红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验.docx

红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验.docx

《红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验

红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验

流感病毒表面得血凝素（ＨＡ）蛋白,含有识别与结合宿主细胞表面受体得结构，能使一些特定得红细胞发生凝集现象.当红细胞与病毒按适当得比例混合后，由于病毒得作用使红细胞发生凝集,此为凝集现象。

含有特异得抗流感病毒HA蛋白得抗血清，能抑制红细胞凝集现象得出现,即抗体与病毒结合后，可以使血凝素不能吸附于红细胞表面得受体上,此为红细胞凝集抑制（HＡI）.

微量红细胞凝集抑制试验就是目前最常用得一种鉴定流感病毒型／亚型及分析流感病毒HA抗原性变异得试验方法,也可以用于对一般人群抗体水平得检测与疫苗效果得评价等方面。

用于HAI试验得标准参照血清必须及时更新,用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年得国际疫苗株或国内流行代表株得抗血清,可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物得抗血清；用于抗原分析得抗血清建议包括同一型别与亚型不同毒株免疫得标准参考抗血清,由于用雪貂制备得抗流感病毒血清特异性高,易将不同毒株间抗原性差异显示出来,因此常用免疫雪貂得抗血清进行抗原分析。

HＡI试验中所用得血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。

（一）生物安全要求

所有有关试验操作都应在相应生物安全级别得实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程与废弃物管理规定，做好个人防护要求。

季节性流感病毒病毒或经完全灭活得高致病性禽流感病毒操作可以在BSL—2实验室里进行，高致病性禽流感病毒得操作在BＳＬ—3级实验室中进行。

（二）实验所用试剂

1。

标准参考抗原:

以国际疫苗株与国内流行株作为标准参考抗原,新分离得毒株作为待测抗原。

2.标准参考抗血清:

以国际疫苗株与国内流行株制备得抗血清作为标准参考血清。

血清要经ＲＤE处理。

（三）其她试剂/材料/仪器

1.红细胞悬液ﻩﻩﻩﻩﻩﻩﻩﻩ

2.PH７、4得PＢS缓冲液

3.RDＥ（日本生研）ﻩﻩﻩ

4.水浴箱（3７℃,5６℃）

5.台式离心机

6.多道可调加样器、单道可调加样器

7.离心管

8.96孔微量血凝板（使用豚鼠与人红细胞进行实验须用“Ｕ"底板,使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板）

9.２０0µL、１000µLTIP头、水槽

表１、流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较

红细胞

火鸡

豚鼠

人“O"型血

终浓度

０、5

0、５

0、5

孔底部形状

V型

Ｕ型

Ｕ型

孵育时间

25-30min

４5—６０mｉｎ

４5—60min

红细胞沉积形状

细胞沉积成点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状

细胞沉积成环状

细胞沉积成环状

（四）流感病毒鉴定与抗原分析步骤

1.实验前准备

（1）标准参考抗血清得处理

1）去除血清中得非特异性抑制素

a）所谓抑制素就是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似得物质,它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别与结合。

目前所知道得非特异性抑制素,除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊得非特异性抑制素,还有三种:

α、β与γ。

在ＨAI试验中,必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净,才能准确地测定出ＨAI得抗体效价。

常用得清除非特异性血凝抑制素得方法有霍乱滤液（RＤE,受体破坏酶得一种）清除法,过碘酸钾清除法等。

b）RＤE处理步骤:

用２5mL生理盐水稀释RＤE；在1体积血清中加入3体积RDＥ（如0、１mＬ血清+０、３mLRDE）,37℃水浴１6-18ｈ;５6℃水浴30min；加入6体积生理盐水（在０、４mLRDＥ与血清混合物中加入0、6mＬ生理盐水）。

2）去除非特异性凝集素

a）向20体积RDE处理后得血清中加入1体积得纯血球。

b）完全/彻底混匀,在2—8℃孵育，每15　ｍin重新混匀一次。

c）1ｈ后，20０0转离心5min。

吸出血清上清液。

d）取出一块9６孔血凝板，在第一列每孔加入５0uLPBＳ缓冲液,吸出５0uL处理好得血清，做2倍稀释,加入50uL红细胞悬液,室温静置３0—６0ｍin,观察试验结果,如果红细胞沉积,证明血清中非特异性凝集素去除干净（去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致）。

（2）红细胞悬液配制

1）A、S液全称为Alsｅveｒ氏液。

配制方法为葡萄糖2、0５ｇ、柠檬酸钠0、8g、柠檬酸0、0５5g、氯化钠０、42g、去离子水加至１00mL,微热溶解,将ｐH值调到６、1,8磅20ｍｉn高压灭菌，4℃贮存备用。

2）将含有红细胞得A、S液,离心5min（火鸡/鸡红细胞１800rpm;人“O”型、豚鼠红细胞2000rpm，不同离心机转速稍有不同），弃上清。

3）加入等量得ＰBS缓冲液洗涤,充分混匀,离心５mｉｎ（转速同上）,弃上清.　PBＳ缓冲液洗涤三次．最后一次洗涤后，离心10ｍiｎ（转速同上）,弃上清。

4）吸出适当体积得红细胞，用ＰＢS缓冲液配制成工作浓度为1%红细胞悬液。

2.流感毒株ＨA滴度得测定

（1）在微量血凝板得第２~12列加入50µL　ＰBS缓冲液。

（2）在第一列（A1～G１）中加入１00µL病毒悬液.

