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生化笔记
上学期
§1生物化学绪论和基础（郑利民）
§2氨基酸与蛋白质（李国富）
§3蛋白质的结构（李国富）
§4蛋白质的功能（李国富）
§5蛋白质研究的基本方法（李国富）
§6酶（李国富）
§7糖（李国富）
§8核苷酸与核酸（李国富）
§9脂（李国富）
§10生物膜与物质转运（李国富）
§11生物信号（郑利民）
§12生物体对环境应答的生化基础（郑利民）
下学期
第一部分、静态生化－结构和催化作用
•第一节：
氨基酸、多肽和蛋白质
•第二节：
蛋白质的三维结构
•第三节：
蛋白质的功能和分离纯化，测序
•第四节：
酶
•第五节：
核苷酸和核酸
•第六节：
糖和糖生物学
•第七节：
脂类和生物膜
•第八节：
微生物、抗生素和激素
第二部分、动态生化－生物能学和代谢
•第九节：
糖酵解和己糖的分解代谢
•第十节：
三羧酸循环
•第十一节：
氧化磷酸化
•第十二节：
糖异生和糖原代谢
•第十三节：
脂肪酸的氧化及合成
•第十四节：
蛋白质的降解和氨基酸的氧化及合成
•第十五节：
核酸的降解及核苷酸代谢
第三部分、分子生物学－信息途径
•第十六节：
DNA的复制、修复和重组
•第十七节：
RNA的合成加工和遗传密码
•第十八节：
蛋白质的合成及转运
•第十九节：
基因表达的调控
•第二十节：
基因工程及蛋白质工程
历年考研真题&部分其它院校考研真题
三．复习重点和复习建议
很多考生认为生物化学的考试重点在下半册，也就是代谢部分，因此往往忽略对上半册的复习。
然而从我们中大生科院近六年（04－09）的研究生入学考试试题来看，上半部分结构和催化约占280分/750分，即37.3％；其中07、08年更是占了40％以上，所以大家一定要重视这部分。
在上半部分中，蛋白质的功能、蛋白质的分离纯化和酶为重点，80％以上考题集中在这里。
其实这与近年来由基因研究转向蛋白质的研究，大家越来越重视蛋白质是密不可分的。
因为代谢部分需要理解和记忆的东西很多，比如各步反应底物、产物、酶和催化机制等等，所以学习起来有一定的困难度。
老师在授课时就难免会强调学习这部分时需要努力的重要性，这就往往给我们造成错觉，认为这一部分是主要考点。
实际上这部分在近六年（04－09）中大研究生入学考试试题中所占的比重只有190分/750分，即25.3％。
因为研究生学习来说，代谢这一部分的内容在大家以后的研究生涯的中往往是很少接触到的。
特别是中大生科院，除了微生物专业的一位做工程菌的改造老师需要专业的代谢知识外，其它大部分研究者所做的都是核酸蛋白，因此我们在研究生入学考试中，对代谢部分的考查并不多。
在代谢部分所占的25％左右的题目中，脂肪酸的代谢是重点，无论是填空、判断还是问答都比较多，大家一定要注意。
至于第三部分，生物信息途径，也就是分子生物学，约为280分/750分，即37.3％，与第一部分静态生物学所占比例差不多，而且在近年中大研究生入学考试中所占的比例也有逐年增加的趋势，是复习的重点。
四．本讲义说明
本讲义以中山大学生科院本科生生物化学课程讲义为基础，整合了近几年年暑期班的生化讲义、中山大学分子生物学课程讲义以及基因工程课程讲义，力求涵盖到所有的考点。
在理解的基础上，以关键词的方式记忆所学内容是一种简便高效的方法，并且能够有效的加快复习进程。
因此，在我们的网络课程中，许多考点都以红色或蓝色字体加以标记，便于学员记忆。
正是因为如此，我们要讲的所有内容几乎都会在ppt上以文字或图表的形式呈现给学员，因此当学员需要再度复习的时候，建议参考ppt即可，毕竟全部都是文字的讲义是比较枯燥的。
在本课程中，每一节后面还给学员准备了一定量的练习题，这些题目部分出自中大本科生课程练习题或期中期末考试题，部分出自其它院校的比较典型的考研题目，建议大家认真练习。
