1分子生物学第八章转录和RNA加工pptConvertor.docx
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1分子生物学第八章转录和RNA加工pptConvertor
Chapter8
TranscriptionandRNAsplicing
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PartI
Prokaryotegenetranscription
ThefunctionofRNApolymeraseistocopyonestrandofduplexDNAintoRNA.
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TranscriptioninvolvessynthesisofanRNAchainrepresentingonestrandofaDNAduplex.By"representing"wemeanthattheRNAisidenticalinsequencewithonestrandoftheDNA,whichiscalledthecodingstrand.Itiscomplementarytotheotherstrand,whichprovidesthetemplateforitssynthesis.Thisrelationshipbetweendouble-strandedDNAanditssingle-strandedRNAtranscriptisrecapitulatedinFigure9.1.
转录实现了表达DNA双螺旋中一条键的RNA链的合成。
这里表达的意思就是RNA与DNA的一条链序列是相同的，这条链叫做编码链，RNA与另外一条为它的合成提供模板的链互补，双链DNA与转录产生的RHA之间的关系如图Fig11.1所示。
图11.1：
概观：
RNA聚合酶的功能是复制双链DNA的其中一条链形成RNA
模板链转录RNA转录
密码链RNA序列与模板链互补与密码链相同
RNA是聚合酶催化RNA的合成，在RNA聚合酶与DNA基因的起始端一段特别的区域——启动子结合时，RNA转录便开始了。
启动子位于起始点即转录成RNA的第一个碱基处周围。
从这一点开始，RNA聚合酶沿模板向前移动，同时合成RNA，直到到达结束序列。
这一过程确定了从启动子到终止子之间的一个转录单元。
第十二章将讨论调节蛋白利用各种方法识别转录的基因来促进成抑制细菌RNA聚合酶。
第十三章中讲叙单个的调节作用可以归结入调节网中。
第二十八和二十九章讨论真核RNA聚合酶与他们的模板之间的与上述相似的相互作用。
（转录不是RNA合成的唯一途径。
RNA病毒具有以自身RNA基因为模板合成RNA的酶：
这种瓜产生了感染周期所必须的为蛋白质编码的mRNA。
并且提供RNA基因且使感染周期持续下去，但是细胞中合成RNA只有队DNA为模板进行转录这一条途径）。
Atranscriptionunit转录单元isasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA,startingatthepromoterandendingattheterminator.
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RNAsynthesisiscatalyzedbytheenzymeRNApolymerase.TranscriptionstartswhenRNApolymerasebindstoaspecialregion,thepromoter,atthestartofthegene.ThepromotersurroundsthefirstbasepairthatistranscribedintoRNA,thestartpoint.Fromthispoint,RNApolymerasemovesalongthetemplate,synthesizingRNA,untilitreachesaterminatorsequence.Thisactiondefinesatranscriptionunitthatextendsfromthepromotertotheterminator.Thecriticalfeatureofthetranscriptionunit,depictedinFigure9.2,isthatitconstitutesastretchofDNAexpressedviatheproductionofasingleRNAmolecule.Atranscriptionunitmayincludemorethanonegene.
