基因的克隆表达载体构建及功能验证.docx

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基因的克隆表达载体构建及功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）

一、基因克隆

★事前三问

a.克隆这个基因干什么？

它有什么功能？

b.这个基因在哪种材料中扩增？

c.材料需要怎么处理？

◎实验前准备工作

a.设计引物，准备材料，

b.购置试剂：

Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒

c.实验试剂及用具：

枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+、Kan+等抗生素准备

※基本流程

提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—

涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序

1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成

1.1叶片、根总RNA的提取

Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。

1）实验前准备

预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37℃过夜处理12h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理（直接购买）。

2）Trizol法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：

（1）提前在1.5ml离心管中加入1mlTrizol，然后将200mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15s，在15-30℃温育5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

（3）吸取上清液加0.2ml氯仿，盖好盖，用力摇15s，15～30℃温育2～3min。

（4）在≤12000g，4℃离心10min，样品分为三层：

底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

（5）将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30min。

（6）在≤12000g，4℃离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

（7）用≥1ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5min，弃上清。

（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10min使RNA溶解。

（9）配制以下体系：

10×DNasebuffer5μl

DNaseI（RNase-free）（40μg/μl）1μl

RNasinInhibitor（40μg/μl）1μl

TotalRNA70μg

加去RNase水至总体积为50μl

（10）37℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100μl，加入等体积氯仿抽提一次。

（11）取上清，加入10μl的3mol/LNaAC溶液，200μl的无水乙醇，-80℃沉淀30min。

（12）2～8℃，12000g离心10min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。

3）RNA的质量及纯度检测

（1）电泳检测取2ulRNA与1ul10×Loadingbuffer上样缓冲液混合均匀在1%的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA条带并记录实验结果。

（2）分光光度计RNA纯度检测

取1ulRNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/A280比值，估测RNA质量。

4）cDNA第一条链的合成

按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA：

1）在Eppendorf管中配制下列混合液：

试剂名称使用量

模板RNA1µg

OligodTprimer（50µM）1µl

dNTPMixture（10mM）1µl

RNasefreedH2Oupto10µl

2）65℃保温15min后迅速在冰上急冷2min。

3）离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。

4）在上述Eppendorf管中配制下列反转录反应液:

试剂名称使用量

上述模板RNA/引物等的混合液10µl

5×Frist-StandBuffer4µl

RNaseInhibitor（40U/µl）0.5µl

MTVRTase（10U/μl）0.5µl

RNasefreedH2Oupto20µl

5）37℃保温60min。

6）95℃,5min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。

1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取

（1）配制RNA抽提buffer，50ml中含有：

1MTris-HCl（PH9.0）2.5ml

4MNaCl1.5ml

10%SDS5ml

DEPC-H2O41.25ml

（2）取以上RNA提取液650ul，加350ul水饱和酚，放入1.5ml离心管中，65℃水浴预热。

（3）研磨0.3g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约10min。

（4）再加入400ul氯仿，抽提10min，12000rpm4℃离心10min。

（5）取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇10min，12000rpm4℃离心10min。

（6）取上清，加1/3体积的8M氯化锂，4℃保存过夜。

（7）离心10min，弃上清液，留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用无水乙醇洗5-10s，晾干，溶于80ulDEPC水中。

（8）加入9ulDNA酶（无RNA酶），10ul10×buffer（DNA酶所带）和1ulRasin（Rnas抑制剂），37℃30分钟（再加500ul水）

（9）取出用300ul氯仿和300ul苯酚抽提，摇10min钟，静止10min，12000rpm4℃离心10min。

（10）取上清，加入等体积的氯仿，摇10min，静止10min，4℃离心10min。

（11）取上清，加1/10NaAC（3M，PH5.2），再加2倍体积的预冷无水乙醇，-80℃冰箱过夜； 

（10）12000rpm离心15min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40ulDEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80℃，备用。

2.2.2.1cDNA第一条链的合成

（1）基因组DNA的去除反应

试剂使用量

5xgDNAEraserBuffer2.0ul

gDNAEraser1.0ul

TotalRNA5ul

RNaseFreedH2Oupto10.0ul

42℃2min

4℃10min

（2）反转录反应

试剂使用量

5xPrimeScript@Buffer2（forRealTime）4.0ul

PrimeScript@RTEnzymeMixI1.0ul

RTPrimeMix1.0ul

的反应液10.0ul

RNaseFreedH2Oupto20.0ul

37℃15min

85℃5sec

4℃10min-20℃保存备用

2.基因cDNA克隆

2.1基因片段的PCR扩增

以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系为20ul：

10×PCRBuffer2.0ul，2.5mMdNTPs1.6ul，10mM上下游引物各0.8ul，Taq酶0.3ul，模板cDNA1.0ul，ddH2O补足至20ul。

