试验真菌和细菌的分离培养和鉴定病理学研究方法.docx

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试验真菌和细菌的分离培养和鉴定病理学研究方法

草地保护学实验指导

草业科学和农林经济管理专业使用

（修订版）

兰州大学

草地农业科技学院

草地保护研究所编写

2012年3月

目录

目录I

说明II

实验一、草地植物病害症状观察（肉眼直接观察）1

实验二、草地植物病原菌主要类群及其形态观察（借助显微镜观察）4

实验三、真菌和细菌的分离、培养和鉴定（病理学研究方法）6

实验四、昆虫外部形态、变态和虫态观察（昆虫形态学和生物学）8

实验五、昆虫主要类群观察1（直翅目、鞘翅目、鳞翅目、膜翅目）（昆虫分类学）10

实验六、昆虫主要类群观察2（半翅目、同翅目、缨翅目、双翅目、蛛形纲中的蛛目和蜱螨目）（昆虫分类学）11

实验七、种子健康检验（人工检查、洗涤法、PDA培养）12

实验八、草地植物病害的早期诊断技术和昆虫饲养与鉴定（榆中校区病虫普查）15

实验九、榆中校区草地植物病害调查18

实验十、榆中校区害虫调查20

实验十一、啮齿类动物外部形态观察22

实验十二、啮齿类动物的内部构造解剖观察25

参考文献28

说明

一、总体目的：

通过亲自观察，增加对草地有害生物的感性认识，达到认识有害生物的目的；掌握相关研究方法；通过实践环节，将理论知识转化为实践技能。

二、实验要求：

实验指导每人1份或2人1份；实验前阅读实验指导，熟悉实验内容；认真听取老师的讲解；根据实验内容，参考教材或相关资料，亲自观察、动手操作，完成实验报告。

每班由班长和学习委员负责，每组由组长负责统一领取实验器材，实验结束后统一收缴，破坏或丢失责任自负。

严格考勤，缺席者无本次实验成绩，实验成绩统一计入学期总成绩。

不迟到、不早退。

实验台卫生由每组自己完成，实验结束后，将桌面收拾整齐，拔掉显微镜和解剖镜光源，清洗培养皿、烧杯、载玻片、盖玻片等玻璃器材，整齐晾于实验台上，经指导老师同意后离开。

实验室地面、超净工作台和水槽等处的卫生由班级统一安排（每次1个组，共5组），完成后请实验室管理员验收。

对于未履行职责的小组，多安排1次卫生清理任务。

三、学时分配：

共12个实验，每实验3学时，总计36学时，其中病虫部分30学时，啮齿类动物6学时。

四、时间安排：

共开设6周（第5周~第10周），每周6学时。

五、指导老师的职责：

实验操作讲解与示范。

六、实验辅助人员的职责：

实验准备、操作示范和学生管理。

实验一、草地植物病害症状观察（肉眼直接观察）

一、目的要求

植物病害症状是诊断植物病害的主要依据之一。

诊断病害是病害研究的最基本内容。

植物病害症状要根据病害的发生过程加以全面描述和记载。

认识植物病害的各种症状，为病害诊断打好基础。

二、仪器及用具

解剖镜、扩大镜、镊子

三、实验材料

苜蓿锈病、沙打旺白粉病、红豆草匐柄霉轮纹病（Onobrychisviciifola）、矮柱花草炭疽病（Colletotrichumtuifolii）、苏丹草云纹病（Rhynchosporiumsecalis）、赖草香柱病（Epichloetyphina）、老芒麦秆锈病（Pucciniagraminis）玉米大斑病、小麦根腐病、小麦秆锈病、小麦叶锈病、小麦黄矮病、小麦粒线虫

