生物芯片是现代微加工技术和生物技术.docx
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生物芯片是现代微加工技术和生物技术
生物芯片是现代微加工技术和生物技术
生物芯片是现代微加工技术和生物技
术
摘要:
生物芯片是现代微加工技术和生物技术的结晶，是具有一定生物功能的微晶片结构。
本文介绍在生命科学仪器中最常见的两种生物芯片，以及它们的制作过程、检测方法、用途和发展前景。
关键词:
生物芯片;进展;综述
生物芯片这一概念出现在上个世纪80年代初期，当时有人提出通过微电子技术和生物技术相结合，制作出具有生物活性的微结构的构想。
但是由于加工技术等相关科技手段的限制，直到90年代，生物芯片技术才取得长足的进步。
生物芯片是现代微加工技术和生物科技相结合的产物，是通过光刻或者生物分子自组装技术，在平板载体内部或者表面制作出的可以完成一定生物反应功能的微装置。
根据用途不同，生物芯片主要分为两大类，一类是生物电子芯片，用于生物计算机等生物电子产品的制造。
另一类是生物分析芯片，用于各种生物大分子，细胞组织的操作以及生物化学反应检测。
在生命科学仪器范畴讨论的通常是后面一类芯片，本文也只以这类芯片作为讨论对象。
生物分析芯片按功能微结构在载体上分布的不同又可以分为二维分析芯片和三维分析芯片。
二维分析芯片依赖固定在载体表面的生物分子完成生化反应检测。
最常见的二维芯片是二维阵列芯片（Microarray），包括基因芯片、蛋白芯片和其它微阵列芯片。
基因芯片是目前发展最为成熟的生物芯片，通过表面上固定的高密度DNA探针（现在单片基因芯片上的探针总数已达数十万个）与待测溶液中互补DNA片断的杂交反应来识别未知样品。
根据用途的不同，基因芯片又可以分为测序芯片，表达芯片等等。
三维芯片又称芯片实验室（1abOnachip，LOAC），是在载体内部加工微通道、样品池、反应仓、以及各种控制和检测元件的具有一定空间结构的微芯片。
三维芯片种类比较多，常见的有微电泳芯片、三维阵列芯片、PCR芯片等等。
二维芯片相对比较简单，容易加工，检测技术也比较成熟，现在已经逐步产业化。
三维芯片相对比较复杂，还主要处于研究阶段。
但是由于二维芯片通
常需要体积庞大的辅助检测工具，因而在芯片上可以整合控制和检测结构的三维芯片相对更有发展的空间。
最完整的芯片实验室可以完成样本的预处理、分离、稀释、混合、化学反应、检测以及产品的提取，它们也可以称为微全分析
μ-TAS）。
与传统的生物分析工具相比，生物芯片可以在载体表面集成成系统（
千上万的分子探针，在单一芯片中完成从样本的预处理、分离、稀释、混合、化学反应、检测到产物提取的全过程。
因而生物芯片可以大大提高检测速度和分析效率、减少样本试剂消耗、排除人为干扰、防止污染以及高度自动化。
1生物芯片的制作技术
1.1二维芯片的制作
二维芯片制作是在载体表面固定上生物分子阵列。
常用的载体是玻璃，也可以使用硅、塑料或者薄膜。
以二维DNA芯片的制作方法为例，通常DNA的固定方法有原位合成和微量点样两种。
原位合成主要是光引导寡核苷酸合成技术，是照相平板印刷术与传统的核酸固相合成技术相结合的产物，在经过处理的玻璃载片表面定点合成寡核苷酸链。
1991年，Fodor等首先利用光引导寡核苷酸合成技术在固相表面上原位合成了高密度寡核苷酸阵列。
这一方法的要点是首先在玻璃载片表面修饰光敏保护基团（X），然后通过掩膜使要反应部位受光产生活化的羟基。
加入3'端活化，5'端用（X）基团保护的脱氧核苷酸，在光照条件下与表面的活化基团反应。
清洗反应后的表面，利用第二个掩膜重复以上的过程，在不同的光照区域完成合成反应。
不断进行这样的光去保护和偶联反应循环，利用不同的掩膜得到设计的寡核苷酸阵列。