转录单元的主要特征可由图Fig11.2看出，它由一段由单链RNA分子的产生表达的DNA序列组成。
一个转录单元可能包含不止一个基因。
图11.2：
概观：
一个转录单元是一段被转录成单链RNA的DNA序列，它起始于启动子，结束于终止子。
启动子近端的远端的终止子
起始点
上游下游
起始点之前的序列被称为起始点的上游，反之称为下游（转录单元以内），按常规的序列书写顺序转录是由左（上游）至右（下游）进行。
这与mRNA的一般书写方向由5‘端到3’端是一致的。
为了确切表示编码链，我们对DNA的序列进行编码，起始点后的第一个基编为+1，往下游依次增大，起始点前的第一个基为-1，往上游依次减小。
转录的一次产物称为初级转录体，它包括从启动子延伸至结束子包括它的最初的5‘和3’端的RNA序列。
然而初级转录体通常是不稳定的。
原核中，它很快被降解（mRNA）或酶切得到成熟产物（rRNA和tRNA）。
真核中，它被在末端修饰（mRNA）或酶切成为成熟产物（各种RNA）。
转录是基因表达的第一阶段，也是控制基因表达的主要的一步。
调节蛋白来决定一段基因能否被RNA聚合酶所转录。
调节过程的第一步有时是唯一的一步就是决定是否转录一段基因。
在考虑转录的不同阶段时，我们应该注意它被调节活性的可能性。
RNA合成的基本特征
底物为ATP、UTP、CTP和GTP
利用RNA聚合酶根据模板DNA链的序列按照碱基配对原则添加核苷酸，所以RNA的序列由模板DNA链决定
以DNA单链为模板
合成方向为5’-3’
不需要引物
合成的RNA分子5’末端具有三磷酸，与下一个核苷酸的3’-OH聚合，形成磷酸酯键
原核生物RNA聚合酶
大肠杆菌的RNA聚合酶由五个亚基组成，α2ββ’σ，由4个基因编码：
rpoA,rpoB,rpoC,rpoD。
α2ββ’称为核心酶，具有催化活性，其中α亚基可与β亚基结合，参与特定基因表达；β亚基参与酶与DNA的结合、核心酶与σ亚基因的结合、RNA链的引发、延伸和终止。
σ亚基没有催化活性，它负责识别启动子起始转录，但起始后即离开核心酶，开始延伸。
在大肠杆菌中所有RNA都是由这一种酶合成的，这种合成受利褔平抑制。
Transcriptiontakesplaceinabubble转录泡,inwhichRNAissynthesizedbybasepairingwithonestrandofDNAinthetransientlyunwound松散region.Asthebubbleprogresses,theDNAduplexreformsbehindit,displacing释放theRNAintheformofasinglepolynucleotidechain.
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Transcriptiontakesplacebytheusualprocessofcomplementarybasepairing,catalyzedandscrutinizedbytheenzymeRNApolymerase.Figure9.3illustratesthegeneralnatureoftranscription.RNAsynthesistakesplacewithina"transcriptionbubble,"inwhichDNAistransientlyseparatedintoitssinglestrands,andonestrandisusedasatemplateforsynthesisoftheRNAstrand.AsRNApolymerasemovesalongtheDNA,thebubblemoveswithit,andtheRNAchaingrowslonger.
一、RNA聚合酶催化转录过程
转录在RNA聚合酶的作用下，通过碱基互补配对的一般过程得以实现。
Fig11.3描述了转录的一般过程。
RNA的合成是在“转录泡”中实现的，在泡中DNA被分开成为两条单链，一条做为模板，当RNA聚合酶沿DNA移动时，转录泡随之移动，RNA链随之增大。
图11.3:
转录发生在一个”泡”中,在该泡中,RNA通过与瞬间解旋区的DNA的一条链进行碱基配对而合成,随着该泡的前进,DNAS在它后边发生变化,以一条单核苷酸链的形式取代RNA
RNA聚合酶中的转录泡→聚合酶移动→RNA链伸长
Duringtranscription,thebubble转录泡ismaintainedwithinbacterialRNApolymerase,whichunwindsandrewindsDNA,maintainstheconditionsofthepartnerandtemplateDNAstrands,andsynthesizesRNA.
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ThestructureofthebubblewithinRNApolymeraseisshownintheexpandedviewofFigure9.4.AsRNApolymerasemovesalongtheDNAtemplate,itunwindstheduplexatthefrontofthebubble（theunwindingpoint）,andrewindstheDNAattheback（therewindingpoint）.Thelengthofthetranscriptionbubblevarieswiththephaseoftheelongationreactionfrom1220bp（seelater）,butthelengthoftheRNA-DNAhybridregionwithinitisshorter（forreviewsee68）.
