），可靠；

缺点：

比较麻烦。

免疫筛选：

原理：

利用抗体检测目标蛋白。

做western-blot或ELISA。

优点：

western-blot能准确检测出是否表达。

缺点：

需要有抗体。

ELISA实验可能会受到交叉反应的干扰

7、生物活性筛选。

酶：

测定酶活；

亲和蛋白：

与亲和底物作用。

其它的生物活性。

五、有哪些克隆策略？

各有什么优缺点？

答：

1、平端克隆；机械打断，化学合成，EcoRV酶切，或其它酶切位点末端改造（klenow

酶补平，S1处理）产生平端；

特点：

克隆效率较低，ligase要加大量；载体需脱磷；方向可正可反。

2、粘端克隆

（1）TA克隆：

普通Taq酶扩增的PCR产物3‘末端会多加一个A;

公司提供的T-vector的5’末端有一个粘性的T;故不需要酶切。

用途①PCR产物快速克隆：

②基因测序（可正可反）；

③利用T-vector上的MCS,为下一步克隆调整酶切位点

（2）单酶切不定向克隆：

载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）；

基因插入可正可反，需要筛选。

但当考虑各种因素时，有的时候不得不用。

（3）双酶切定向克隆①粘-粘连接：

最有效、最快捷

②粘-平连接：

适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平。

特点:

①基因和载体都用两种酶切割；

②连接效率高；

③外源基因插入方向固定，不用鉴定。

注意点：

①两个同尾酶切出的末端一样，相当于单酶切不定向克隆；

②载体MCS中的两个酶切位点要远一点，防止一端没切透；

（可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备）

六、PCR引物设计和程序设计

答：

引物设计：

原则：

1.长度：

15～37nt,一般20nt左右;（仅binding,不含接头）

2.G+C含量40％～60％

3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；

4.引物自身不能互补（<3个）

5.引物之间不能互补（<5 个）

6.引物３端不能错配,不能修饰，尽量不用A,不能超过３个连续的G或C；

7.5’端可变化修饰，附加酶切位点；

8.两引物的Tm值应比较接近；

9.正链引物：

mRNA序列照抄；

负链引物：

先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。

10.解链温度Tm=4（G+C）+2（A+T）[=<20nt]

　　　　　Tm=81.5+0.41*（GC%）-600/L[>20nt]

Tm一般55℃～80℃　［55℃～58℃最佳］

PCR反应中结合温度（anneaningtemperature）T=Tm-5℃

特殊用途引物设计技巧

1.5’附加酶切位点（定向克隆）:

保护碱基（提高酶切效率）

2.引入点突变：

一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.突变位点要靠近5’端

注意密码子的偏好性和简并性。

3.有不确定序列：

当被扩增序列未知时，可根据其同种、或种间已知序列来设计引物。

4.PCR产物直接测序

程序设计：

94℃＜5min真核加帽，使其他杂蛋白变性。

30~32循环

94℃＜＝30ｓ，解链温度

50℃30ｓ，退火温度=Tm-5

72℃　2min（1min/kb）

72℃10min反应到最后Taq酶活性有所下降，为使不完整的双链反应完全成完整双链。

七、琼脂糖凝胶电泳原理、操作要点、用途。

原理：

1.DNA电泳迁移：

电荷效应＋分子筛效益

（1）DNA带负电，电场中，向正极移动；

（2）决定移动速度三因素：

DNA大小，电荷数，构型；

（3）线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比；（分子量越大，跑得越慢）

2、检测原理：

溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。

操作要点：

1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样

（1）低:

不利于小片段的分辨（扩散）

（2）高:

不利于大片段的分辨（迁移不动）

（3）一般选1.0%

2.凝胶要用缓冲液配（TBE或TAE）

3.EB强致癌，带手套操作；

4.agarose（琼脂糖）－－－电泳

agar（含琼脂糖和琼脂胶）－－－平板培养基

用途：

1.DNA分子量测定（距离－>分子量）

2.基因，克隆的鉴定（通过1完成）

3、不同长度的基因片断的分离

4、DNA浓度的测定（荧光的强度与DNA含量成正比）。

也可用于蛋白的分离鉴定

八：

SDS-PAGE原理、技术要点、用途。

原理：

1.SDS（带负电）和还原剂破坏蛋白的高级结构,同时SDS与蛋白定量结合,消除蛋白之间

的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量（分子小跑得快）.

2.不连续电泳:

上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线,下层为分离胶;可获得更高的分辨率.

3.考马斯亮蓝进行染色.