由于利用了照相平板印刷术这一精密的光学方法，该方法合成的探针阵列密度极高，分辨率可达10微米。
原位合成方法借鉴半导体芯片制作中的光刻方法，合成具有并行性和高效性，可以设计每个点的DNA序列，点密度较高。
缺点是工艺复杂，需要较多的掩膜，DNA的长度比较短，合成成本高，合成时间长，对设备要求高，较难推广。
微量点样是利用点样仪把制备好的cDNA片段喷射或者迅速接触滴加到衍生处理的玻璃载片表面。
与原位合成法的思路相反，微量点样方法是先合成探针分子，然后用高速阵列点样仪点样，形成微阵列。
该方法虽然产生的分子阵列密度没有光导原位合成法高，但它不仅可固定小片段核酸，还可固定长达500-5000个碱基的基因片段，甚至蛋白质等其它生物材料，因而用途更加广泛。
微
量点样的方式还可分为接触滴加和非接触式喷射两种。
接触滴加利用针头阵列在预先设定的样品阵列中蘸取样品，然后转移到芯片表面，与之接触后使DNA样品吸附和固定。
喷射方法在把吸入点样针管中的样品喷印到芯片表面。
相对来说，接触点样方法比较简单，成本也低。
喷射的优点是对精细表面无损伤且分配机制与片基表面性质无关。
1.2三维芯片的制作
相对而言，由于三维芯片的种类比较多，使用的材料和制作工艺也各有不同。
在三维芯片制作中最常用的是光刻和化学蚀刻联用的方法。
这种方法常用于硅、石英和玻璃等质地比较坚硬，韧性差的无机材料的加工中。
这种方法的主要过程是先在清洗干净或者表面处理过的玻璃等基底材料表面离心覆盖一层光刻胶，紫外光透过接触掩膜照射光刻胶进行曝光，接着用有机溶剂处理去掉曝光过的光刻胶，化学蚀刻去掉一定深度的无光刻胶保护的基底材料产生所需要的各种三维结构。
其优点是加工精度很高，可以得到微米水平的微结构。
但是缺点也相当明显，就是工艺比较复杂，设备要求很高，制作效率低，成本高。
另一种常用的三维芯片加工方法是软印刷术，它是一大类，包括所有的用于微结构成型的非蚀刻技术，这类方法广泛用于聚合材料的三维芯片制作中。
其中比较常用的是印刻法和微接触印制法。
两种方法的原理正好相反，印刻法是使被加工材料凹陷形成所要求的结构，而印制法是在基底材料表面结合上凸出的结构而达到设计要求。
早期印刻法使用小直径的金属丝在低温加热变软的塑料上压制成型。
通过这种方法得到的产品只限于简单的线性通道设计，但是造价低廉。
发展后的印刻法可以产生更复杂的微通道阵列，它先在硅片上蚀刻出微通道的凸版三维结构，然后在塑料上印制得到设计的微通道结构，模板可以多次重复使用。
通过这种方法，可以在大面积区域得到垂直通道壁的微结构，因而这是一种低成本大批量制作塑料微芯片的方法。
这种方法的最大优点就是成本低，效率高，但是加工精度不是太高。
微接触印制（μCP）方法使用平板橡胶印模将微结构浇铸到基底表面，这种方法有些类似于二维芯片的点样方法，只是滴加的是可以凝固的化学物质。
通过"墨水"的灌注，化学式样在平板橡胶印模表面成型。
印模干燥后置于基底表面，"墨水"与基底材料的分子间发生化学反应得到需要加工的结构。
这种方法可以产生高精度的微结构。
此外还有很多三维芯片的加工技术，包括机械切割、光刻（普通光、紫外光、激光、X射线）、反应离子蚀刻等。
这些加工方法有些精度比较低，有些设备要求高，工艺复杂，所以使用上限制比较多，只用于少数特殊的用途。
2生物芯片的检测技术
二维阵列芯片的检测技术相对比较单一。
最常用的就是生物分子荧光标记，标记了荧光的分子同芯片表面的分子结合，在光源的照射下发出一定波长的荧光。
测定结合后的荧光强度就可以推知结合分子的浓度。
通常待测样本和对照样本用两种不同的荧光进行标记，例如Cy3和Cy5。
比较同一位置的不同荧光强度，就可以测定待测样本和对照样本中与某一位点结合的分子比例。
杂交反应结果用荧光扫描仪进行检测。
荧光扫描仪有多种，如激光共聚焦扫描仪，CCD扫描仪，比较常用的是激光共聚焦扫描仪。
