发酵法生产长链不饱和脂肪酸关键技术研究.docx
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发酵法生产长链不饱和脂肪酸关键技术研究
科技成果
鉴定材料
发酵法生产长链不饱和脂肪酸关键技术研究
技
术
资
料
汇
编
鉴定资料目录
一、鉴定大纲……………………………………………………1
二、研究工作报告………………………………………………2
三、技术研究报告………………………………………………3
四、经济效益分析报告…………………………………………26
五、检验报告书…………………………………………………28
六、应用证明……………………………………………………29
鉴定大纲
一、定本大纲的依据
“发酵法生产长链不饱和脂肪酸关键技术研究”是由湖北工业大学和湖北世力达生物科技有限公司共同完成的科研项目。
经项目组全体成员的共同努力，已圆满完成了各项研究任务，并实现了产品的生产，具备鉴定条件，特拟订本鉴定大纲。
二、结题的目的和内容
（一）、审查本项目组提供的鉴定技术资料是否齐全、规范；
（二）、审查该项目研究达到的水平；
（三）、审查所研制样品的质量；
（四）、审查该项技术的推广应用价值和前景；
三、鉴定形式、方法
申请由湖北省科技厅组织鉴定，邀请有关单位的专家组成鉴定委员会，鉴定委员会委员审阅课题组的技术资料。
在此基础上鉴定委员会委员对该研究作出综合评价和结论，写出鉴定意见。
四、鉴定技术资料
1、鉴定大纲
2、研究工作报告
3、研究技术报告
4、经济效益分析报告
5、检验报告书
6、应用证明
研究工作报告
“发酵法生产长链不饱和脂肪酸关键技术研究”是由湖北工业大学和湖北世力达生物科技有限公司共同完成的科研项目。
经项目组全体成员的共同努力，已圆满完成了各项研究任务，并实现了产品的生产。
一、准备试验阶段（2008.1~2008.2）
（一）、查阅了国内外大量有关文献资料
（二）、对长链不饱和脂肪酸的研究现状及前景进行了调研
（三）、准备研究所需的药品及仪器设备
二、试验阶段（2008.2~2009.2）
（一）、完成了出发菌株假丝酵母和啤酒酵母的理化诱变及原生质体融合；
（二）、原生质体融合后的假丝酵母发酵产长链多不饱和脂肪酸的发酵条件研究；
（三）、原生质体融合后的假丝酵母发酵产长链多不饱和脂肪酸的发酵培养基优化；
（四）、长链多不饱和脂肪酸的提取和分离纯化；
三、产品试制和生产阶段（2009.2~2009.5）
（一）、完成了长链多不饱和脂肪酸的发酵工艺放大；
（二）、完成了长链多不饱和脂肪酸的的工业化试生产。
四、研究结果
解决了产业化生产长链多不饱和脂肪酸发酵的关键技术，实现了产品的生产。
将生产的产品送到农业部食品监督检验测试中心（武汉）检测，其不饱和脂肪酸的含量为%，产品分散均匀，稳定性好。
五、鉴定准备工作（2009.6~2009.7）
1、完成本鉴定所需全部技术资料的撰写、打印工作。
2、将样品送有关部门检测。
3、向省科技厅递交“科学技术成果鉴定申请书”。
研究技术报告
一、研究的目的、意义及国内外概况
多不饱和脂肪酸（Polyunsaturatedfattyacid，PUFAs）又叫多烯酸,是指含有两个或者两个以上非共轭顺式双键,碳链长度为16—22个碳原子的直链脂肪酸,双键愈多,不饱和程度愈高。
主要包括n-3和n-6两大类。
N-3脂肪酸有：
α-亚麻酸（α-linolenicacid，AIA）、二十二碳六烯酸（docosahexanenoicacid，DHA）和二十碳五烯酸（eieosapentaenoieacid，EPA）。
n-6脂肪酸有：
亚油酸（1inoleieacid，LA）、γ-亚麻酸（γ-linolenicacid，GLA）、二高亚麻酸（dihonolinolenicacid，DHGLA）和花生四烯酸（araehidonieacid，AA）。