（3）H１加入10０µLPＢS,作为红细胞阴性对照。

（4）从第一列各孔吸50µL病毒液，由第1列至第１2列做２倍系列稀释，最后一列每孔弃去5０µＬ。

（5）在每孔中加入50µL红细胞悬液,轻拍血凝板,充分混匀。

（6）室温孵育，鸡与火鸡红细胞静置25-30miｎ后观察结果,人“O＂型与豚鼠红细胞45—６0ｍin后观察结果,并记录。

3.HA试验结果判断

引起全部红细胞凝集为完全凝集,以“＋”记录;只有部分红细胞凝集记录为“+/—";无凝集记录“—”。

血凝滴度得判定以出现完全凝集得最高稀释度为终点,其稀释度得倒数即为病毒得血凝滴度。

表2、HA滴度判定举例

病毒稀释度

ＨＡ滴度

1:

1

1:

2

1：

4

1:

8

1：

1６

1:

３2

１:

6４

1:

12８

1:

256

１:

512

１:

1024

1:

2048

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

１１

１2

A

+

+

－

—

—

-

—

-

－

-

—

—

2

B

+

+

+

＋

—

—

—

—

-

-

—

—

８

Ｃ

+

+

+

＋

+

—

—

－

－

—

—

-

16

D

+

+

+

+

＋

+

—

—

-

—

—

—

３2

E

＋

+

+

+

+

+

+

-

—

—

—

－

64

F

＋

＋

+

+

＋

+

+

+

-

-

-

—

1２8

G

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

≥２04８

Ｈ

-

－

—

—

-

－

—

—

—

－

—

-

＜１

4.制备用于红细胞凝集抑制试验得4个血凝单位得抗原

（1）一个凝集单位指能引起等量得标准化得红细胞凝集得病毒量。

进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位得病毒量。

（2）制备４个单位血凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需得病毒抗原得总量．如每种血清做８孔稀释，每孔用抗原２5µL,则测定一份血清需0、２ｍL抗原.根据标准抗血清得份数计算出实验所需病毒抗原总量。

（3）其次,计算出病毒稀释度。

用病毒得HA滴度除以８，得到得商即为配置4个血凝单位所需得稀释度。

如,某病毒得ＨＡ滴度为64,除以8等于８，则１:

8（1mＬ病毒液加7mLPBＳ缓冲液）稀释该病毒即可得到4个血凝单位得抗原。

注:

红细胞凝集抑制试验中所用得4个血凝单位就是指每２5µL病毒液中含有4个血凝单位（等于５0µL病毒液中含有8个血凝单位）.

表3、所需抗原总量为1６00µＬ时,4个血凝单位配置对照表

HＡ滴度

病毒液（µL）

PBS（µL）

１6

80０

800

32

４00

１２００

64

2０0

１40０

１２８

100

１５00

256

50

15５０

512

25

1５７5

1024

12、５

1５８7、5

2048

6、25

１５93、75

5.4个血凝单位抗原得复核滴定

（1）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误,新配置得4个血凝单位抗原需复核滴定。

操作方法同ＨA实验步骤.

（2）如果只有前4孔出现凝集，表明每50µＬ病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确,可以用于红细胞凝集抑制试验。

如第5孔也出现凝集,说明每50µL病毒含有16个血凝单位,该抗原必须等量稀释。

如只有前3孔凝集，表明每50µL病毒仅含4个血凝单位，病毒量需加倍.此外,4个血凝单位抗原必须每次现用现配.