在编制本讲义的过程中，虽然力求做到条理清晰、严谨正确、不失重点，并也因此参考
了大量的相关资料，但因为知识的局限和时间的紧迫，难免有所疏漏甚至错误，希望学员批
评指正。
第一节.氨基酸、多肽和蛋白质
1氨基酸
1.1结构特征
●标准氨基酸：
至少有一羧基（carboxyl）和一氨基连接在同一个碳原子上（该碳原子称为α-碳原子）。
●注意，脯氨酸含亚氨基。
●构成蛋白质的氨基酸是20种标准氨基酸（可能含有非标准氨基酸，标准氨基酸经修饰而形成的）。
最近又发现了两种标准氨基酸。
●标准氨基酸中，1806年发现第一种氨基酸——天冬酰胺，1938年发现最后一种——苏氨酸。
●α-碳采用sp3杂化，键角109.5°。
●α-碳是手性中心（大多数情况下，只有α-碳是手性中心；甘氨酸无手性，因R基为H）。
其绝对构型采用D,L系统，建立在L-甘油醛（L-glyceraldehydes）和D-甘油醛的结构之上。
●D、L构型与其实际的旋光性无关。
●到目前为止在蛋白质中发现的氨基酸都是L的（酶的活性位点是不对称的，即酶促反应是在手性环境下进行的），D仅存在于细菌细胞壁上的短肽和抗生素小肽。
1.2分类
●非标准氨基酸是标准氨基酸的衍生物（derivative）。
●根据R基的不同性质将氨基酸进行分类，按其极性或在生理pH（近7.0）下与水相互作用的趋势分为5类：
非极性脂肪族、芳香族、极性不带电、带正电（碱性）、带负电（酸性）。
●非极性脂肪族：
甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸。
（衣架凉鞋饼干＝异亮、甲硫、亮、缬、丙、甘）
●芳香族：
苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
（食老本（粤语）＝色、酪、苯丙）
●极性不带电：
丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺。
（诗书伴琴谱＝丝、书、半胱、脯；天冻先安谷＝天冬、酰胺、谷）
●带正电：
赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
（组队来京晋见＝组、赖、精、碱性）
●带负电：
天冬氨酸、谷氨酸。
（天上的谷子很酸＝天、谷、酸性、都是氨酸）
●酪氨酸苯环上有羟基；丝氨酸和苏氨酸有羟基；半胱氨酸有巯基可成对形成二硫键；组氨酸是唯一一个具接近的pKa值电离侧链的氨基酸，常作为质子供体和受体；天冬氨酸和谷氨酸都有两个羧基。
●含芳香族R基的氨基酸能强烈吸收紫外光，使许多蛋白质在280nm处有特征性强烈吸收。
1.3化学属性
1.3.1滴定曲线（titrationcurves）
●氨基酸是两性物质。
脱氢时先脱羧基再脱氨基。
对于含单一α-羧基、α-氨基和不离子化的氨基酸而言，羧基脱氢后氨基脱氢前为等电点（isoelectricpoint）。
pI＝（pK1＋pK2）/2
●只有组氨酸的R基（pKa＝6.0）在中性pH下提供显著缓冲能力。
●所有非末端残基的α-羧基、α-氨基共价形成了肽键，不发生离子化，对于多肽总的酸碱行为无贡献。
1.3.2特征反应
●茚三酮能使氨基酸显蓝色（脯氨酸显黄色）
1.4氨基酸的分离
●可用离子交换层析
2肽与蛋白质
2.1氨基酸链
●脱水缩合反应（condensationreaction）的自由能差为5kcal/mol，但无法自发进行。
在标准生化条件下，平衡有利于向反应物移动。
为使反应在热力学上更为有利，羧基必须被化学修饰或活化，使羟基更易离去。
●肽键极稳定（虽水解时放能，但活化能高），在无催化剂存在的水溶液中可维持1000年，在大多数细胞内环境下半衰期为7年。
●一般认为，少于50个氨基酸缩合成肽称寡肽，50～100个的称多肽（或相对分子质量低于10000）