多不饱和脂肪酸具有多种生理功能，不仅是生物膜的重要组成成分，可以调节细胞构型、动态平衡、相转变及细胞膜的渗透性等，同时也可以转化为某些生物活性物质的前体，并调节某些基因表达，预防一些疾病的发生。
PUFAs特别是γ—亚麻酸和花生四烯酸是人体的必需脂肪酸，有着多种生理功能。
具体来说，γ—亚麻酸作为前列腺素的前体物质，具有抗动脉粥样硬化，降低血脂胆固醇浓度，降血压、抑制血小板凝集，增强免疫功能，保湿护肤等作用。
花生四烯酸是人体中含量最高，分布最广的一种多不饱和脂肪酸（PUFA），尤其是在脑和神经组织中AA含量一般占总PUFAS的40％－50％，在神经末梢甚至高达70％，具有保护皮肤，降低胆固醇，抑制血小板聚集，提高免疫力，促进胎儿发育等功能。
多不饱和脂肪酸,目前已越来越引起人们的重视。
传统从动植物中提取PUFA已不能满足市场的需求，微生物发酵生产PUFA因有不受原料、气候、产地的限制，易产业化生产等优点，因此有着广阔的市场前景，此方面的研究正方兴未艾
几乎所有微生物（细菌、酵母、霉菌、藻类等）都能产生油脂和不饱和脂肪酸，但细菌油脂含量较低，目前研究较多的是酵母和霉菌。
常用于产油的酵母有假丝酵母、粘红酵母、斯达氏油脂酵母，产油油脂酵母等。
酵母中最丰富的脂肪酸是油酸，其次是亚油酸，不饱和脂肪酸含量较霉菌低。
而霉菌富含各种多不饱和脂肪酸，常用于研究的有深黄被孢霉（Mortierellaisabellina）、高山被孢霉（Mortierellaalpina）、卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）、米曲霉（Aspergillusoryzae）、土曲霉（Aspergillusterreus）、雅致枝霉（Thamnidiumelegans）、三孢布拉氏霉（Blakesleatrispora）等霉菌，特别是被孢霉属，主要用于研究生产GLA和AA。
国内外都对微生物发酵生产多不饱和脂肪酸及影响其合成的因素做了各方面的研究，如碳氮源、C/N、pH值，温度、添加植物油等等。
总得来说，葡萄糖、低温、高C/N利于不饱和脂肪酸的合成。
国外方面，SeraphimPapanikolaou用深黄被孢霉高碳氮比培养，得到菌体细胞量达35.9g/l,油脂占细胞干重的50-55%,GLA含量占菌体总脂肪酸量的3.5±1.0%,即GLA产率为0.801g/l。
D.Somasheka等对Mucorrouxii和Mucorsp.1b进行研究结果显示这两种菌主要产棕榈油，油酸和十八烷酸。
对培养基优化时发现KNO3有利于脂质的合成，以葡萄糖为碳源时GLA产量最高，而乳糖不利于细胞生长及油脂的合成。
ElenaConti等对毛霉菌目在谷物固态发酵生产γ-亚麻酸做了研究。
结果显示CunninghamellaelegansCCF1318在大麦上生长γ-亚麻酸产量最高。
每克干基质可生产γ-亚麻酸14.2mg，占总不饱和脂肪酸的15.6%。
SandraD.Dyal等对Mortierellaramannianavar.Ramanniana生产γ-亚麻酸的最优条件做了较详细研究。
细胞量可达29g/l,在最优的培养条件下，油脂产量达细胞干重的54.2%，其中不饱和脂肪酸在总油脂比例达84.3%，γ-亚麻酸在总油脂中的含量为13.3%。
V.K.Eroshin等研究了MortierellaalpinaLPM301中花生四烯酸（ARA）的生产条件。
在以KNO3为氮源时，ARA在总脂含量达60.4%，占细胞干重的18.8%，每升发酵液可获取ARA4.5g。
国内方面，李忠玲等以少根根霉（Rhizopusarrhizus）R0为出发菌株,利用紫外诱变的方法,利用紫外诱变结合失水苹果酰肼筛选的方法,选育出突变株R4,摇瓶培养菌体的生物量为28.84g/l，油脂含量35.55%,其中GLA占油脂的12.5%,比原始菌株油脂含量提高了93.94%,GLA提高了276.5%。