四、内容与方法

1、用肉眼观察各类植物病害的蜡叶标本，或在体视显微镜下或用放大镜观察，根据症状的特点，描述病害症状。

植物侵染性病害

植物真菌性病害标本（植物病害中90％为真菌性病害）：

病状和病征：

所有植物病害均有病状，即植物的异常生长或叶、茎、花、穗、果等器官的变色、斑点、坏死、腐烂等。

真菌性病害也不例外，而且通常可见病征，即病原真菌本事。

病征是鉴定病害最可靠的依据，而病状没有特异性。

真菌性病害的典型病征为：

粉状物（白粉病的无性孢子、锈病的夏孢子堆和冬孢子堆）、霉状物（各类各色霉层）、颗粒状物（分生孢子器、菌核等）。

苜蓿霜霉病（Peronosporaastivalis）

苜蓿黑茎病（Cerosporadavisii）

苜蓿锈病（UromycesstriatusSchroot）

猫尾草霜霉病（Sclerophthoramacrospora）

猫尾草长蠕孢叶斑病（Helininthosporumsativum）

草木樨夏季黑茎病（Cercosporadavisii）

草木樨白粉病（Erysiphepolygoni）

红豆草匐柄霉轮纹病（Onobrychisviciifola）

老芒麦秆锈病（Pucciniagraminis）

矮柱花草炭疽病（Colletotrichumtuifolii）

苏丹草云纹病（Rhynchosporiumsecalis）

赖草香柱病（Epichloetyphina）

植物细菌性病害标本：

病征为菌脓、菌溢、菌痂，病状为萎蔫、叶斑等。

植物病毒病害标本：

无病征，病状为花叶、矮化、黄化等

寄生性种子植物：

病征即为寄生性种子植物本身，病状为：

寄主植物生长不良，叶片变黄

植物非侵染性病害（生理性病害）：

缺素症、沤根、冻害等

害虫造成的为害称为害状，不属于病害，区别咀嚼式口器和刺吸式口器的害虫造成的害状。

人为和动物造成的伤害也不属于病害。

观察并掌握各种病害标本的病状类型的特点。

1、病状类型

1.1变色chlorosis，病毒病

1.2坏死necrosis，各类叶斑病

1.3腐烂rot，各类根腐病

1.4萎蔫wilt，沙打旺黄矮病

1.5畸形distoration，包括丛枝、矮化、徒长、肿瘤、叶片畸形

2、病征类型

2.1絮状物腐霉

2.2霉状物如青霉、灰霉、赤霉、霜霉等，主要有真菌的菌丝体和孢子梗组成。

霜霉病

2.3粉状物白粉病

2.4锈状物锈病、白锈病

2.5点粒状物白粉病的有性阶段闭囊壳、菌核、

2.6脓状物细菌性病害

2、植物病害的描述与记载常识

症状描述和记载根据：

发病部位、病斑大小、病斑颜色等。

采集的病害标本要压制成蜡叶标本，并注明：

寄主、病害名、病原、采集时间、采集地点、采集人等。

五、实验作业

分别列出5种病害的病征和病状

受害植物－寄主

病害名称

发病部位

症状类型

症状特点（病状，有病征则写出病征特点）

病害1

病害2

病害3

病害4

病害5

实验三准备：

实验接受后每组清洗培养皿30套、200～250ml三角瓶4个，晾于桌面，待下次使用。

实验辅助人员准备马铃薯3斤。

实验二、草地植物病原菌主要类群及其形态观察（借助显微镜观察）

一、目的要求

了解植物病原真菌和病原细菌，以及线虫和寄生性种子植物种类。

重点观察植物病原真菌的形态特征。

二、仪器及用具

显微镜、解剖镜、载玻片、盖玻片、蒸馏水、解剖刀、扩大镜、镊子、纱布、单面刀片及记载用具

三、实验材料

1真菌性病害：

1.1霜霉病：

16猫尾草霜霉病、25小麦霜霉病、39黄瓜霜霉病、大豆霜霉病、马铃薯晚疫病、甘蓝霜霉病、萝卜白锈病、莴苣霜霉病

1.2子囊菌病害：

6沙打旺白粉病、34梨树白粉病、35苹果白粉病、41黄瓜白粉病、小麦全蚀病

1.3担子菌病害：

2披碱草黑穗病、17玉米丝黑穗、玉米瘤黑粉病、谷子黑穗病、高梁散黑穗病、高梁坚黑穗病、20小麦散黑穗病、21小麦秆黑粉病、22玉米黑粉病、23燕麦坚黑穗病、12苜蓿锈病、15老芒麦秆锈病（Pucciniagraminis）、19小麦秆锈病、50小麦叶锈病、小麦条锈病

