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橄榄醋中黄酮的提取工艺研究

摘要…………………………………………………………………………………………….1

关键词………………………………………………………………………………………….1

1引言…….2

2试验材料与仪器2

2.1主要材料与试剂…………………………………………2

2.2主要仪器2

3实验方法3

3.1芦丁标准曲线制备3

3.1.1标准液的制备:

3

3.1.2标准曲线的制作:

3

3.2制备橄榄醋方法初试4

3.2.1筛选制备橄榄醋的最佳浸泡天数4

3.2.2筛选制备橄榄醋的最佳物料比4

3.3提取橄榄醋中黄酮单因素实验设计4

3.3.1确定最佳提取温度4

3.3.2确定最佳提取时间4

3.3.3确定最佳乙醇浓度5

3.3.4确定最佳料液比5

3.4正交实验设计5

4结果分析5

4.1橄榄醋制备工艺5

4.1.1筛选制备橄榄醋的最佳浸泡天数实验结果5

4.1.2筛选制备橄榄醋的最佳物料比实验结果6

4.2醋泡橄榄中黄酮含量相关单因素实验结果6

4.2.1提取温度实验结果6

4.2.2提取时间实验结果7

4.2.3乙醇浓度实验结果7

4.2.4料液比实验结果8

4.3正交实验结果9

5论文结论10

摘要:

青橄榄的营养丰富，内含黄酮等多种抗氧化物质，具有良好的延缓衰老的作用，而醋作为良好的溶剂，能有效溶解橄榄中的营养物质，包括橄榄中的矿物质，黄酮等抗氧化物质，加上食醋本身对于人体有帮助胃消化的作用，有利于橄榄中抗氧化物质的消化吸收，两者相辅相成，本实验通过研究对橄榄醋中黄酮提取的优化，优化橄榄醋中黄酮的提取，通过单因素初步探索了橄榄醋的制备工艺，再通过超声辅助提取橄榄醋中黄酮的含量。

设定单因素考察提取时间、提取温度、乙醇浓度、料液比等单因素条件对醋中黄酮的提取率的影响，最后采用正交试验优化提取条件，筛选出最优的橄榄醋中黄酮的提取条件，结果表明：

最佳微波提取工艺为:

即提取温度为45℃，提取时间为25min，乙醇浓度为55%，料液比为1：

3,总黄酮提取率可大于8%。

关键词:

青橄榄;醋;黄酮;抗氧化;优化提取

Abstract：

Olivenutritionisrich,itcontainsflavonoidsandotherantioxidants,hasgoodanti-agingeffect,andvinegarasagoodsolvent,caneffectivelydissolvenutrientsinolives,includingoliveinminerals,antioxidantssuchasflavonoids,addthevinegaritselfishelpfulforhumanbodystomachdigestion,conducivetodigestionandabsorption,majoramountsofantioxidantsinolivebothsupplementeachother,thisexperimentbystudyingtheoptimizationofolivevinegarextractmediumyellowketone,optimizeoliveextractmediumyellowketone,vinegarbysinglefactorpreliminaryexplorethepreparationtechnologyofolivevinegar,olivevinegarbyultrasonicassistedextractionmediumyellowketonecontent.Setsinglefactorextractiontime,extractiontemperature,ethanolconcentration,solid-liquidratioandothersinglefactorconditionsinfluenceonvinegarextractionyieldofmediumyellowketone,finallyUSEStheorthogonalexperimenttooptimizetheextractionconditions,selectthemostoptimalolivevinegarmediumyellowketoneextractionconditions,theresultsshowedthatthebestmicrowaveextractionprocessis:

theextractiontemperature45℃,timeof25min,ethanolconcentrationis55%,andsolid-liquidratioof1:

3,flavonoidsextractionyieldcanbegreaterthan8%.