经传代培养证明,选到的突变株产γ-亚麻酸性能稳定。
刘阳等采用紫外线和硫酸二乙酯对深黄被孢霉As3,3410和雅致小克银汉霉As3,2717进行诱变,筛选出一株高产γ-亚麻酸的突变株H3,3410-5。
突变株H3,3410-5每升发酵液中干菌体得率为24.3g,油脂含量为10.1g,γ-亚麻酸的含量占总脂的9.43%。
汪晨辉等以卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）3.2208为出发菌株,进行紫外诱变,用苏丹黑染色法和红四氮唑（TTC）酶活测定法初筛,摇瓶复筛,获得1株高产GLA的诱变株M3。
通过紫外线诱变育种及初筛和复筛,获得1株GLA产率比出发菌株显著提高的突变株M3,其菌体细胞收率为15.20g/l，油脂含量为20.10%,油脂产率为3.65g/l,GLA含量占菌体总脂肪酸量的17.28%,GLA产率为630.72mg/l,分别是出发菌株的1.50、1.51、2.74、2.04和5.61倍。
朱国胜等利用紫外线复合氯化锂诱变高山被孢霉SM96，筛选出一株高产γ-亚麻酸的菌株TM11,产量比出发菌株提高了近3倍。
对影响其多不饱和脂肪酸产生的因子Mg2+，VB6,营养盐溶液，磷源，碳源，氮源酵母膏进行了正交试验，选出TM11在最佳的培养基中生物量达18.0213g/l，总脂产量达10.8128g/l，GLA含量668mg/l。
禹慧明等以从土壤中筛选得到的被孢霉菌为出发菌,用紫外线诱变处理,筛选γ-亚麻酸高产变异株,用摇瓶发酵选出其最佳培养基配方。
原出发菌株细胞干重25.0g/l,油脂含量9.5g/l,γ-亚麻酸含量5.0%。
选出的高产菌株在最佳条件下发酵,细胞干重50.2g/l,油脂含量21.8g/l,γ-亚麻酸含量8.5%。
所得高产菌株具遗传稳定性。
L.J.Yu等研究了谷氨酸对Mortierellaalpina生产花生四烯酸的影响。
发现谷氨酸有利于细胞生长并能促进花生四烯酸的合成，当谷氨酸添加量为0.8g/l时，花生四烯酸的产量达到最高（1.41g/l）。
Hung-DerJang等从11株菌种筛出了不饱和脂肪酸高产菌株M..alpinaATCC32222并研究了其生产不饱和脂肪酸的最佳条件。
结果发现低温有利于不饱和脂肪酸的合成，最佳C/N比范围在5.1-9.0之间。
在12℃时，细胞量为6.2g/l,每消耗1g碳总不饱和脂肪酸产量为218.4mg，其中亚麻酸21.4mg，γ-亚麻酸25.6mg,花生四烯酸110.3mg。
脂肪酸传统的提取分离方法主要有：
压榨分离法、有机溶剂分离法、精馏分离法及尿素包合分离等化学方法。
传统工艺相对原理简单，操作方便，成本经济，但由于脂肪酸的热敏性，及其将作为营养强化剂、食品添加剂及保健食品等的特定要求，传统的分离方法存在一定的局限。
较新的分离技术有超临界萃取法和色谱分离技术。
王淑云等基于π-络合吸附分离原理研究了由液体石蜡和油酸组成的饱和－不饱和混合脂肪酸分离技术。
以羟基磷酸钙（HAP）作为吸附剂载体，以AgNO3作为活性组分，用浸渍法将AgNO3担载于羟基磷酸钙（HAP）上制得络合吸附剂。
用气相色谱、傅立叶红外光谱对不同载银量的吸附剂以及不同吸附剂用量的吸附分离效果进行了检测。
对其吸附分离脂肪酸的效果进行了分析评价：
羟基磷酸钙作为载体，最佳煅烧温度为800℃，AgNO3为活性组分，在油酸与液体石蜡质量配比为1∶4，反应温度为50℃，吸附剂加入量为2.5g时，混合脂肪酸的分离效果达到95%以上。
发酵生产不饱和脂肪酸存在的主要问题是,发酵生产难以应用于大规模生产,在摇瓶中优化的最佳条件和得到的最大产量在发酵罐中难以重现，如L.J.Yu等在摇瓶中得到的花生四烯酸的产量达到1.41g/l，但同样的条件在10L的发酵罐中产量只有0.93g/l。