●20种标准氨基酸的平均分子质量为138，但在蛋白质中，小分子量氨基酸在数量上占优势，平均下来为128，脱水缩合时再脱去一分子水的18，剩下110。
●缩合时是从N-端开始的，因此在书写时习惯将N-端放在左边。
●短肽可构成神经递质、激素、抗生素等。
2.2辅基
●有些蛋白质除了氨基酸之外还含有其它永久连接的基团（辅基，可以不止有一个），这样的蛋白称结合蛋白。
辅基可以是脂类、糖类、金属等。
●脱去辅基的蛋白称apoprotein（脱辅基蛋白）
2.3物种间的蛋白同源性
●在不同物种中，氨基酸序列的一些特定位置总被相同的残基占据，这些残基称不变残基。
而另外一些位置则表现出可变性，这些残基称可变残基。
●某些位置的替换大多发生在类似的残基间，称为保守替换。
3蛋白质的处理
3.1分离和纯化
●根据蛋白质的溶解性、分子量、带电性、亲和性（bindingaffinity）的不同，可分离、纯化蛋白。
柱层析就是利用这个原理来做的。
高效液相层析（HPLC）利用高压泵加速蛋白质分子沿着柱子向下运动，通过减少过柱时间，可限制蛋白质条带的扩散，提高分辨率。
●分离纯化的一般步骤：
组织→匀浆（homogenization）→过滤（filtration）→粗提取（crudeextract）→盐析（saltingout）↔离心（centrifugation）→透析（dialysis）→柱层析（columnchromatography）
●盐析常用硫酸铵，因其具有高度水溶性。
可用透析法去除硫酸铵。
●分离纯化时，一般先选择廉价、简单的程序再选择昂贵、复杂的程序。
●离子交换层析（ion-exchangechromatography）：
利用一定pH下不同蛋白质带电的种类和电量存在差异，与柱介质上的离子结合力不同来做的。
柱有阴、阳离子交换树脂两种。
●大小排阻层析（size-exclusionchromatography）：
又称凝胶过滤（gel-filtration），柱介质有选择孔径的聚合物。
大的蛋白质比小的蛋白质走得快（因小蛋白可以钻小孔，路径曲折）。
●亲和层析（affinitychromatography）：
通过结合特异性来分离蛋白质。
柱介质上含有配体能特异性结合某些蛋白。
●疏水相互作用层析（hydrophobicinteractionchromatography）：
根据不同蛋白质的疏水性的强弱来做的。
溶液中高离子强度可增强蛋白质与疏水性柱介质之间的疏水作用，线性或阶段降低离子强度可选择性地将样品解吸。
3.2电泳（electrophoresis）
●蛋白质电泳普遍在聚丙烯酰胺凝胶中进行。
大体上按照蛋白质的荷质比来移动，蛋白质的形状对移动也有影响。
●十二烷基磺酸钠电泳（SDS-PAGE）常用来估测蛋白质的纯度和分子量。
SDS结合蛋白质的量基本与分子量成正比，结合的SDS提供大量负电荷使蛋白本身的电荷不明显，使荷质比相同，同时也改变蛋白质的构象呈相同的形状，于是移动性完全由质量来决定（小蛋白比较快）。
电泳后再用考马斯亮蓝（Bradford法考马斯亮蓝G-250与蛋白结合而不与胶结合，在游离状态下呈红色；当它与蛋白质结合后变为青色。
灵敏，方便）染色。
若蛋白含有亚基，则会被分开形成各个亚基的条带。
●等点聚焦电泳（IEF）用来确定蛋白质的等电点。
通过低分子量的有机酸碱混合物在外加电场的凝胶中分布形成一个pH梯度。
于是蛋白质会移动到与pI相等的pH处停下。
●双向电泳结合等点聚焦和SDS电泳，能提高分辨率。
可分离相同分子量而等电点不同的蛋白质，或相同等电点而分子量不同的蛋白质。
●电泳一般不用于纯化大量蛋白质，因电泳对蛋白质结构不利。
3.3测序（sequencing）
●测序的一般步骤：
分析氨基酸组分→打开二硫键（disulfidebond）→切割长肽为短肽→短肽测序→短肽排序→定位二硫键。
●分析氨基酸组分：
