蛹虫草菌丝体液体培养条件的优化大学本科毕业论文.docx

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蛹虫草菌丝体液体培养条件的优化大学本科毕业论文

摘要

蛹虫草，也称北冬虫夏草，具有补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮等功效，是我国的名贵中草药材。

本论文采用沈阳微生物研究所提供的蛹虫草优质菌种，通过斜面培养、液体培养等过程，获得优质的蛹虫草菌丝体，并以菌丝体重量为指标，对培养温度、初始pH值、培养箱转速、最佳碳源、最佳氮源、最佳无机盐等液体培养条件进行单因素分析，通过正交试验法确立了蛹虫草菌丝体的最佳培养基配方。

实验结果表明，蛹虫草菌丝体培养最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，最佳无机盐是KH2PO4和MgSO4；最佳培养基配方是葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO40.5g/L，VB150mg/L；最佳培养温度是24℃，最佳初始pH值是6.0，最佳培养箱转速时150r/min；并在最佳培养条件下绘制了蛹虫草菌丝体生长曲线，其对数期为第5～7.5天，菌丝体平均重为7.07g，稳定期为第7.5～9天，菌丝体重为14.63g，从第9天后，蛹虫草菌丝体开始衰退。

关键字：

蛹虫草；液体培养；正交试验法

Abstract

Cordycepsmilitaris,alsoknownastheNorthCordyceps,hastheeffectofcompletingdeficiency,benefitingtheessence,lungandkidney,haemostaticandresolvingphlegm,nourishingandstrong,ItisapreciousChineseherbalmedicinematerials.

CordycepsmilitarisinthispaperhashighqualityandisprovidedbytheShenyangInstituteofMicrobiology.Aftertakingslantcultureandliquidcultureprocesses,wegethighqualityCordycepsmilitarismycelia.Ittakesmyceliumweightasanindicatortomakeunivariateanalysisoftheincubationtemperature,initialpHvalueincubatorspeed,thebestcarbonsource,thebestnitrogensourceandthebestinorganicsaltsliquidcultureconditions.Withorthogonaltestmethod,it’sestablishedtheoptimummyceliamedium.Theexperimentalresultsshowthatthebestcarbonsourceforthemyceliaisglucose,thebestnitrogensourceispeptone,thebestinorganicsaltisKH2PO4andMgSO4.Aoptimummediumincludesglucose20g/L,peptone10g/L,KH2PO41.0g/L,MgSO40.5g/L,VB150mg/L.Theoptimalincubationtemperatureis24℃,theoptimalinitialpHvalueis6.0,thebestincubatorspeedis150r/min.ThegrowthcurveofCordycepsmilitarismyceliaisdrawnontheoptimalcultureconditions.Thelogarithmicphaseturnedupatthe5thto7.5thday,themyceliumaverageweighted7.07g,thestabilizationperiodturnedupatthe7.5thto9thday.Themyceliumweighted14.63gandtherecessionbeganfromtheninthday.

Keywords:

Cordycepsmilitaris;Liquidculture;Orthogonalmethod.

目录

摘要I

AbstractII

第一章前言1

第二章文献综述2

2.1蛹虫草简介2

2.1.1形态特征2

2.1.2生长条件3

2.1.3功能成分3

2.1.4药用价值5

2.2蛹虫草培养基的作用7

2.2.1碳源7

2.2.2氮源7

2.2.3无机盐7

2.3蛹虫草培养条件的影响7

2.3.1初始PH值的影响7

2.3.2培养温度的影响8

2.3.3摇瓶转速的影响8

2.4菌种液体培养及优化8

2.4.1单因素试验法8

2.4.2正交试验设计法8

2.4.3响应面优化设计法9

2.4.4二次正交旋转组合法10

2.5国内外研究现状10

2.6本文研究意义12

第三章实验部分13

3.1试验材料13

3.1.1菌种13

3.1.2培养基13

3.1.3主要试剂13

3.1.4主要设备13

3.2试验方法14

3.2.1蛹虫草菌丝体的培养14

3.2.2蛹虫草菌丝体培养基的优化14

3.2.3蛹虫草菌丝体培养条件的优化16

3.2.4蛹虫草菌丝体生长曲线的绘制17

3.3结果与分析17

3.3.1蛹虫草菌丝体培养基的单因素分析与正交试验结果17

3.3.2蛹虫草菌丝体培养条件的优化23

3.3.3蛹虫草菌丝体生长曲线26

第四章结论与展望28

4.1结论28

4.2展望28

致谢29

参考文献30

第一章前言

蛹虫草，又称北冬虫夏草，主要产自吉林、云南等地带的针阔叶林的鳞翅目昆虫蛹体上，是一种名贵的药用真菌。

蛹虫草菌含有多种有效成分，包括核苷类化合物（又称虫草素）、虫草多糖、虫草酸、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）、维生素及微量元素等7大类具有生物活性和药理作用的化合物[1]。

这些有效成分可以增强人体免疫能力，并具有抗癌、抗病毒等功效[2]。

目前市场上销售的冬虫夏草人工替代品主要是通过3类方法培育的蛹虫草菌：

1.用鲜或干蚕蛹体培植出的蛹与草为一体的“蛹体虫草”；2.以大米、小麦等为主要原料，在固态人工合成培养基上培植出的“虫草菌子实体”；3.采用液体深层发酵法培养的蛹虫草菌丝体。