更方便经济高效的提取方法也有待进一步的深入研究。
另外，研究工作不应仅局限于已知菌种，应从自然界筛出更多优良菌株，这样常用的初始菌株的筛选方法-苏丹染色法就略显麻烦和主观，更快速准确的筛选方法也有待进一步研究。
本研究采用理化诱变和原生质体融合等方法进一步提高假丝酵母的长链多不饱和脂肪酸产量；优化假丝酵母发酵产长链多不饱和脂肪酸的条件及培养基组成；探讨长链多不饱和脂肪酸的提取工艺条件，为长链多不饱和脂肪酸的的发酵生产奠定基础。
二、主要研究内容
一）、高产长链多不饱和脂肪酸菌种的选育
（一）、原生质体融合选育菌株
1、材料与方法
1.1材料：
1.1.1菌株
选用本课题组筛选的对氟康唑（Fluconazole）具有抗性的啤酒酵母（SaccharomycesCerevisiae）BFG0712和对制菌霉素（Nyafungini）具有抗性的假丝酵母（Candidatropicalis）JFG0756。
1.1.2试液
（1）高渗缓冲液（ST）：
10mmol/L、pH7.4Tris-HCl，0.5mol/L蔗糖，10mmol/LMgCl2。
（2）PEG：
PEG6000：
30%，蔗糖：
5%，CaCl2（无水）：
0.47%，10mmol/LTris-HCl（pH7.4）。
（3）0.1mol/LEDTA
1.1.3培养基
（1）BFG0712培养基
①液体培养基:
PYG液体培养基（KH2PO4:
0.2%，MgSO4·7H2O：
0.1％，（NH4）2SO4：
0.1％，葡萄糖：
1％，蛋白胨：
0.35％，酵母膏：
0.3％，调pH5.5）灭菌后，加入0.5μg/ml的Fluconazole。
②固体培养基：
PYG液体培养基加琼脂2%，加入0.5μg/ml的Fluconazole。
（2）JHG9923培养基：
①液体培养基：
PYG液体培养基灭菌后，加入25单位/ml的Nysfungini。
②固体培养基：
PYG液体培养基加琼脂2%，加入25单位/ml的Nysfungini。
（3）融合子再生培养基：
用高渗缓冲液（ST）配制PYG固体培养基，加入0.5μg/ml的Fluconazole及25单位/ml的Nysfungini。
1.2方法
1.2.1长链多不饱和脂肪酸的含量测定
1）、脂肪碘价的测定
碘价指100克脂肪所吸收的碘的克数。
碘价的高低表示脂肪酸不饱和度的大小，脂肪分子中的不饱和脂酰基（－CH=CH－）能吸收碘，主要化学反应如下：
I2+Br2→2IBr（Hanusreagent，溶剂为冰醋酸）
KI+CH3COOH→HI+CH3COOK
I2+2Na2S2O4→2NaI+Na2S4O6
①用移液管准确移取一定体积的脂肪贮存液于碘瓶中，并用氮气吹干至恒重，称重（脂肪重量约0.1g），加入10ml氯仿作溶剂使脂肪溶解，加入Hanus试剂10ml，塞好碘瓶，轻摇，混匀，放在暗处30分钟，另一碘瓶放入同样的试剂，不加脂肪作为空白对照。
②30分钟后，靠碘瓶口边缘缓缓加入10mlKI和50mlH2O，混匀，用0.1mol/LNa2S2O4滴定，当瓶内液体呈淡黄色时，加入1％淀粉液数滴，滴定至蓝色恰恰消失为止，记录所用Na2S2O4溶液的量，用同样方法滴定空白瓶。
③计算碘价
B：
滴定空白瓶所消耗的Na2S2O4溶液毫升数
S：
滴定样品所消耗的Na2S2O4溶液毫升数
C：
标准Na2S2O4溶液的浓度
2）、脂肪皂化价的测定
脂肪与碱的水解作用称皂化作用。
皂化1g油脂所需要的KOH的毫克数就是该油脂的皂化价。
主要反应方程式为：
－COOH+KOH→－COOK+H2O
①用移液管准确移取一定体积的脂肪贮存液于150ml烧瓶中，并用氮气吹干至恒重，称重（脂肪重量约0.1g），加入0.1mol/LKOH乙醇溶液10ml。
②烧瓶上装上冷凝管，置于水浴锅上，不断摇动，约60分钟，直至瓶内的脂肪完全皂化为止（此时，瓶内液体澄清并无油珠出现）