将肽链彻底水解（6mol/LHCl，110℃，24h），后用离子交换层析（或HPLC）分离，后根据吸收峰来确定组分和含量。
●打开二硫键：
可用过甲酸来氧化断键，或用二硫苏糖醇还原断键再用碘乙酸来乙酰化防止再度形成二硫键。
●肽链切割：
用溴化氰或蛋白酶来切割。
胰蛋白酶切Lys，Arg（C）；胰凝乳蛋白酶切Phe，Trp，Tyr（C）；胃蛋白酶切Phe，Trp，Tyr（N）；溴化氰切Met（C）。
●短肽测序：
Edman法。
●短肽排序：
比较多套片断，推理得出原来的完整序列。
●定位二硫键：
将原来的蛋白样品作同样切割但不打开二硫键，然后电泳比较，比较条带即可知道二硫键所在区域。
●现在很多氨基酸序列是通过分析其DNA序列来确定的。
3.4化学合成
●含150个氨基酸残基的短肽可被化学合成。
●化学合成的速率远低于生物合成。
3.5质谱法（massspectrometry）
●省略……自己看书去……
第二节.蛋白质的三维结构
1蛋白质结构综述
●蛋白质折叠与非折叠状态的自由能差在20～65kJ/mol之间。
●二硫键的强度虽比单独的弱的相互作用力（weakinteraction）强，不过由于弱的相互作用力数量多，因此它才是维持蛋白质稳定的主要作用力。
它包括：
氢键（hydrogenbond）、静电力（staticelectricalforce）、范德华力（VanderWaalsforce）、疏水相互作用力（hydrophobicinteraction）。
●蛋白质折叠的自由能降大部分来自于水的熵增加（疏水相互作用）。
●折叠规律：
疏水残基大部分埋在蛋白质内部远离水；氢键数最大化。
●肽键具刚性（rigid）和平面性（planar）。
肽键的C－N键不能自由旋转。
●C－N由于共振作用具有部分双键的性质。
羰基氧带部分负电荷，氮带部分正电荷，形成小的电偶极子（electricdipole）。
2蛋白质的二级结构
2.1α螺旋（α-helix）
●每个螺旋含有3.6个氨基酸残基，螺距5.4Å，每个氨基酸残基升高5.4÷3.6＝1.5Å，旋转100°。
●目前已知的α-helix均为右旋。
●α-helix最佳利用了内部氢键。
●形成α-helix的氨基酸必需手性相同。
●5个因素决定α-helix的稳定性：
R基间的静电作用力；R基间的空间位阻；相隔3～4个残基的侧链间的相互作用力；脯氨酸（N为刚性环的一部分不利螺旋）和甘氨酸（柔性）的出现；螺旋片断末端的氨基酸残基相互作用和螺旋固有电偶（螺旋两端的4个残基不完全参与形成螺旋氢键，C端带负电N端带正电）。
2.2β折叠片层（β-pleatedsheet）
●有反平行（antiparallel，C→N/N→C/C→N交替出现）和平行（parallel，C→N/C→N/C→N）两种形式。
反平行的自由能可能低一些，因氢键无角度，强度更大。
●同一条肽链也可有β-pleatedsheet。
如图：
反平行
平行
●R基间距离约为3.5Å。
反平行构象的周期为7Å，平行的为6.5Å。
2.3β转角（β-turn）
●包含4个氨基酸残基的180°转角。
第一个残基的羰基氧和第四个残基的氨基氢之间形成氢键，中间两个残基不参与残基内部氢键的形成。
如反平行的β-pleatedsheet末端是β-turn。
（γ转角是由3个氨基酸残基构成的，相当少见。
）
●甘氨酸和脯氨酸常出现于β-turn中，因前者较小且具柔性，后者能异构成顺式。
●β-turn常出现在蛋白质近表面，因中间两个残基的肽基团可以与水形成氢键。
3蛋白质的三级结构（tertiarystructure）和四级结构（quaternarystructure）
●三级结构：
一条肽链的空间结构或n条之间有共价键（二硫键）的肽链的空间结构。
●四级结构：
n条肽链，且之间不形成共价键。
3.1纤维蛋白（fibrousprotein）
●纤维蛋白一般为结构蛋白，提供力量和/或柔韧性。