按照下列条件进行PCR扩增：

94℃4min

94℃30sec

50℃40sec30cycles

72℃1min

72℃10min

2.2PCR扩增产物的检测和回收纯化

PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶（含有0.5ug/ml溴化乙锭）上进行电泳，在紫外灯照射下进行观察，与标准分子量进行比较估测扩增DNA片段的大小，若与预计的大小相符，则使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：

1）在紫外灯下切下将要回收的条带（尽量使用长波长的UV），称重。

2）按每100mg琼脂糖胶加入300ul溶胶液PN，置于50℃水浴中10min，每隔2min混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2min。

3）将UNIQ-10柱放入2ml的收集管中，加入600ul平衡液BL，13000rpm，离心30sec。

3）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，静止2-3min，13000rpm，离心30sec。

4）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入700ul漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），13000rpm离心30sec。

5）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入500ul漂洗液PW，13000rpm离心30sec，重复一次。

6）取下UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中,13000rpm，离心2min。

7）将UNIQ-10柱放入一新的1.5mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加50ul预热70℃洗脱液EB，室温放置5min。

8）12000rpm，离心lmin，Ep管中液体即为回收的DNA片段，-20℃保存备用。

2.3回收产物与PMD-T载体的连接与转化

采用TAKARA公司的PMD-T载体进行连接反应，感受态细胞DH5a作为转化细胞进行转化。

具体操作步骤如下：

SolutionI、PMD18-T或19-T、DNA回收产物置于冰中溶解。

在0.2ml离心管中配制反应体系10ul：

PMD18-T载体0.5ul

SolutionI5ul

回收DNA产物4.5ul

混匀，16℃反应过夜（3h就可以）。

连接反应快结束时，从-80℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，将离心管置于冰上使之融化。

1）取5ul的连接产物加到50ul感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。

2）将离心管置于42℃水浴90s，间不要摇动离心管。

取出管后立即置于冰浴中放置2-3min，其

3）向离心管中加入600-900ulLB（不含抗生素）液体培养基，150r/min，37℃震荡培养60min。

4）吸取150ul已摇好的菌液涂布在含有Amp（终浓度50ug/ml）的LB固体培养基上，待液体完全被培养基吸收后，倒置平板，37℃，培养12-14小时。

2.4重组克隆的验证及序列测定

随机挑选5个左右单菌落于10ml含50ug/ml的LB液体培养基中，于恒温摇床37°C，180r/min震荡培养过夜，培养至菌液OD600为0.6～0.8，用天根的质粒小提试剂盒提取质粒。

也可按照下列步骤提取质粒：

1）将培养好的菌液倒入2.0ml离心管中，12000rpm离心1min，去掉上清液，再重复二次。

2）加入100ul预冷的溶液P1涡旋使充分悬浮，室温静止5min。

3）加入200ul溶液P2，同一方向缓慢匀速转动离心管使溶液混合均匀，置冰上5min。

4）加入150ul溶液P3，同一方向缓慢匀速转动离心管使内含物在溶液中分散均匀，置冰上5min。

5）12000rpm，离心10min，取上清，用等体积的苯酚和氯仿:

异戊醇（24:

l），各抽提一次。

6）12000rpm，离心3min，取上清。

7）向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃，放置30min，12000rpm，离心10min。

8）弃上清，加入lml75%乙醇，洗涤沉淀，12000rpm离心3min，弃上清，自然晾干。

9）每管中加入30ulTE（pH8.0）buffer和1μlRNase（10ug/ul），37℃水浴30min溶解质粒DNA,-20℃贮存备用。

溶液的配制：

SolutionI:

葡萄糖50mM;EDTA（PH8.0）10mM;Tris-Hcl25mM

SolutionII:

NaOH0.2M;SDS1%（现用现配）

SolutionIII:

乙酸钾60mM;冰乙酸11.5ml;ddH2O28.5ml

采用上文中的P1、P2特异性引物以质粒为模板进行PCR扩增，扩增结果与RT-PCR相同的质粒为验证的阳性质粒，由华大基因工程有限公司进行序列测定。

二、植物转化表达载体的构建

★事前三问

a.构建什么载体（过表达，干扰？

还是别的）？

酶切位点有哪些是可以用的？

怎么用方便？

b.载体的细菌抗性和筛选抗性分别是什么？

c.准备转到哪种材料里？

用什么方法转？

◎实验前准备工作

a.选择一个合适的表达载体

b.酶切位点选择：

用DNAMAN中的Restriction-RestrictionAnalysis分析待插入基因中包含的酶切位点，避免使用基因中已有的酶切位点。

剩下的酶切位点的选择依据的原则为：

方便（酶反应温度、Buffer一样，可以双酶切）、快捷（可以省时酶切）、便宜。

c.设计带酶切位点的引物

d.购置试剂：

高保真酶或LATaq酶、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA连接试剂盒等

e.实验试剂及用具：

枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+、Kan+等抗生素

※基本流程

a.过表达载体

酶切#：

如果两个酶可以同时酶切，就直接双酶切；如果不能，按以下方法进行以NcoI和BstEII为例和：

1）取一灭菌的200ul的离心管按顺序依次加入：

10×Buffer2ul

NcoI1ul

Plasmid2-3ul

ddH2O补足20ul

2）混匀，37℃水浴3h，再向管中加入2倍体积的无水乙醇，4℃放置1h，12000rpm离心10min，75%的酒精洗涤一次，晾干，再向离心管中分别加入：

10×Buffer2ul

BstEII1ul

ddH2O17ul

3）混匀，60℃水浴3h后用1.2﹪的琼脂糖凝胶电泳检测，将所需要的目的片段在紫外光下切下来，用琼脂糖DNA回收凝胶剂盒回收纯化小片段。

同时用同样的方法酶切表达载体（如PCAMBIA3301），回收大片段。

b.RNA干扰载体的构建

三、功能验证

目前本实验基因的功能验证主要采取转基因的方法，常用的转基因方法有基因枪转化法和农杆菌介导法。

目前实验室做的是农杆菌介导法转化水稻。

下面把两种方法都介绍一下：

◎实验前准备工作

a.准备好诱导愈伤的材料（我们用农杆菌介导法转化小麦茎尖用豫麦34，转化水稻愈伤用kitake；用基因枪法一般用豫麦18）。

b.准备好配制各种组培培养基的试剂和药品。

c.准备好光照恒温培养箱。

※基本流程（农杆菌介导法转化水稻）

种子消毒诱导愈伤（30d左右）共培培养（3d）恢复培养（7d）

农杆菌转化重组载体

筛选培养（30d以上）分化培养（90d左右）移栽到花盆至成熟

§农杆菌介导法转化水稻

1.农杆菌感受态细胞的制备转化

1）取出-80℃保存的含农杆菌菌株EHA105的菌液冰上解冻，划线接菌于YEB固体培养基（含Rif50mg/L）中，28℃恒温培养2天。

2）挑取农杆菌EHA105单克隆，接种于10mlYEB液体培养基（含Rif50mg/L）中，于恒温摇床中28℃、200rpm/min培养1-2天。

3）在250ml的三角瓶中加入50mlYEP液体培养基及上述过夜培养物的菌液2ml，200rpm/min，28℃培养至OD600为0.5-1。

4）冰浴冷却菌液，4000rpm，4℃，5-10min离心收集菌体。

5）去上清，沉淀悬浮于1ml预冷的0.15mol/LCaCl2中，使细胞充分悬浮，分装成100μl/管，每管中加入100ul预冷的50%甘油，液氮中速冻后至-80℃保存。

6）每管加入约1μg构建好的质粒DNA，混匀冰上放置30min。

7）液氮中速冻1min。

8）迅速置于37℃水浴锅中，水浴5min。

9）加600ulYEP液体培养基，28℃，50rpm慢摇2-4h，使抗性基因得到表达。

10）于超净工作台上将菌液涂布于YEP固体培养基（含Rif50mg/L，Kan50mg/L），同时设置一个仅含抗生素的平板做对照。

11）于28℃恒温培养箱中2-3d后检测其生长情况。

12）挑取单菌落进行培养提取质粒，并且进行酶切鉴定。

附：

YEB培养基的制备

YEP液体（500ml）

YEP固体（500ml）

YEASTEXTRACT

5.0g

5.0g

TPYPTONE

5.0g

5.0g

BEEFEXTRACT

2.5g

2.5g

AGARPOWDER

0.0g

1.5g/100ml

灭菌：

121℃，20min

2．水稻基本培养基的配制

表2-1水稻基本培养基的配制

Table2-1Preparingtheminimalmediumofrice

单位：

mg/L

成份

N6-Pmedium

N6-ASmedium

N6-Rmedium

MS-Fmedium

N6saltmixture

MSsaltmixture

CoCl2·H2O

CuSO4·5H2O

NaMoO4·2H2O

Glycine

Myo-inositol

ThiamineHCI

Pyridoxine

Nicotinic

Proline

Casaminoacid

Sucrose

2,4-D

Sorbitol

Kinetin

NAA

Gelrite

pH

3,981

/

0.025

0.025

0.25

2

100

5

1

1

2,800

300

30,000

2

/

/

/

4,000

5.6

3,981

/

0.025

0.025

0.25

2

100

5

1

1

/

1,000

30,000

2

/

/

/

4,000

5.6

3,981

/

0.025

0.025

0.25

2

100

5

1

1

/

1,000

25,000

/

25,000

2

0.05

8,000

5.6

/

1,000

/

/

/

2

100

5

1

1

/

/

15,000

/

/

/

/

2,500

5.6

3.根癌农杆菌介导水稻转化

3.1种子消毒和愈伤组织的诱导

1）选取成熟饱满健康的水稻种子去壳后，75%的乙醇消毒1min，无菌水漂洗3次，用20％的次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水漂洗5次。