在药化、药理和临床试验[3]均证明它们的主要有效成分可替代天然的冬虫夏草。

对蛹虫草菌进行液态发酵培养大量生产菌丝体，比固态培养蛹虫草菌子实体具有周期短、可控性强、功能性有效成分含量高等优点，且利于大规模生产[4~5]。

液态深层发酵培养蛹虫草菌主要受培养基组成及培养条件的影响，培养基内碳源、氮源和无机盐等物质的成分与含量，培养条件的变化及其各物质间的相互作用对菌丝体生长和产量都有直接影响。

因此，对蛹虫草菌优化培养不仅解决了野生虫草资源缺少的问题，也开发了其药用价值，对以后的人类生活产生重大意义。

本实验采用单因素法和正交试验法，对蛹虫草的液体培养基及培养条件进行了优化，目的是获得最大量菌丝体的培养基配方。

第二章文献综述

2.1蛹虫草简介

蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种[6]。

学名为Cordycepsmilitaris，又称为北冬虫夏草，野生资源稀少。

蛹虫草主要分为子座（即草部分）和菌核（即虫的尸体部分）两部分。

虫体外形较完整，体内充实如僵死的老蚕，表皮呈深黄色至黄棕色，背部有横皱纹，腹部有八对足，以中间四对较明显，头部三对不甚清楚，尾部一对隐约可见。

菌座细长，呈圆柱形，直立或稍弯曲，上部膨大，表面深棕色至棕褐色，带有不明显的纵皱纹，质地柔韧，端面内心空虚，呈粉白色[7]。

冬季幼虫居住在土里，部分菌类寄生在幼虫体内，从其中吸取营养，使幼虫体内充满菌丝导致死亡。

夏季从幼虫的尸体上生出幼苗，形状似草，夏至前后可采集得到。

中医认为，虫草主要入肾肺二经，既能补肾阳，又能补肺阴，是唯一的一种能同时调节、平衡阴阳的中药。

2.1.1形态特征

子座单个或数个从寄主头部或节部生出，颜色以橙黄色为主，一般不分枝，高3～5cm，子座头部呈棒状，表面粗糙，长1～2cm，粗3～5mm；子囊壳下部埋生于子座头部的外层，外露，近圆锥形；子囊线形，细长，大小为（400～300）um×（4～5）um，内含8枚线形孢子，粗约1um，孢子细长，几乎充满子囊，成熟时产生横隔，并断成2～3um的小段；子座柄部近圆柱形，内实心，长2.5～4cm，粗2～4mm[8]。

蛹虫草菌丝体由子座单个或数个一起从寄生的蛹体头部或节部长出，颜色为橘红或橘黄色，全长2～8mm，蛹体的颜色变为紫色，全长约1.5～2mm。

2.1.1.1菌丝体

蛹虫草的菌丝是一种子囊菌。

当菌体成熟即形成子囊孢子，孢子随风传播，一旦落在合适的虫体上，便开始侵入形成菌丝体。

菌丝体一边不断地发育，一边开始缓慢向虫体蔓延，导致蛹虫被真菌感染，菌丝体开始分解蛹体内的组织，吸收蛹体内的营养，为其生长发育提供足够的物质和能量，最后将蛹体完全分解。

2.1.1.2子实体

通常当蛹虫草菌丝将蛹体内的各组织器官完全分解后，菌丝体开始进入发育新阶段发育。

菌丝体由营养生长转为生殖生长，最后集结后从蛹体空壳的各部分伸出，形成呈棒状的子实体，一般为橘黄色或橘红色。

见图2-1.

图2-1蛹虫草子实体

2.1.2生长条件

蛹虫草主要生长在高寒区，高山雪线附近，常于海拔4000m以上的高山上出现，尤其多出现在积雪、排水良好的高寒草甸。

最适分布海拔高度为4200～4600m，下限是3000m，上限是5100m。

产区的平均气温为0.2～8℃，年降水量556.7～651.3mm，气候具有明显的干季和雨季。

在我国的分布主产于四川、西藏、青海、云南的高山、亚高山草甸区，近年在辽宁也有发现[6,9~11]。

蛹虫草的生长需要适宜的营养条件，包括碳源、氮源、无机盐以及维生素，还需要适宜的温度，水分以及光照，酸碱度等。

在菌丝生长过程和子实体成长过程需要不同条件，以保证生长最好。

2.1.3功能成分

蛹虫草含有多种生理活性物质，迄今已检测或分离到多种活性物质如虫草素、腺苷、虫草多糖、虫草酸、超氧化物歧化酶（SOD）以及矿物质元素等[12]。

（1）虫草素

虫草素又称虫草菌素，是Cuninghum等人于1951年从蛹虫草寄生的昆虫组织中分离得到的一种腺苷类活性物质，将其命名为虫草素，并确定其结构式为3′-脱氧腺苷[13~14]，虫草素分子式为C10H13N5O3，分子量为251，碱性，针状或片状结晶。

陈尚卫等研究证明蛹虫草中含有虫草素，蛹虫草子实体中虫草素的含量约为0.053%[15]；孙月等证明野生蛹虫草子实体中虫草素的含量略高于以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体中的虫草素含量，以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体中虫草素的含量高于其菌丝部位[16~17]。

通过多项研究表明，虫草素具有多种功效。

包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、清除自