均不溶于水。
3.1.1α-角蛋白（α-keratin）
●α-角蛋白组成头发、毛绒、指甲、爪趾、刺、角、蹄和皮肤外层。
●α-角蛋白是右手α-helix，超卷曲（两条链）是左手的。
超卷曲中α-角蛋白方向平行。
●超卷曲中两条α-helix的接触面由疏水氨基酸残基组成，包括Phe、Ile、Val、Met、Leu和Ala。
R基相互啮合成规则的互锁模式。
●通常强度较大的α-角蛋白，含有较多Cys，因可形成二硫键。
如龟壳和犀牛角约含18％的Cys。
●α-角蛋白具有弹性，可拉伸为原长度的2倍。
3.1.2胶原蛋白（collagen）
●胶原蛋白的二级结构非常独特，含有左手的α-chain（三股螺旋，不是α-helix），一圈3个残基。
3股α-chain形成右手三链螺旋。
（α角蛋白中是两股右手螺旋以左手的方式形成超螺旋.胶原蛋白有类似的三螺旋,但肽链自身是左手螺旋,其三条肽链以右手螺旋的方式构成超螺旋,其2级结构称α-chain ）
●胶原中的氨基酸序列大体上是三肽的重复结构，即Gly-X-Pro或Gly-X-HyPro（X是任意氨基酸残基，HyPro是羟脯氨酸）。
●只有Gly可以容纳于各个α-chain（左手螺旋）间非常紧密的连接中。
脯氨酸使胶原螺旋形成尖锐的扭曲。
●不存在链内氢键，只有链间氢键。
●每个氨基酸升高2.9Å，约3个氨基酸为一圈。
●α-chain间和胶原分子间通过独特的共价键交联，涉及Lys和HyLys（羟脯氨酸）或His残基。
●胶原三股螺旋中的α-chain超卷曲产生的张力大于同截面的钢绳。
3.1.3丝心蛋白（silkfibroin）
●丝心蛋白由昆虫和蜘蛛产生，其多肽链以富含Gly和Ala的β-pleatedsheet为主，其R基（－H和－CH3）可以交互排列、堆积紧密。
●整体结构的稳定由β-pleatedsheet肽链间的大量氢键和范德华力的优化来维持。
●丝心蛋白已不可再拉伸，因β-pleatedsheet已经高度伸展。
柔韧性高，因片层的连接是靠弱的相互作用力，不像α-keratin（α-角蛋白）用二硫键。
3.2球蛋白（globularprotein）
●球蛋白多为功能蛋白，如酶、转运蛋白、动力蛋白、调节蛋白、免疫球蛋白等。
3.2.1肌红蛋白（myoglobin）
●肌红蛋白含153个氨基酸残基和一个铁离子原卟啉（亚铁血红素基团，heme），功能是贮存氧气并协助氧在急速收缩的肌肉组织中扩散。
●肌红蛋白有一个密集的疏水核心，含Leu、Val、Met、Phe等。
分子内部仅有两个亲水的（hydrophilic）组氨酸残基。
●除了两个极性R基外，其它所有的极性R基均在分子外表与水结合。
（注意，非极性的也能在表面）
●扁平的亚铁血红素基团位于肌红蛋白的一个裂缝（口袋）中。
亚铁的6个配位键，4个结合到平面的卟啉环上，另外两个与环垂直，一个与His残基的N结合，一个与O2结合。
●在口袋中的血红素基团不易与溶剂接触，从而保证Fe2＋不会被氧化成Fe3＋（无法与O2结合）。
3.3结构模式
3.3.1结构域（domain）和超二级结构（supersecondarystructure）
●残基数超过几百的多肽常折叠成两个或更多的稳定的球状单元，称为domain（结构域）。
许多domain独立折叠成热力学上最稳定的结构，有些有各自独特的功能。
●β-α-βloop与α-αcorner能使疏水R基处于内部。
●α-helix与β-pleatedsheet通常存在于不同结构层，因无法形成稳定氢键。
●一级序列相互接近的多肽片断通常在折叠后也相邻堆叠。
●二级结构单元间的连接不能形成交叉或结节。
（如很长的β-pleatedsheet可以绕来绕去但是不能有打结的趋势）
●当各个片断以右手螺旋略微扭曲时，β-pleatedsheet最稳定。
右手连接比左手连接短，弯曲角度更小。