1.4半知菌病害：

1草木樨夏季黑茎病、3矮柱花草炭疽病（Colletotrichumtuifolii）、4苏丹草云纹病（Rhynchosporiumsecalis）、5赖草香柱病（Epichloetyphina）、7蚕豆赤斑病、8猫尾草长蠕孢病害、9蚕豆轮纹病、10蚕豆褐斑病、11红豆草匍柄霉轮纹病、14苜蓿黑茎病18玉米小斑病、24小麦黄矮病、26小麦根腐病、27莴苣霜霉病、28谷子白发病、29莴苣锈病、30赖草褐斑病、31高梁坚黑穗病、32杨树白粉病、33苹果腐烂病、37苹果褐斑病、40番茄叶霉病、42西葫芦黄萎病、43茄子早疫病、44芹菜斑枯病、45甜菜褐斑病、46番茄早疫病、49玉米大斑病、51红豆草轮纹病（Onobrychisviciifola）、

2细菌性病害：

47柑桔溃疡病、玉米茎基腐病

3病毒性病害：

36苹果花叶病、38辣椒花叶病、玉米病毒病、大豆花叶病

4线虫病：

48小麦粒线虫、

5寄生性种子植物：

13苜蓿菟丝子、

四、内容与方法

做水装片，观察以下病害的病原特征

1黑粉菌的观察－高龄黑穗病

2锈菌的观察－小麦锈病，蚕豆锈病

3白粉菌的观察－梨白粉病

4霜霉菌的观察－黄瓜霜霉病，莴苣霜霉病

5半知菌的观察－芹菜斑枯病（分生孢子器）、番茄早疫病（分生孢子丛）

6子囊菌的观察－白粉病的有性阶段

6线虫的观察－小麦粒线虫

7寄生性种子植物的观察－苜蓿菟丝子

8细菌菌落和形态观察

五、实验作业

绘出5种真菌性病害的病原特征图

实验三准备：

实验开始时同时准备下次实验，每组派2名同学，全班制作PDA培养基3000ml，准备无灭菌水2000ml。

实验三、真菌和细菌的分离、培养和鉴定（病理学研究方法）

一、目的要求

通过对某些植物病原菌的分离培养的实验操作，初步学会一般的植病技术，为进一步鉴定病原，从事植物病理研究和生产微生物农药打基础。

二、仪器及用具

1灭菌室、超净工作台、培养箱、电炉、天平、烧杯、量筒、培养皿、高压灭菌器、试管、三角瓶、漏斗、接种针、接种环、解剖刀、镊子、解剖剪、载玻片、盖玻片、挑针、纱布、瓶塞用的棉花、玻璃铅笔、酒精灯、滴管、滤纸

2马铃薯、琼脂、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖或蔗糖

3酒精、蒸馏水、升汞或漂白粉

4分离用的真菌和细菌病害标本，供接种试验用的盆栽幼苗、菌种和病菌孢子粉、滑石粉

三、实验材料

真菌性病害－九转梅枝枯病（立枯丝核菌Rhzoctoniasolania）（新鲜标本）

沙打旺黄矮根腐病侵染的茎秆（沙打旺埃里砖格孢Embellisiaastragali）（腊叶标本）

红豆草黑秆病（校园采集的新鲜标本）

葱紫斑病（链格孢Alternariaalternata）（腊叶标本）

细菌性病害－黄瓜细菌性角斑病（细菌）（腊叶标本）

种子分离－沙打旺种子（多种种带真菌）

四、内容与方法

1玻璃器皿洗涤与灭菌

2载玻片、盖玻片的洗涤

3培养基的配制

3.1培养真菌常用的PDA配方：

马铃薯200g削皮切成小块，加水1000ml，煮沸30min，纱布过滤

加葡萄糖20g，琼脂17～20g，加足水总量至1000ml

分装在三角瓶试管中封口灭菌（121℃，30min）

分装在培养皿中，每皿10ml

3.2培养细菌常用的牛肉汁蛋白胨培养基配方：

牛肉浸膏5g蛋白胨5～10g食盐5g溶于1000ml水中

调节酸碱度到中性

加琼脂17～20g，融化后分装在试管或三角瓶中灭菌

分装在培养皿中

3.3分离培养

组织分离法（分离真菌常用方法）

病原材料的选择（非专性寄生菌，病健交接处）

组织表面消毒（70%酒精数秒，1%的NaClO2～5分钟，无菌水冲洗3～4遍）

用滤纸吸干无菌水

切成小块（2～3mm的组织块每皿5块）

置培养皿中，22～25度下的培养箱中培养

稀释划线分离法（分离细菌常用方法）

1ml的培养皿中加入1接种环从病组织中挤压出的细菌悬浮液，先用接种环蘸菌液在培养皿中划平行的5条线，再与此5条线垂直