激光共聚焦扫描仪利用激光作为激发光，将视野中的两个聚焦点的影象装配为二维图象。
激光与其它光源相比具有比较明显的优点，强度高，单色，相干性好，不需要使用滤光器。
在激光共聚焦扫描中，平行的激光束通过光束分离器后进入物镜，通过物镜的激光束照射芯片表面激发荧光物质发射荧光。
荧光呈球状散射，通过物镜采集后成为平行的光束。
此外，芯片表面还反射部分激光，通常这些激光的强度要比荧光强度大数倍。
根据荧光激发的原理，发射光的波长一般要比激发光的波长大一些，这就可以通过让透镜选择性通过不同波长的光，得到所需要的发射荧光而除掉激发用的激光。
由物镜采集回来的光束再次通过光束分离器，光束分离器将大部分激光反射回激光源处，并允许大部分荧光束通过光束分离器。
平面镜将透射过光束分离器的光反射到发射光栅处，光栅在很窄的波长范围内选择性让荧光通过，并将剩余的激光激发光全部反射回去。
探测目镜把滤光后的平行荧光束聚焦为很小直径的一束。
缩小的光束照射到挡板上，挡板上的小孔只允许聚焦的光线通过并将其余的光遮挡住。
若发光点不在目镜焦点范围内，则光线将被探测目镜聚集于挡光板前而无法通过挡上的小孔。
因而芯片表面发射的大部分光线被遮挡了，只有焦点范围内的光线才能有效地进入挡光板的小孔被探测器检测到。
对焦距范围的严格限制使得灰尘或者邻近表面的其它小颗粒均不能成像被探测到，因而共聚焦扫描仪获得图象的信噪比要高于非共聚焦扫描装置。
当然，严格的聚焦也加大了对仪器加工精度的要求。
随着技术的提高，不断有新的激光共聚焦扫描技术用于二维芯片的研究，例如四激光的共聚焦扫描系统。
除了荧光标记方法，还可以使用其它标记手段，如同位素标记。
同样，根据二维芯片的特性，所有的表面检测方法都可以用于二维芯片的检测中，比较常用的就有表面等离激元显微镜、原子力显微镜、椭偏仪等。
这些方法通常不需要任何标记，但是精度和方便程度都有一定的欠缺。
相对二维芯片，三维芯片的结构就比较复杂，而且化学反应各异，用于三维芯片的检测手段也各有不同，
比较常用的有光学检测、电化学检测、质谱以及各种生物传感器。
2.1光学检测
光学检测的优点在于不需要检测装置直接与被测物质接触，但是可能会由于微通道的少量吸收产生干扰，因而需要较短的光路。
因此普通生化分析中常用的光吸收检测没有成为芯片实验室的主要检测手段。
取而代之的是高灵敏的荧光检测。
三维芯片的荧光检测同二维芯片的荧光检测方法非常相似，这里就不作过多介绍。
最近光吸收检测方法也有了长足的发展，各种辅助结构被置于微通道中以增加光吸收光路的长度。
但是，这也增加了微芯片结构设计的难度。
使用光吸收检测装置可以大大扩展微芯片样品的范围，而不仅仅限于荧光物质。
传统的光学检测装置一般都比较庞大，不可能整合到三维芯片当中。
但是由于光电子学的巨大发展，各种发光管和光电接收装置的微型化，使光学检测整合到芯片内部成为可能，这也是整个芯片真正演变为所谓的微全分析系统。
由于现在的微光电装置的精度还不可能太高，而且价格也相当昂贵，所以真正用于三维芯片检测的还为数不多。
2.2电化学检测
相对光学检测而言，电化学检测则更容易整合到三维芯片中而得到最完整的芯片实验室。
这种芯片不但可以在微通道中完成样品的全部操作，也可以把电化学检测直接置于单元中，几乎不需要别的外围辅助设备。
电化学检测存在的最大问题是如何避免检测电路和芯片控制电路之间互相干扰。
3生物芯片的典型应用
二维芯片表面固定有成千上万的生物分子，可以同时对比成千上万分子变化，通常用于检测和筛选等目的。
以最常见的基因芯片为例，利用基因芯片可以同时检测上万个基因的表达情况，比较不同生物体和同一生物体不同阶段和状态下基因表达的异同，可以发现在生物生长发育，疾病产生等的不同过程中的特异基因，从而揭示这些过程的独特机理。
基因芯片的用途有很多，例如基因诊断、基因测序、基因表达谱、药物筛选等等。