这样的扭曲会形成β桶（βbarrel）和扭曲的β-pleatedsheet。
3.3.2蛋白质的基序（motif）是蛋白质分类的基础。
●按基序可降低三级结构的复杂性。
分为4类：
全α，全β，α与β交错（α/β），α与β明显可分（α＋β）
3.3.3四级结构
●多亚基蛋白称为多聚体（multimer），少数亚基组成的多聚体称为寡聚体（oligomer）。
●大多数多聚体以对称方式重复排列相同的一个或组亚基（原体）。
●寡聚体具有旋转对称性或螺旋对称性：
一个亚基绕一条或多条旋转轴或一条螺旋轴旋转后可以和其它亚基重合。
●蛋白质的大小受到2个因素限制：
基因的编码容量和蛋白质生物合成中的精确性（大的蛋白质包含一个错误氨基酸的几率大于小蛋白质）。
4蛋白质的变性（denaturation）和折叠（folding）
4.1结构缺失导致功能缺失
●导致蛋白质功能丧失的三维结构破坏称为变性。
●变性≠完全去折叠或构象随机化。
通常变性后蛋白质以部分折叠的状态存在。
（目前还不是很清楚的说）
●加热破坏氢键还有其它弱的相互作用力，使蛋白质变性。
●加热时，蛋白质会在某个狭窄的温度范围内突然变性，表明去折叠是一个协同过程。
●极端pH、有机溶剂（如乙醇、丙酮、尿素、盐酸胍）以及去污剂等也能使蛋白质变性。
极端pH改变蛋白质所带的静电荷引起静电斥力和某些氢键的断裂；后两者主要破坏产生球蛋白稳定核心的疏水相互作用。
●某些变性是可逆的。
恢复活性的过程称为复性（renaturation）。
4.2蛋白质按步骤迅速折叠
●从热动力学上说，折叠过程可被看成一种自由能漏斗。
●某些蛋白质的折叠在其它蛋白质（分子伴侣，molecularchaperone）的辅助下进行。
分子伴侣提供折叠所需的微环境或加速正确折叠。
●目前研究比较透彻的有两类分子伴侣：
Hsp70蛋白家族和陪伴蛋白（chaperonin）。
前者能和富含疏水残基的未折叠区域结合组织，阻止不恰当聚集，还有能封闭某些蛋白质使其不能折叠，保证这些蛋白质在跨膜定位之前保持去折叠状态；后者为许多不能自发折叠的胞内蛋白提供了所需的微环境。
●某些蛋白质的折叠需要两种异酶：
蛋白质二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase，PDI）和肽链prolyl顺反同分异构酶（peptideprolylcis-transisomerase，PPI）。
前者催化二硫键交换和改组直至形成天然构象中的化学键（包括催化排除错误成键的中间折叠体），后者催化脯氨酸顺反异构体间相互转化。
4.3错误折叠引起的死亡
●朊病毒。
5研究蛋白质3D结构的方法
●目前测定蛋白质3D结构的方法有透射电子显微镜技术（TransmissionElectronMicroscope,TEM）、X射线衍射（X-raydiffraction）和核磁共振（NMR）。
●三种方法的对比请看大一上学期生技进展的笔记整理。
6结语
●氨基酸序列决定3D结构
●结构决定功能
●每种蛋白质有其独特的结构。
●维持蛋白质结构的不是共价相互作用，而是弱的相互作用力。
●蛋白质错综复杂的结构是由一定的基序构成的。
第三节.蛋白质功能和分离纯化，测序
1一般特征
●配体（ligand）：
与蛋白质发生可逆结合的分子，可以是各种分子，如蛋白质。
●结合位点（bindingsite）：
蛋白质上与ligand结合的位点。
结合位点与配体在大小、形状、电荷、疏水性亲水性等性质方面是特异性互补的。
（当然这里排除了水，它与蛋白质许多部位有微弱的、非特异性的结合）
●蛋白质和配体间的结构适应称为诱导契合（inducefit）。
●蛋白质有柔性，主要表现为异构和氨基酸的微小移动。
●其它配体结合而导致的构象变化将影响第一配体的结合。
●蛋
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