2）将种子种胚朝下放置到N6-P固体基本培养基上，28℃，光照（12h）/黑暗（12h），冷光条件下培养30天左右。

3.2农杆菌介导水稻转化

以农杆菌菌株EHA105为介导，分别将构建好的表达载体导入受体材料Kitaake，并获得相应的转基因植株。

水稻成熟胚遗传转化的基本流程为：

1）28℃培养以上含重组质粒的农杆菌16h，收集菌体，并稀释到含有100μmol/LAS的N6液体培养基中至浓度为OD600≈0.5；

2）将适量培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基中，24℃共培养3d；

3）将上述愈伤接种在含有3mg/LBialaphos（或潮霉素）的N6固体筛选培养基上第一次筛选16d；

4）挑取健康愈伤转入5mg/Lbialaphos的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15d继代一次；

5）挑取抗性愈伤转入分化培养基上进行分化培养；

6）待分化成苗的再生水稻植株长至20cm高时（约90d）开口炼苗3d，并移栽至温室栽培。

4．转基因植株的初步鉴定

4.1转基因水稻DNA的提取

按上述方法用CTAB法提取转基因水稻株系总DNA，并按顺序记号编号

4.2转基因植株的PCR检测

以提取的DNA为模板，用引物P1、P2进行PCR检测，同时用提取的重组质粒做阳性对照，以水和未转化的水稻kitaake为阴性对照，在1.0%琼脂糖凝胶电泳上检测目的条带是否存在，以确定转基因的个体。

5．外援目的基因的表达分析

为了检测外源性目的基因是否在转基因植株中转录表达，及其在组织部位的表达量，选取已鉴定为阳性植株的转基因水稻株系，在花后10d分别取根、茎、叶及未成熟胚乳总RNA，用Actin为内参，进行定量RT-PCR检测。

6．种子萌发实验

将经PCR鉴定的转基因株系种子（T1）收获后与同非转基因水稻品种在相同的条件下萌发实验，一周之后观察种子发芽情况。

为进一步研究该基因水稻种子萌发特性的变化及ABA和胁迫条件下的反应，选取经分子鉴定为稳定遗传的健康转基因种子（T2），50℃打破休眠，采用不同浓度的ABA溶液，以及75mmol/LNaCl和200mmol/L甘露醇溶液浸泡种子，观察记录其萌发。

§基因枪轰击法转小麦

1.培养基的配制

1）愈伤组织诱导及继代培养基

MS基本培养基＋2mg/L2,4-D＋30g/L蔗糖＋7g琼脂/L，pH为5.6-5.8。

在此培养基中，培养前两周附加0.5mg/LABA

2）高渗培养基

MS基本培养基＋2mg/L2,4-D＋0.4mol/L甘露醇＋30g/L蔗糖＋7g琼脂/L，pH为5.6-5.8

3）分化筛选培养基

MS基本培养基+1.0mg/LIAA+2.0mg/LZT+3-5mg/Lbialaphos+0.7%琼脂+3%蔗糖，pH5.6-5.8

4）生根筛选培养基

1/2MS基本培养基+0.5mg/LIAA+1-2mg/Lbialaphos+1.5mg/L多效唑+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH5.6-5.8

以上所有培养基均采用常规方法灭菌，选择剂Bialaphos及激素均采用过滤灭菌，培养基冷却至60℃左右时加入。

2.微弹的制备

称取50mg金粉（直径为1.0um）放入1.5ml离心管中，加入1ml96%的酒精充分振荡30s，使金粉充分散开，12000rpm离心1min，除去上清液，再加1ml96%乙醇重悬金粉，重复上述步骤3次。

至完全除去乙醇后，加入1ml无菌水制成浓度为50mg/ml的金粉悬浮液，用前吸取50ul金粉悬浮液至Eppendorf管中，加入质粒DNA5ul（1ug/ul），振荡混匀，再依次加入50ul2.5mol/L的CaCl2和20ul0.1mol/L的亚精胺（spermidine现用现配）溶液混匀，然后冰浴15min。

在12000rpm下离