技术要点：

1.浓缩胶一般用5%,

分离胶：

次高分子（10万-20万）用7%，低分子（1.4万－10万）用12％

2、PAGE配制时带手套，（Acr-Bis液体有积累性神经毒，聚合后无毒）

3.SDS－PAGE测定的是单体蛋白分子量；（多亚基不行）

4、SDS－PAGE不适于：

（1）电荷异常蛋白：

组蛋白（＋电多）、

（2）构象异常的蛋白

（3）带有较大辅基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。

用途：

1.蛋白分子量的测定2.蛋白浓度的测定3.蛋白的鉴定（通过分子量的测定来实现）

九、双脱氧法测序（末端终止法）用于单链测序原理

原理：

合成DNA时在反应物中加入一定量的2’,3’ddTTP时，因ddT的3`碳原子不含－OH,故

DNA不能延伸。

不是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。

测定的序列靠近引物（起点）20~30bp不准，500bp后的序列也不准。

（？

）

十、基因工程工具酶。

1、限制性内切酶：

基因工程中主要用到Ⅱ型核酸内切酶

其特征：

Ⅰ、每一种酶都有各自特异的识别序列。

（1）序列不同

（2）长度不同：

4－7bp

（3）但与DNA来源无关

Ⅱ、识别序列一般具有回文结构。

Ⅲ、切割后,产物的特点

（1）5’－pi，3’—OH

（2）平端。

粘端－－都是5’突出或都是3’突出

（3）粘端可重新通过氢键配对

Ⅳ、特殊性质①同位酶：

识别相同序列，但切割位点不一样的酶（如SmaI和XmaI）

②同尾酶:

识别位点不同，但切割出相同的末端序列（BamHI和BclI）；

③同裂酶：

识别位点和切割位点都相同的酶（HpaI和HincⅡ）；

④甲基化的调节：

MspI（所有）和HpaⅡ（非甲基化）

⑤Star活性（星号活性）：

在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。

在酶的名称右上角加一个星号（*）表示,如EcoRⅠ*。

6位置效应：

酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同（侧翼序列太短无法切）

2、DNA连接酶：

能催化DNA中相邻的3`-OH和5`-P之间形成磷酸二脂键。

（1）能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口

（2）能封闭粘性末端退火后出现的缺口；

用途：

（1）通过粘端连接DNA分子；

（2）连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。

3、DNA聚合酶：

（1）Taq酶：

耐热DNA聚合酶:

94℃能较长时间保持活性,最适温度72℃;

方向:

5’→3’；底物:

模板+引物+dNTP（还需Mg2+）；反应速度:

1kb/min

不同种类的Taq酶功能不同。

用途:

PCR、sequence、TAclone

（2）Klenow酶：

DNA聚合酶Ⅰ的C-端大片段（被枯草杆菌蛋白酶切割）；MW＝76kD；

5`→3`聚合酶活性（合成）；3`→5`外切酶活性（矫正）

用途:

DNA探针的标记；平端化:

补平3’凹端或切除3’凸端。

（3）反转录酶：

有两种：

AMV（来源于鸟类肿瘤病毒）--------42℃反应

M.MLV（来源于鼠白血病毒）-------37℃反应

主要特点：

①RNA→DNA

②DNA→DNA

③外切RNA

④不具有纠错功能

用途：

mRNA转录成cDNA；以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针

（4）末端转移酶：

取自小牛胸腺

催化脱氧核苷酸与DNA的3`-OH结合

引物或底物是带有3`-OH基的ssDNA或带有突出的双链DNA。

不要求模板。

两种反应：

Mn2+或Mg2+

ssDNAOH+ndNTPDNA-（pdN）n+nppi

Co2+

dsDNAOH+ndNTPDNA-（pdN）n+nppi

用途：

加一个同源多聚物，便于未知序列的操作。

4、修饰酶：

Ⅰ、T4多核苷酸激酶

作用原理：

催化ATP的γ－Pi转移到DNA或RNA的5’-OH,使之磷酸化。

用途：

放射性标记DNA链的5‘末端，探针标记

注意：

（1）铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。

（2）低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。

（3）该酶很难纯化,酶制品经常不纯。

Ⅱ、碱性磷酸化酶

作用原理：

切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5‘磷酸基团,变成5’OH。

来源：

（1）细菌碱性磷酸酶（BAP）：

BAP活性更高,对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后

很难完全抑制BAP活性。

（2）牛小肠碱性磷酸酶（CIP）：

除去CIP可用蛋白酶K降解

用途：

（1）从DNA片段上除去5‘磷酸以防自身连接。

（2）在放射性标记DNA5‘末端前，除去磷酸。

Ⅲ、核酸酶

（1）核酸酶Bal31

（2）核酸外切酶Ⅲ

（3）单链核酸酶S1：

是单链（ssDNA,ssRNA）特异性核酸酶。

产物5‘－pi；

pH4.5，Zn2+

用途：

（1）分析RNA·DNA杂合结构（内含子）；

（2）除去DNA的单链末端，生成平端；

（3）切断双链DNA的发夹结构。

Ⅳ、DNA甲基化化酶：

保护不受切割；帮助切割（Dpn1）

注意区两种分平端化酶：

S1酶和Klenow酶。

十一、BH5α菌株（克隆菌株、受体菌）和BL21（DE3）菌株（表达菌株）？

答：

BH5α菌株一种用于铺制与培养质粒平板的重组缺陷的抑制型菌株，其基因产物可与

pUC载体编码的β--半乳糖苷酶氨基α端实现互补。

BL21（DE3）菌株：

该基因用于高效表达克隆于含有T7噬菌体启动子的表达载体的基因，

T7噬菌体RNA聚合酶位于噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

T7启动子只与T7RNA聚合酶作用进行转录。

因此，没有T7RNA聚合酶BH5α菌株不能作为表达菌株。

十二、质粒的作为载体基本要求，质粒的不亲和性，质粒功能分类。

答：

要求：

1.复制原点－－能自主复制,宿主专一性；

2.选择标记－－便于筛选，；

3.多克隆位点－－插入外源基因，不影响本身的复制；

质粒功能分类：

1、克隆载体（PUC）

2、表达载体（pET,pGEX,pTXB1等）

3、特殊用途载体：

（1）体外转录ssRNA载体

（2）表达ssDNA载体

质粒的不亲和性：

（1）质粒具有不相容性,即在没有选择压力的条件下,两种不同的质粒

不能稳定地共存于同一细胞.

（2）宿主细胞内.相互不相容的质粒属于同一个不相容群;而属于不同的不相容群的质粒

可稳定地共存于同一宿主细胞中。

原因:

竞争相同的转录,复制因子.

十三、融合蛋白的功能，为什么要进行融合表达？

答：

功能：

1、提高外源基因的表达量

2、帮助外源基因正确折叠（可溶）

3、提供亲和标记，方便纯化；

4、提供亲和标记的还可作为检测靶点，方便检测。

N端融合：

比较有利于基因产物的表达和正确折叠，防止出现表达量太少或形成包涵体。

C端融合：

（1）表达情况一般不如N端融合

（2）要克隆基因的下游引物不能含有stopcode.

N，C端都融合，方便纯化和进行功能实验。

十四、常用融合蛋白表达的载体及常用系列的标记。

答:

PGEX系列：

N端融合GST蛋白，用GST柱亲和纯化；谷胱甘肽洗脱，用Xa因子酶切

除去亲和Taq。

PTXB（pTYB）系列：

N端（或C端）融合CBD蛋白，用chitin柱亲和纯化；

DTT诱导柱上切割纯化。

pET系列：

融合6hisTaq,用镍柱亲和纯化，用Xa因子酶切除去亲和Taq。

咪唑。

十五、蛋白表达过程中如何防止产生包涵体？

答：

（1）使用融合蛋白，帮助正确折叠；

（2）使用辅助质粒，产生分子伴侣，帮助正确折叠

（3）降低温度，缓慢表达，帮助正确折叠；

（4）减少诱导剂的量，缓慢表达，帮助正确折叠；

（5）使用不同的培养基和金属添加剂。

（6）使用低拷贝的质粒

十六、名词了解：

GenBank：

NCBI美国国立生物技术信息中心中的一个数据库

NCBI：

美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）所属的

一个研究所的计算生物学研究室，包括GenBank、UniGene、dbSNP、COG、LoccusLink等

BLAST：

“局部相似性基本查询工具”（BasicLocalAlignmentSearchTool）的缩写，Blast是NCBI

研制的一个生物基因数据库系统的查询工具，功能强大，检索速度快，流行于世界上几乎所有的

生物信息中心。

功能名称

功能

Blastn

用核酸序列搜索核酸序列数据库

Blastp

用蛋白质序列搜索蛋白质序列数据库

Blastx

用核酸序列（翻译成蛋白质）搜索蛋白质序列数据库

十六、设计题：

1、克隆引物的设计期中那个上交的作业看看、原理知道就好了、

2、基因表达设计：

注意原核真核系统表达的优缺点、蛋白表达的常见问题、以下流程图。

实验流程：