RNA聚合酶中的转录泡的结构由Fig11.4可看到。
当RNA聚合酶沿DNA模板移动时，它打开泡前的DNA双螺旋（在解链点打开），并在复链点使DNA复原，转录泡的长度随增长反应阶段而异，在12-20bp之间，但其中的RNA-DNA杂交体区域比这个长度要短。
图11.4:
在转录期间,该泡被保持在细菌RNA聚合酶中,聚合酶解开DNA,复旋DNA,保持相应的模版链的条件,合成RNA
酶移动
复旋点DNA密码链解旋点
RNA结合点催化点DNA模版链
过去的关于转录的观点认为RNA-DNA杂体长度约为12bp，但这个数字是由KNA聚合酶内RNA的区域的结构这个间接的证据得出的。
实际上，RNA-DNA杂体的长度并没有被直接测量过，最后的研究结果表明离生长点三个碱基矩离的RNA碱基会被识别出单链RNA的RNA酶价切掉。
（这一结果是通过控制下一个要结合入RNA链上的碱基来阻止正在某一位点处于伸长期的RNA聚合酶来实现的）
所以，RNA在生长点之后通过2-3个碱基与DNA相连，然后便是一个与聚合酶的高区。
所以RNA-DNA杂多体很短且是暂时性的，只延伸至使加入的核苷酸有足够的稳定性即停止，当酶移动的时候，DNA双螺旋重新形成，RNA是自由的多核苷酸链，最后加入生长链的约25个核糖核苷酸与DNA或酶形成复合物。
YeastRNApolymerasehasgroovesthatcouldbebindingsites结合位点fornucleicacids.ThepinkbeadsshowapossiblepathforDNAthatis~25Åwideand5-10Ådeep.Thegreenbeadsshowanarrowerchannel.
25bpRNA
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BacterialRNApolymerasehasoveralldimensionsof~90⊙95⊙160?
.YeastRNApolymeraseislargerbutlesselongated.Structuralanalysisshowsthattheyshareacommontypeofstructure,inwhichthereisa"channel"orgrooveonthesurface~25?
widethatcouldbethepathforDNA.ThisisillustratedinFigure9.5fortheexampleofyeastRNApolymerase.Thelengthofthegroovecouldhold16bpinthebacterialenzyme,and~25bpintheyeastenzyme,butthisrepresentsonlypartofthetotallengthofDNAboundduringtranscription.Asidefromthisgeneraldescription,wecannotyetrelatethefeaturesoftheenzymetothegeneralizedstructureshowninFigure9.4.
细菌RNA聚合酶的大概三维体积是90×160，酵母RNA聚合酶比较大但短一些。
结构分析表明RNA聚合酶有一个共同的结构形式。
表面约25宽的‘通道’成沟，可能是做为DNA的通道。
由Fig11.5可看到酵母RNA聚合酶的结构。
细菌酶中沟的长度可容纳16bp，酵母中25bp。
这只是转录中DNA结合的一部分区域。
除了以上基本的描述我们不能氢酶的特点与Fig11.4所示的一般结构联系起来。
图11.5:
酵母菌RNA聚合酶有可以成为核苷酸结合位点的沟,粉红色的珠子显示了一条适合约25埃宽的,约5-10埃深的DNA的通过,绿色的珠子显示了一条较窄的通道,约12-15埃宽,约20埃深的能负载RNA,照片由RogerKopnberg友情提供
RNA合成包括4个步骤
（1）RNA聚合酶与启动子结合并使DNA融解产生一段单链区
（2）转录起始initiation
（3）根据模板链添加核苷酸进行延伸elongation
（4）RNA聚合酶从模板链上解离dissociates终止转录