Keywords:

Greenolives；vinegar；flavonoids；antioxidant；optimizetheextraction

1引言

橄榄树不仅是著名的亚热带果树，而且其果实橄榄营养价值丰富[1]，又具有多种活性物质，在唐朝就被列为贡品，是我国卫生部首批公布的药食两用物种之一[2]，对于人体有延缓衰老、抗氧化[3]、抗菌[4]、消炎[5]、降火、抗HIV[6]、防止癌症[2]、生津止渴，醒酒安神，抗糖尿病[2]等多种作用，可以生食或泡着喝，故日益受到人们的关注。

青橄榄属于橄榄科橄榄属的乔木植物。

青橄榄一般长为2-3厘米，形状为椭圆形至纺锤形，果子一般为绿色或者墨绿色，其营养丰富，尤其是维生素和铁、钙等矿物质元素含量丰富，表面呈不规则皱纹或光滑，果肉质地较硬，内有硬核，两端稍尖，果子一般在10-12月间成熟，橄榄一般产于中国的南方，中国福建福州闽侯县有种植，种植有大片橄榄，有“中国橄榄之乡”的称号，其叶子一年四季常绿。

永春老醋又名为乌醋或者福建红曲醋，由于其发展历史悠久，不添加食盐和防腐剂，含有氨基酸和多种营养物质和对人体有益的微生物，色香味俱佳，酸中带甘，能长期保存，可以消除疲劳，美容养颜、滋润和清洁皮肤，帮助胃消化，杀伤致病菌，降血压和抑制癌细胞的扩散，是很好的调味品，其凭借着其独特的风味和丰富的营养价值，成为全国四大名醋之一，享誉海内外。

原料为糯米、芝麻、红粬等，它的发酵过程是有关的微生物（如红曲霉、醋酸菌、酵母）在一定适宜的条件下（如温度、生物素、湿度、浓度、卫生），其生长繁殖所产生的催化剂（酶）促进有机物分解、合成生物化学反应的过程[7]。

黄酮类化合物是广泛存在于自然界中的一大类化合物,主要分布于植物中,具有生理药理活性[8]具有一定的活血化瘀、降血脂、降血糖和提高免疫功能的作用[9]、抗癌作用[10]。

抗炎,以及作为植物抗毒素[11]的作用，黄酮类化合物的传统提取方法有碱性水提取法、醇提取法、其它有机溶剂提取法等[12]，本文以闽侯青橄榄与永春老醋为原料，以微波提取的方式通过实验研究橄榄醋中黄酮的提取工艺优化，通过设定不同的单因素初步探索了橄榄醋的制备工艺，又通过设定不同单因素考察提取时间、提取温度、乙醇浓度、料液比等条件对醋中黄酮的提取率的影响，最后采用正交试验优化提取条件，筛选出最优提取条件。

2试验材料与仪器

2.1主要材料与试剂

闽侯青橄榄、永春老醋、芦丁标品标准品（购自南京建成）、NaNO₂、Al（NO3）3、NaOH、FeSO4、H2O2、乙醇、三羟甲基氨基甲烷、水杨酸、邻苯三酚，所有的化学品和溶剂均为分析纯。

2.2主要仪器

名称

型号

产地

电子天平

TX223L

日本岛津国际贸易有限公司

台式离心机

TG16

上海卢湘仪离心机有限公司

粉碎机

YC-02A

上海旭曼机电有限公司

超声波清洗器

KQ-500VDE

昆山舒美超声仪器厂

紫外可见分光光度计

A1900S

上海谱源仪器有限公司

3实验方法

3.1芦丁标准曲线制备

3.1.1标准液的制备:

确称取芦丁1mg，105℃干燥至恒重，加70%乙醇适量，置水浴中加热溶解放冷，以70%乙醇定容至10ml，摇匀，得到终浓度为0.1mg/mL的芦丁标准液。

5%NaNO₂：

称取分析纯NaNO₂5g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，当天配制。

10%Al（NO3）3:

称取分析纯Al（NO3）310g，用蒸馏水溶解并定容至100mL。

1mol/LNaoH：

称取分析纯NaoH4g，用蒸馏水溶解并定容至100mL。

3.1.2标准曲线的制作:

取0、1、2、3、4、5mL芦丁标准液于6只具塞试管中，加60%乙醇使成5mL。

加5%NaNO₂溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加1mol/LNaoH溶液4mL，加60%乙醇0.4mL，摇匀，放置10mim，因芦丁样品的最佳吸收波长在510nm处[13]，故以第一管为空白于510nm处测定吸光度。

以吸光度A为纵轴，芦丁标准液含量mg/mL为横轴做图得芦丁标准曲线，见下图1。

图1芦丁标准曲线

Figure1Rutinstandardcurve.

吸取1mL提取液置于具塞试管，按上述芦丁标准曲线绘制方法配制溶液，并以试剂空白为参比液调零，测取其吸光度记为，将其代入标准曲线得到提取液浓度C，按下面公式计算宗黄酮含量[14]：

Y（%）={[（C*V2）/V1*V0]/W}*100

C:

样液浓度（mg/mL）

V0：

样液定容后的体积（mL）

V1：

测定吸光度用样液的体积（mL）

V2：

测定时稀释体积（mL）

W：

称取样品橄榄叶粉重量（mg）

3.2制备橄榄醋方法初试

取闽侯青橄榄适量洗净，自然晾干后粉碎并过10目筛网备用。

3.2.1筛选制备橄榄醋的最佳浸泡天数

取橄榄粉末按照物料比1:

3（m/v）加入永春老醋浸泡不同的天数，制成橄榄醋之后，将浸提物至50mL离心管中于4000r/s离心5分钟取上清液，过滤去除杂质。

以50%的乙醇按照1：

3（v/v）于超声清洗器中提取橄榄醋中的黄酮，提取时间为10min,温度为30℃，设定浸泡时间分别为1天、3天、5天、7天、14天，通过比较黄酮含量确定最佳浸泡时间。

3.2.2筛选制备橄榄醋的最佳物料比

取橄榄粉末按照物料比分别为1:

4、1:

6、1:

9、1:

12、1:

15（m/v）加入永春老醋浸泡一定的时间。

此时间参照3.2.1的最佳时间来定。

浸泡结束后以50%的乙醇按照1：

3（v/v）于超声清洗器中提取橄榄醋中的黄酮，提取时间为10min,温度为30℃。

通过比较黄酮含量确定最佳浸泡时间。

在确定了最佳浸泡时间和最佳料液比后，以此条件来制备橄榄醋，供后面使用。

3.3提取橄榄醋中黄酮单因素实验设计

3.3.1确定最佳提取温度

按照3.2的结果筛选出的最佳浸泡物料比与最佳浸泡时间制备橄榄醋，取制备好的橄榄醋加入50%的乙醇按照1：

3（v/v）于试管中并借助超声提取，设定提取时间分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，提取时间为10min,超声完成后按照前面的方法测定橄榄醋中黄酮的含量，通过比较黄酮的含量确定最佳提取温度。

3.3.2确定最佳提取时间

在确定了最佳提取温度后，按照3.2与3.3.1所得结果，取制备好的橄榄醋加入50%的乙醇按照1：

3（v/v）于试管中，改变提取时间分别为10min、15min、20min、25min、30min，并分别测定各时间条件通过比较黄酮的含量确定最佳提取时间。

3.3.3确定最佳乙醇浓度

在确定了最佳提取时间后，按照上面实验所得结果，取制备好的橄榄醋加入50%、55%、60%、65%、70%，的乙醇按照1：

3（v/v）于试管中，并分别测定不同乙醇浓度条件通过比较黄酮的含量确定最佳提取乙醇浓度。

3.3.4确定最佳料液比

在确定了最佳提取乙醇浓度后，按照上面实验所得结果，取制备好的橄榄醋，乙醇（v/v）按照1：

2、1：

3、1：

4、1：

5、1：

6于试管中，并分别测定不同料液比条件下比较黄酮的含量确定最佳提取乙醇料液比。

3.4正交实验设计

根据3.3单因素实验结果选择影响显著的单因素并考虑因素间交互作用设计正交实验，从实验结果分析，选取最佳黄酮提取率的因素A组温度45℃、50℃，因素B组时间25min、30min，因素C组乙醇浓度50%、55%，因素D组料液比1：

2、1：

3做交互实验，以便选择最优提取条件，交互组实验见表1.