顾名思义，芯片实验室就是在一个整合的芯片上面可以完成通常生化试验室才能进行的全部生化反应和生化检测。
实际上这是一个相当困难的目标，现在的芯片实验室主要是完成一个或者几个功能。
比如常见的毛细管电泳芯片、PCR芯片、DNA微阵列芯片等等。
现在生物芯片的研究范围非常广泛，所取得的成果也非常多，也有很多综述文章，本文就仅举一些最新的研究成果作为例子。
3.1基因芯片
基因芯片利用互补的单核酸链的优先结合作为检测的基础。
无论芯片是通过什么方法制作的，这一基本原理都不会改变。
未知的样品与芯片表面的已知序列DNA分子杂交。
在载体表面给定的DNA阵列分布有成千上万的DNA探针，与传统的杂交方法不同，基因芯片一次可以鉴别成千上万个基因，这表明遗传分析可以在巨大的规模下进行。
这提供了一种研究细胞和组织中基因表达情况的革命性方法。
它可以确定给定细胞系在特定时间和特定条件下的表达情况，可以比较在不同细胞系或者组织样本中的基因表达差异。
比如比较健康和致病基因，细胞循环不同阶段或者胚胎发育时期的基因表达。
基因芯片是现在使用最为广泛的生物芯片。
cDNA芯片又是基因芯片中最常用的一种，常作为表达芯片和筛选芯片。
例如斯坦福大学的Stuart等人就利用基因芯片研究了Caenorhabditiselegans的基因表达谱。
基因表达谱的方法也可以用于肿瘤耐药性的研究。
耐药性是临床肿瘤治疗中常见的问题，严重影响治疗效果，探讨其发生的遗传分子机制，对指导临床用药及新药开发具有重要意义。
本中心汪进等人用人cDNA文库制备的含一万个基因的高密度芯片，比较了两组耐药细胞株及其药敏母细胞株（长春新硷诱导的多药耐药细胞株KB-V1与药敏母细胞株KB3-1，阿霉素诱导的多药耐药细胞株HepG2-DR与药敏母细胞株
HepG2）基因表达的差异，显示耐药细胞株存在Pgpl，ABCB4，CGA及ID1等10余个基因表达的显著上调，Northern杂交结果也支持了芯片发现。
随着耐药基因网络途径的完善和新的耐药靶基因的发现，基因芯片研究可用于新药的筛选和对特定肿瘤患者进行药物敏感性分型及基因和药物治疗具有重要意义。
cDNA基因芯片还广泛用于癌症研究。
例如相同疾病阶段的乳腺癌患者对同一治疗方案的效果可能明显不同，很难根据临床表现准确区分其中的差异。
荷兰癌症研究所的科学家利用基因芯片分析了117个早期乳腺癌患者的基因表达情况，发现了控制癌症转移的基因。
这一结果提供了对病人进行选择性治疗的新方法。
美国的Pomeroy等人也利用类似的方法进行了中枢神经系统胚胎瘤的研究。
另一种常用的基因芯片是寡核苷酸基因芯片，它也可以用于基因筛选。
利用探针长度为20碱基的寡核苷酸基因芯片，霍普金斯大学的Ooi等人研究了酵母基因组，筛选出了非同源末端连接（thenonhomologousend.joining，NHEJ）途径的组成基因。
用类似的方法，华盛顿大学的Raghuraman等人研究了出芽酵母Saccharomycescerevisiae染色体复制的详细拓扑图谱。
寡核苷酸基因芯片最常用于诊断分析，现在较常用于地中海贫血、肺结核等疾病的诊断。
地中海贫血是比较常见的一种遗传疾病，分为α和β两种亚型。
它们是由于α和β球蛋白基因突变导致血细胞中α和β球蛋白减少甚至完全抑制。
以β亚型为例，人类的B球蛋白基因位于染色体1lp15.5上，由β，δ，G-γ，A-γ，ε等五个活性基因和一个无活性的假基因Ψβ1构成。
多种基因突变都可以引起β型地中海贫血。
在南中国地区，五个等位基因（密码子41-42，IVS-II654，TATA框-28，密码子17和密码子71-72）突变引起的β型地中海贫血比较常见。
利用寡核苷酸芯片，可以同时检测是否有这五种基因缺陷。
与传统方法相比，这种检测方法可以更精确快速地进行地中海贫血的检测。