③冷却完毕，加入3－5滴酚酞指示剂，以0.05mol/LHCl溶液滴定剩余的碱，记录HCl溶液的用量。
同时作一个空白实验，记录HCl溶液的用量
④计算皂化价
A：
空白实验所消耗的HCl溶液的毫升数
B：
脂肪实验所消耗的HCl溶液的毫升数
C：
标准HCl溶液的浓度
3）、脂肪酸价的测定
酸价指中和1g脂肪的游离脂肪酸所需要的KOH的毫克数，酸价表示脂肪酸的酸败程度。
其反应方程式为：
RCOOH+KOH→RCOOK+H2O
①用移液管准确移取一定体积的脂肪贮存液于100ml三角烧瓶中，并用氮气吹干至恒重，称重（脂肪重量约0.1g）。
②在三角烧瓶中加入混合液20ml（混合液配方：
95％乙醇∶乙醚＝1:
1，加入酚酞指示剂数滴，用0.01mol/LKOH中和至红色，振荡）。
振荡数分钟（或在40℃水浴中溶化）至透明，红色消失。
加入酚酞指示剂1-2滴，用0.1mol/LKOH标准液滴定至淡红色，一分钟不褪色为滴定终点，记录0.01mol/LKOH溶液的用量。
③计算酸价
C：
标准KOH溶液的浓度；
V：
样品消耗KOH溶液的毫升数；
1.2.2BFG0712及JFG0756对数生长期的确定
分别将保藏的BFG0712及JFG0756接种到各自的固体培养基斜面上活化两次，再接到各自的液体培养基中进行摇瓶培养，每隔2h测一次OD600nm，以时间t为横坐标，OD600nm为纵坐标，作出生长曲线，确定对数生长期。
1.2.3BFG0712及JFG0756原生质体的制备
将BFG0712及JFG0756两菌株分别接入含各自液体培养基50ml的500ml三角瓶中，于28℃，100r/min摇床上分别培养20h和12h，取此培养液各5ml，300r/min离心收获细胞，并用EDTA洗涤两次，用酶液悬浮细胞，使为107/ml左右。
用血球计数板计细胞数，其值为每毫升ABFG0712和AJFG0756个细胞，于28℃下酶解破壁40min、60min、90min，取每个破壁时间下的液体1ml，稀释100倍，再计数，算出稀释前溶液中细胞数分别为1mlBBFG0712和BJFG0756，原生质体数分别为1mlABFG0712-BBFG0712和1mlAJFG0756–BJFG0756，由此确定原生质体的制备率。
1.2.4原生质体融合及融合子的再生
将制取的两亲株原生质体于1000r/min离心3min去沉淀，取上清液于3000r/min，离心10min收获原生质体，用ST溶液洗涤两次，用ST溶液1ml悬浮原生质体，取两菌株原生质体液各0.5ml混合，于3000r/min，离心10min，去尽上清，加ST溶液0.1ml悬浮原生质体，再加PEG溶液3.9ml，轻轻吹吸2~3次，于28℃放置35min后，于1500r/min离心去上清，用ST溶液稀释后涂布埋入融合子再生培养基中，于28℃培养5天，挑出在培养基中长出的菌体，于融合子再生培养基中分离纯化3次，挑取菌体接种于融合子再生培养基的斜面试管中保藏备用。
2结果与分析
2.1BFG0712及JFG0756对数生长期
以OD600nm为纵坐标，时间t为横坐标，BFG0712及JFG0756的生长曲线见图1。
图1BFG0712及JFG0756生长曲线
由图1可知，根据两菌种的对数生长期，选用培养20h和12h的两菌种的细胞作为原生质体制备细胞。
2.2BFG0712及JFG0756原生质制备条件及制备率
根据试验方法，其试验结果见表1
从表1可知，菌种酶解破壁的最佳时间都为60min，此时，BFG0712的原生质体制备率为76.3%，JFG0756的原生质体制备率为81.26%。
表1原生质体制备结果表
菌株
酶解时间/min
原生质体制备率/%
40
42.25
60
76.37
90
77.21
40
53.34
60
81.26
90
81.74
2.3原生质体融合及融合子的再生
