自噬及其研究方式.docx

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自噬及其研究方式

自噬（Autophagy）及其研究方式概述

一、背景

概念:

目前依照发生进程分为三类：

Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediatedautophagyCMA）,大自噬（Macroautophagy）即咱们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：

是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成份的一种方式;分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediatedautophagy，CMA）：

一些分子伴侣，如hsp70，能帮忙未折叠蛋白转位入溶酶体。

通常说的自噬泛指Macroautophagy.

自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调剂蛋白，可是诱发阈值和门坎不同，如何转换和和谐目前还不清楚.自噬是指膜（目前来源还有争议，大部份表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部份胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。

自噬的步骤能够可能总结为下面四步:

步骤1：

细胞同意自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并非呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观看到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。

步骤2：

Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成份，包括细胞器，全数揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。

电镜下观看到自噬体是自噬发生的铁证之二。

有2个特点：

一是双层膜，二是内含胞浆成份，如线粒体、内质网碎片等。

步骤3

：

自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情形不是必然要发生的）。

步骤4：

自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞从头利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

自噬的特性：

1）自噬是细胞消化掉自身的一部份，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。

事实上，细胞正常情形下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。

这些诱发因素很多，也是研究的热点。

既有来自于细胞外的（如外界中的营养成份、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。

由于这些因素的常常性存在，因此，细胞维持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。

2）自噬进程专门快，被诱导后8min即可观看到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）大体降解消失。

这有利于细胞快速适应恶劣环境。

3）自噬的可诱导特性：

表此刻2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是预备时期。

第二是自噬体的快速大量形成，这是执行时期。

4）批量降解：

这是与蛋白酶体降解途径的显著区别

5）“捕捉”胞浆成份的非特异性：

由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是第一考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。

6）自噬的保守性：

由于自噬有利于细胞的存活，因此不管是物种间、仍是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来

自噬进程的调控：

从上面总结的自噬特点中能够看出，自噬这一进程一旦启动，必需在度过危机后适时停止，不然，其非特异性捕捉胞浆成份的特性将致使细胞发生不可逆的损伤。

这也提示咱们在研究自噬时必然要动态观看，任何横断面的研究结果都不足以评判自噬的活性。

目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白同意信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。

关于传递自噬信号的通路目前比较确信的有：

抑制类

1）ClassIPI3Kpathway（PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS（Insulinreceptorsubstrate）结合，同意胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）

2）mTORpathway（mammaliantargetofrapamycin）

mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506bindingprotein12-rapamycinassociatedprotein1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。

能同意多种上游信号，如ClassIPI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的转变,rapamycin是最典型最经常使用的自噬兴奋剂.

激活类

1）ClassIIIPI3K

结构上类似于ClassIPI3K，但作用相反。

3-MA是ClassIIIPI3K的抑制剂,因此3-MA能够作为自噬的抑制剂.

二、自噬的研究方式：

汉恒生物已开发并完善了多套自噬相关的研究体系和工具,并积存了丰硕的自噬研究体会。

正常培育的细胞自噬活性很低，不适于观看，因此，必需对自噬进行人工干与和调剂，经报导的工具药有：

（一）自噬诱导剂

1）BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin：

模拟内质网应激

2）Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride（氯化锂）：

IMPase抑制剂（即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶）

3）Earle's平稳盐溶液：

制造饥饿

4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：

ClassIPI3KPathway抑制剂

5）Rapamycin：

mTOR抑制剂（这是最经常使用的）

6）XestosponginB/C：

IP3R阻滞剂

（二）自噬抑制剂

1）3-Methyladenine（3-MA）：

（ClassIIIPI3K）hVps34抑制剂

2）BafilomycinA1：

质子泵抑制剂

3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）

除选用上述工具药外，一样还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干与：

包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株挑选、外源基因导入等。

细胞经诱导或抑制后，需对自噬进程进行观看和检测，经常使用的策略和技术有：

1）观看自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，一般光镜下看不到，因此，直接观看自噬体需在透射电镜下。

Phagophore的特点为：

新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成份的趋势。

自噬体（AV1

）的特点为：

双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成份，如线粒体、内质网、核糖体等。

自噬溶酶体（AV2）的特点为：

单层膜，胞浆成份已降解。

（autophagicvacuole，AV）

2）在荧光显微镜下采纳GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成：

（经常使用）

GFP-LC3单荧光指示体系：

由于电镜耗时长，无益于监测（Monitoring）自噬形成。

咱们利用LC3在自噬形成进程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：

无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个敞亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，能够通过计数来评判自噬活性的高低。

汉恒生物已开发出高效的评判用GFP-LC3病毒载体，通过瞬时高效感染细胞，配合活细胞工作站成功评判自噬流。

双荧光指示体系：

汉恒生物科技（上海）已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒产品。

mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性灵敏，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,现在只能检测到红色荧光。

咱们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge

后显现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数能够清楚的看出自噬流的强弱。

如以下图:

细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处置2小时后显现明显增强的自噬和自噬流。

3）利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的转变以评判自噬形成（LC3抗体购自sigma，L8918）。

自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变成（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估量

自噬水平的高低。

（Note：

LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。

方式2和3

需结合利用，同时需考虑溶酶体活性的阻碍。

）

4）利用WesternBlot检测p62蛋白来评判自噬和自噬流的强弱:

起初自噬所降解的底物被以为是随机的,可是后来的研究说明有些蛋白是seletively降解的,在这些蛋白当中研究的最为透彻的是蛋白p62,p62isselectivelyincorporatedintoautophagosomesthroughdirectbindingtoLC3andisefficientlydegradedbyautophagy;thus,thetotalcellularexpressionlevelsofp62inverselycorrelatewithautophagicactivity.（p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系）

三、自噬与肿瘤的关系：

与凋亡（在肿瘤细胞中一样都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。

不管是肿瘤细胞仍是正常细胞，维持一种基础、低水平的自噬活性是相当重要的。

因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这要紧靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；若是将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并显现神经元退化。

同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供必然的能量和合成底物，能够说，自噬确实是一个“备用仓库”。

如Atg-5缺点的小鼠在诞生后喝上第一口奶之前就会饿死。

更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，有利于细胞的存活。

鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大益处：

1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞离开原发灶游走时等都会显现营养不足或供给中断，而现在提高自噬活性能够有助于度过这一危机。

2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成份，而现在提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供给急的底物和能量为修复受损DNA博得时刻和条件.由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机遇，而关于肿瘤细胞群体而言，需要一部份细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。

研究发觉，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会增进坏死），但具体机制尚不清楚。

自噬与肿瘤的关系可能是双重的。

①对不同的细胞，自噬的作用可能不同。

②相同的细胞在不同的外部因素作历时，自噬的作用可能不同。

③在肿瘤发生进展的不同时期，自噬的作用可能不同。

肿瘤生长的初期时期自噬增强，是由于现在肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。

肿瘤进入进展时期后基因变异积存，使包括Beclin1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。

④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。

自噬功能不全的细胞易于坏死，可是坏死组织产生的细胞因子（包括部份生长因子）反而会增进肿瘤的生长。

上述各类假设均有待证明。

肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已取得确信，但自噬在肿瘤细胞的分化抑制进程中起着什么样的作用，自噬水平提高是抑制分化乃至致使去分化仍是增进分化等问题尚未解决。

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