表1正交实验因素水平表

Table1FactorandleveldesignofL12（211）orthogonaltest

A

B

C

D

Level

温度/℃

时间

A×B

乙醇浓度

A×C

B×C

料液比

A×D

B×D

C×D

/min

1

45

25

50%

1:

02

2

50

30

55%

1:

03

4结果分析

4.1橄榄醋制备工艺

4.1.1筛选制备橄榄醋的最佳浸泡天数实验结果

通过单因素实验，不同浸泡天数对橄榄醋中黄酮含量的影响如图2所示，随着浸泡天数的增加，橄榄醋中黄酮的百分比含量呈上升趋势，并在14天的时候达到最大值，对整体的单因素做显著性分析，进行F检验，F=1.9810.05）。

图2不同浸泡天数橄榄黄酮含量

Figure2Thecontentofoliveflavonoidsindifferentsoakingdays.

4.1.2筛选制备橄榄醋的最佳物料比实验结果

通过单因素实验，不同浸泡物料比橄榄醋中黄酮含量的影响如图3所示，随着物料比比例的增加，黄酮提取的百分比含量呈上升趋势，并在1：

15时达到最大值，对整体的单因素做显著性分析，进行F检验，F=2.5470.05）。

图3不同提取物液比橄榄黄酮含量

Figure3Thecontentofdifferentextractswashigherthanthatofoliveflavonoids.

4.2醋泡橄榄中黄酮含量相关单因素实验结果

4.2.1提取温度实验结果

通过单因素实验，不同提取温度橄榄醋中黄酮含量的影响如图4所示，随着提取温度的增加，黄酮提取的百分比含量呈先上升后略有下降的反复趋势，温度在45℃时，提取率最高，选择45℃、50℃为正交单因素的水平。

对整体的单因素做显著性分析，经F检验，F=59.64167>F0.01（4,10）=5.9943，说明因素A对结果影响差异极显著（P<0.01）。

图4不同提取温度橄榄黄酮含量

Figure4thecontentofoliveflavoneindifferentextractiontemperatures.

4.2.2提取时间实验结果

通过单因素实验，不同提取时间橄榄醋中黄酮含量的影响如图5所示，随着提取时间的增加，黄酮提取的百分比含量呈上下大幅度波动的趋势，提取时间在25min和30min时，提取率最高，选择25min、30min为正交单因素的水平。

对整体的单因素做显著性分析，经F检验，F=3.6659>F0.05（4,10）=3.48，说明因素B对结果影响显著（P<0.05）。

图5不同提取时间橄榄黄酮含量

Figure5thecontentofoliveflavonoidsindifferentextractiontime.

4.2.3乙醇浓度实验结果

通过单因素实验，不同提取乙醇浓度橄榄醋中黄酮含量的影响如图6所示，随着提取乙醇浓度的增加，黄酮提取的百分比含量呈略有下降的趋势，提取乙醇浓度在50%和55%时，提取率最高，选择50%、55%为正交单因素的水平。

对整体的单因素做显著性分析，经F检验，F=78.0299>F0.01（4,10）=5.9943，说明因素C对结果影响差异极显著（P<0.01）。

图6不同提取乙醇浓度橄榄黄酮含量

Figure6thecontentofoliveflavonoidsindifferentethanolconcentrations.