6.红细胞凝集抑制试验（HAI）

（1）利用HＡI方法进行流感病毒得鉴定

红细胞凝集抑制试验（ＨＡＩ）鉴定未知病毒,每块9６孔血凝板可以检测两株未知病毒。

1）在血凝板得第1-　5、7—11列每孔加入25µＬPBS缓冲液,第６与1２列每孔加入5０µLＰBS.然后在A1-A4、A７-A１0各孔分别加入：

抗A（Ｈ1N1）pｄｍ09流感病毒标准参考血清、抗季节性A（H３N2）流感病毒标准参考血清、抗B—Yａmagaｔa系流感病毒标准参考血清、抗B-Ｖｉcｔoriａ系流感病毒标准参考血清25µＬ，用多道移液器从A1—A４、A7—Ａ１0行每个孔分别取25µＬ，由A至Ｈ行做2倍稀释血清,最后一行弃去25µL。

2）第1至4各列每孔加入2５µＬ4血凝单位待检抗原１,Ａ7至A1０各列每孔加入25µL4血凝单位待检抗原2．第5与第11列加入25µLＰＢＳ缓冲液，作为红细胞对照.第6与第1２列第一孔分别加入50µL8血凝单位待检抗原１与2，由A至H行做2倍稀释,最后一行弃去50µＬ,此处做法得目得就是HAI实验同时验证所配置４单位抗原得准确性,确保实验结果准确。

a）阳性对照:

将试剂盒中得各型/亚型流感病毒标准参考抗原按照上述步骤进行检测。

3）轻拍,混匀，室温孵育30min。

4）每孔加入5０µＬ配置好得红细胞悬液，轻拍混匀,室温静置30-6０min，观察血凝抑制实验结果（具体孵育时间根据使用得不同种类血球来定,详见表１）。

（2）利用HAＩ方法进行流感病毒得抗原分析

1）验证4血凝单位抗原步骤同以上,如果4血凝单位结果不准确需重新配置，直至回滴结果准确为止，在进行抗原分析时4血凝单位抗原一定要配制准确,保证病毒之间抗原分析结果有可比性。

2）在微量血凝板得第１-１1列每孔加入２５µＬPＢS缓冲液，第1２列每孔加入5０µＬＰＢS缓冲液。

在第一行（A1-A11）每孔加入２5µL对应待检流感病毒型/亚型得抗原分析用参考抗血清及阴性对照血清．　　

3）从第一行（A１－Ａ11）各孔混匀之后吸取２5µＬ血清，由第1行至第8行做2倍系列稀释，最后一行每孔弃去25µL液体。

4）在微量板得第1—11列每孔加入2５μＬ配制好得4血凝单位抗原,第1２列A1２孔加入50µL配置好得8血凝单位抗原,由第1行至第4行做2倍系列稀释,最后一行每孔弃去5０µL液体。

第1２列得E、Ｆ、G、Ｈ孔做红细胞对照,轻拍微量板，室温孵育３0ｍｉn。

5）在微量板得每孔加入5０µＬ得红细胞悬液，轻拍微量板，使红细胞与病毒充分混合.

6）室温静置30-60min（具体孵育时间根据使用得不同种类血球来定，详见表1）.观察血凝抑制实验结果。

7.结果判读

红细胞凝集抑制效价就是指血凝现象完全被抑制时血清得最高稀释度得倒数。

如１:

8０稀释得血清孔不出现凝集（凝集现象完全被抑制）,1：

１６0稀释得血清孔出现凝集（凝集现象没有被完全抑制），该血清对测定病毒得红细胞凝集抑制效价为80。

（1）利用HAI方法进行流感病毒鉴定得结果判断

1）标准参照抗血清对待检抗原得抑制效价≥2０才可以算为阳性。

2）待检抗原与标准参照抗血清有交叉抑制,但与一种型／亚型得标准参照抗血清抑制效价大于其她型/亚型参照抗血清4倍以上时,便可以判定为此种亚型得流感病毒。

（2）利用HAＩ方法进行流感病毒抗原分析得结果判断

1）当待检病毒与参考雪貂抗血清得ＨAＩ效价低于参考病毒与参考抗血清自身ＨAI效价得8倍（含８倍）或以上时,则认为待检病毒就是该参考抗血清检测到得低反应株;反之,当相差8倍以内时（不含8倍）,则认为待检病毒就是参考病毒得类似株.

2）抗原分析试验时，每次都必须同时加入标准参考抗原进行检测，它既就是结果判读得依据,也就是试验得质控。

确保实验结果准确,结果更具有可比性。

每次阳性对照得血凝抑制效价上下一孔浮动,在试验质控得范围内,如果超出此范围之外本次试验结果不成立,需重复试验.

（五）注意事项

1.红细胞凝集抑制试验必须用4个血凝单位/25µＬ得抗原,抗原必须现用现配。

2.红细胞悬液得配制必须标准化．

3.正确存放试剂,避免反复冻融及污染。

4.冻干得试剂应按照说明溶解,保存。

5.血凝抑制试验包括以下对照：

（1）红细胞对照,用于准确判断读结果得时间,同时排除血球问题引起得错误结果；

（2）阴性对照血清，以防其它非特异性抗体得影响；

（3）阳性对照:

防止非特异性凝集素及抑制素得干扰;结果判读标准.