通过原生质体融合及融合子的再生，并采用初筛和复筛的方法，挑选了16株菌株，对这些菌株进行三次分离、纯化，确定了9株菌株其编号和长链多不饱和脂肪酸含量见表2。
表2各菌株还原型谷胱苷肽（长链多不饱和脂肪酸）含量表
菌株
长链多不饱和脂肪酸（g/100ml）
Bfg20071
0.22
Bfg20072
0.03
Bfg20073
0.68
Bfg20074
0.15
Bfg20075
0.37
Bfg20076
Bfg20077
Bfg20078
1.02
0.59
1.06
Bfg20079
0.75
表2结果显示，这9株菌株中Bfg20076和Bfg20078两株的摇瓶长链多不饱和脂肪酸含量较高，其中Bfg20078菌株的长链多不饱和脂肪酸含量最高，为1.06g/100ml。
3、小结
3.1出发菌株BFG0712的对数生长期为4-20h，JFG0756的对数生长期为4-12h。
3.2BFG0712和JFG0756酶解破壁的最佳时间为60min，此时BFG0712的原生质体制备率为76.37%，JFG0756的原生质体制备率为81.26%。
3.3通过原生质体融合选育出了菌株Bfg20078，其摇瓶长链多不饱和脂肪酸含量为1.06g/100ml。
（二）理化诱变选育
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
本实验室通过原生质体融合选育出了菌株Bfg20078
1.1.2药品
氯化锌（ZnCl2）,亚硝基胍，失水苹果酰肼，氟康唑（Fluconazole），制菌霉素（Nysfungini）
1.1.3培养基
（1）斜面培养基：
KH2PO4:
0.2%，MgSO4·7H2O：
0.1％，（NH4）2SO4：
0.1％，葡萄糖：
1％，蛋白胨：
0.35％，酵母膏：
0.3％，琼脂2%，调pH5.5，灭菌后加入0.5μg/ml的Fluconazole和25单位/ml的Nysfungini
（2）液体培养基：
KH2PO4:
0.2%，MgSO4·7H2O：
0.1％，（NH4）2SO4：
0.1％，葡萄糖：
1％，蛋白胨：
0.35％，酵母膏：
0.3％，调pH5.5，灭菌后加入0.5μg/ml的Fluconazole和25单位/ml的Nysfungini
（3）氯化锌平板培养基：
斜面培养基+4000mg／LZnCl2，pH自然，灭菌20min
（4）失水苹果酰肼平板培养基：
斜面培养基+600mg／L失水苹果酰肼，pH自然，灭菌20min
1.2方法
1.2.1细胞悬液的制备：
用无菌生理盐水对培养至对数生长期的具有氟康唑和制菌霉素双重抗性的细胞进行适当稀释，使细胞浓度为105～6个/mL。
1.2.2UV诱变：
取5mL细胞悬液于直径9cm平皿中,置30w紫外灯管下,距离约25cm,照射一定时间后,在红外灯下适当稀释倍数,取0.1mL涂平板28℃避光培养,计平板菌落数。
1.2.3亚硝基胍诱变
用分析天平称一定质量的亚硝基胍，加入0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液,于暗处振荡溶解,稀释不同梯度浓度，吸取不同浓度溶液1mL,加入到1mL细胞悬液中，振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以适当稀释分离培养，在28℃培养3天后记数存活单菌落数目。
计算各因素对细胞的致死率，以80%～90%的致死率为诱变剂量。
1.2.4筛选平板中ZnCl2浓度的选择
ZnCl2是多种脱氢酶、脱羧酶和肽酶的辅因子，是酵母生长所需的微量元素。
在低浓度时有促进酵母生长的作用，但高浓度的ZnCl2对酵母有杀菌和抑菌作用。
因此，实验过程中要考察ZnCl2浓度。
1.2.5诱变处理及菌株挑选程序
出发株
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