4.2.4料液比实验结果

通过单因素实验，不同提取料液比橄榄醋中黄酮含量的影响如图7所示，随着提取料液比的增加，黄酮提取的百分比含量呈先上升后下降的趋势，提取料液比在1:

2和1:

3时，提取率最高，选择1:

2、1:

3为正交单因素的水平。

对整体的单因素做显著性分析，F=8.9784>F0.01（4,10）=5.9943，因素D对结果影响差异性显著。

图7不同提取物料液比橄榄黄酮含量

Figure.7contentsofdifferentextractmaterialswerecomparedwitholiveflavones.

经上分析，在考察的6个单因素中由于浸泡天数和物料比对橄榄醋的提取结果影响不显著，其余4因素对结果有显著性影响，故选择提取温度、提取时间、乙醇浓度、与乙醇的料液比为正交实验的四个因素，结合各图的单因素趋势图，设计如表Figure1L12（211）的因素水平表，选择浸泡提取黄酮百分比含量最高的时间14天和物料比1：

15进行实验。

4.3正交实验结果

表2不同因素对醋中黄酮类化合物含量的影响。

Figure2.EffectofdifferentfactorsonthecontentofflavonoidsinVinegaroliv

因素

A温度/℃

B时间/min

A*B

C乙醇浓度

A*C　

B*C

D料液比

A*D

B*D

C*D

空白

实验1

1（45）

1（25）

1

1（50%）

1

1

1（1:

2）

1

1

1

1

实验2

1

1

1

1

1

2

2（1:

3）

2

2

2

2

实验3

1

1

2

2（55%）

2

1

1

1

2

2

2

实验4

1

2（50）

1

2

2

1

2

2

1

1

2

实验5

1

2

2

1

2

2

1

2

1

2

1

实验6

1

2

2

2

1

2

2

1

2

1

1

实验7

2（50）

1

2

2

1

1

2

2

1

2

1

实验8

2

1

2

1

2

2

2

1

1

1

2

实验9

2

1

1

2

2

2

1

2

2

1

1

实验10

2

2

2

1

1

1

1

2

2

1

2

实验11

2

2

1

2

1

2

1

1

1

2

2

实验12

2

2

1

1

2

1

2

1

2

2

1

均值1

2.715

2.92

1.41

2.019

2.022

2.331

1.388

2.137

2.984

2.184

2.044

均值2

1.55

1.35

2.85

2.245

2.242

1.933

2.877

2.127

1.28

2.08

2.221

极差

1.165

1.57

1.44

0.226

0.22

0.398

1.489

0.01

1.704

0.104

0.177

表3显著因素的方差分析表

Table3Varianceanalysistableofsignificantfactors.

差异源

SS

df

MS

F

P-value

Fcrit

组间

19.89136

7

2.841622

1179.64

1.73E-20

2.657197

组内

0.038542

16

0.002409

总计

19.9299

23

由正交实验结果表2可以看出，各因素影响黄酮提取率的先后顺序为B*D＞B＞D＞A*B＞A＞B*C＞C，因为A*D与C*D的极差小于空白对照组，故不作为比较依据。

对整体的因素做显著性分析，F=1179.64>F0.01（4,10）=5.9943，对结果影响差异性显著，见表3。

最佳的提取工艺组合为A1B1C2D2，即提取温度为45℃，提取时间为25min，乙醇浓度为55%，料液比为1：

3，此组合不在正交实验当中，故按照此最优的实验组合方案，再做3个平行实验，实验结果平均值为8.6504%，所以此实验工艺结果具有一定的参考价值。

5论文结论

本实验以橄榄醋为原材料，微波提取的方式辅助提取橄榄醋中的黄酮，通过不同单因素初步探索了橄榄醋的制备工艺，通过对提取率的显著性分析，除去对黄酮提取率影响不显著的因素，保留对黄酮提取率影响显著的因素，设定单因素考察提取时间、提取温度、乙醇浓度、料液比等单因素条件对醋中黄酮的提取率的影响，采用正交试验优化提取条件，比较不同因素之间相互作用对黄酮提取率的影响大小，最后筛选出最优的橄榄醋中黄酮的提取条件。

参考文献

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