3.2蛋白芯片和其它微阵列芯片
二维阵列芯片除了基因芯片外还有蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片、和其它小分子阵列芯片等等。
蛋白芯片是二维芯片中除基因芯片外使用最为广泛的一种。
最近耶鲁大学的ZhuHeng等人就利用5800个探针的蛋白芯片研究了酵母的蛋白组。
现在，其它微阵列芯片也得到了快速的发展，香港大学的关新元等
人利用组织芯片技术，采用免疫组化方法检测CyclinD1在鼻咽癌旁粘膜上皮单纯性增生/化生、异型增生/化生和鼻咽癌的蛋白质表达，阳性表达率分别为30.0%（3/10）、90.0%（18/20）和62.9%（39/62），其中在异型增生/化生中呈"一过性增高"。
哈佛大学生物物理系的Kuruvilla等人最近利用有小分子微阵列芯片测定了3，780个小分子与荧光标记的蛋白Ure2p的相互作用，鉴定了几种小分子能够与Ure2P相结合。
并且发现其中uretupamine的小分子可以特异性地激活Ure2p下游的葡萄糖敏感的转录途径。
这一结果提出了一种检测与特定蛋白结合的小分子的方法，可以找到那些调节蛋白特异功能的小分子。
美国Whitehead实验室的JunaidZiauddinDavidM.Sabatini发明了一种表达特定cDNA的细胞阵列芯片。
这种方法可以同时分析很多基因产物的功能。
现在玻璃载片表面的特定位置点上不同的DNA片段。
然后在其上培养哺乳动物细胞。
细胞获取DNA，在非转染的细胞群落中产生局部转染的细胞群。
通过设计互补的DNA序列克隆到表达载体上，细胞在特定的位置表达特异的DNA。
这种芯片可以用于药物筛选，也可以检测不同DNA表达产物对细胞的影响。
4.生物芯片的发展前景
技术进展与市场动态，生物芯片是一个新兴的科学领域，具有良好的发展前景。
现在生物芯片主要向以下几个方向发展。
一是产业化。
对于现在技术已经相对成熟的生物芯片，如基因芯片，产业化是发挥生物芯片作用的最好途径。
现在很多公司已经推出各种不同种类的基因芯片。
而且相关其产业，如点样设备，检测设备也有重要的价值。
现在成本是束缚产业化的一个关键的因素。
二是微型化。
由于微加工技术，生物芯片的尺寸范围已经从微米尺寸向纳米尺寸发展。
例如在硅片上刻制的纳米尺寸的微结构阵列，可以完成生物大分子如DNA的筛选。
但是，由于细胞等生物样品本身尺寸的限制，生物芯片的微型化不是无限的。
三是集成化。
对生物芯片研究人员来说最终的研究目标是对分析的全过程实现全集成，即制造微型全分析系统或微芯片实验室，在芯片上实现生化检测的全部功能。
集成方面，目前已有了一些进展，并且得到了一批初步成果。
四是信息化。
生物芯片可以检测到的信息量是传统检测技术无可比拟的，特别是大规模阵列芯片一次可以采集大量数据。
如何从如此众多错综复杂的数
据中得到真正有用的信息是一个相当烦琐的T作。
生物信息技术的发展是解决这一问题的唯一途径。
生物芯片技术是现代微加工技术和生物科技的结晶。
它涉及生物、化学.微加工、光学、微电子和信息技术等前沿学科，是一个综合的研究领域。
上个世纪90年代以来，生物芯片的研究已有了巨大的发展，越来越多的研究机构和企业投入了这一领域。
但是，这毕竟是一门新的学科，总体来说还是处于起步阶段。
很多相关技术仍然制约着生物芯片技术的快速发展。
例如微加工技术，如何加工更复杂、更精密而且成本低的芯片是芯片技术的一个瓶颈。
微电子技术和检测技术也在很大程度上限制了芯片的集成化。
但是，随着各方面的不断投入和相关技术的发展，相信在不远的将来，各具特色的生物芯片将逐渐占据未来的生命科学仪器市场，成为未来生物医学检测的主要工具。
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