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ThetranscriptionreactioncanbedividedintothestagesillustratedinFigure9.7,inwhichabubbleiscreated,RNAsynthesisbegins,thebubblemovesalongtheDNA,andfinallyisterminated:
二、RNA聚合酶由多个亚基组成
转录反应可以划分为Fig11.9所示的阶段。
这个阶段为转录形成，RNA合成开始转录泡沿DNA前进，最后是结束。
l 模板识别开始于RNA结合到双链DNA的启动子上时，然后DNA双链被解开，露出模板。
从RNA聚合酶结合点开始通过局部解链形成转录泡。
l 起始指RNA中第一个核苷酸键的合成。
酶合成最初约9个核苷酸键时一直停留在启动子上。
（当合成键<9时，为无效合成，起始阶段被延长。
无效合成部分会被释放，重新合成）当酶成功的合成29个键并离开启动子前移时，起始阶段停止。
为RNA聚合酶结合到模板上并完成初始阶段转录所提供的DNA序列称为启动子。
l 伸长阶段中，RNA聚合酶沿模板前移异使RNA链增长。
酶前移时，安解开一段DNA链使模板暴露出来。
核苷酸共价结合到增长的RNA链的3ˊ端，在解链区形成DNA-RNA杂交体。
解链区后面，DNA模板链与原互补链重新回复双螺旋状态。
RNA成为自由单链，伸长过程引起破坏DNA结构的转录泡的移动，移动中暂时解链区的模板键与分生的RNA在生长点处配时。
l 结束过程包括结束位点的识别，为了结束转录，就必须停止形成磷酸二酯键，转录复合均必须分开，当最后一个碱基加到RNA链上时，RNA-DNA复合物被破坏的同时，转录泡也被破坏，DNA重新形成双螺旋，酶和RNA均被释放。
引起发生这些反在的DNA序列叫做结束子。
RNA聚合酶最初的定义只是因为它能使核苷酸沿DNA模板的顺序加入RNA链中，现在它则被看做转录中包括的复杂装置的一部分。
催化RNA的合成只是RNA聚合链酶作用的最小的部分。
它指导核糖核苷酸与DNA的配对并催化磷酸二酯键的合成。
图11.9:
转录有四个时期,包括RNA聚合酶与DNA之间的各种类型的相互作用
酶结合启动子,溶化DNA,起始过程中保持稳定,延伸过程中沿模版链移动,结束过程中降解
模版识别:
RNA聚合酶结合到双链DNA上
DNA在启动子处被解旋
初始:
2-9个碱基的链被合成与释放
延伸:
RNA聚合酶合成RNA解旋区随着RNA聚合酶移动RNA聚合酶到达基因末端
结束:
RNA聚合酶与RNA分离
BacterialRNApolymeraseshavefourtypesofsubunit;a,b,andβ′haveratherconstantsizesindifferentbacterialspecies,buts（Sigma）variesmorewidely.
bindingsites
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ThecompleteenzymeorholoenzymeinE.colihasamolecularweightof~465kD.ItssubunitcompositionissummarizedinFigure9.8.
当酶必须连接或禽开DNA上的特定位点时，需要一些辅助性的促进作用来起始和结束。
RNA的合成，核糖体与蛋白质合成因子之间的分工的相似性是很明显的，有时很难决定在转录过程中出现的特别蛋白质是RNA聚合酶还是辅助因子。
基本的聚合酶中所有的参与伸长的亚基都是起始与结束所必须的，但是转录区间在起始和结束时对额外多肽的依赖性是不同的，有些额外多肽每个基因都需要，有些只是在特别基因起始和结束时需要。
一个在所有启动于识别中都需要的辅助多肽就被归类为酶，只有在特别基因起始结束时需要的多肽被称为辅助控制因子。
细菌中的RNA聚合酶的在结构上有所不同,真菌核细胞动物中，一种简单的RNA聚合酶要控制几乎所有的RNA，rRNA和tRNA的合成，一个E.coli细胞中大约有7000个RNA聚合酶分子，许多用来控制转录，在任何时候都有大约200-500个酶在合成RNA。
具体数目由生长状态决定。
E.coli中全酶分子量约465KD,Fig11.10是它的亚基构成图示。
我们现在关于酶的拓扑学的知识还很有限，目前做得最好的是用一张图示来表示不同酶的作用位点。
如同Fig11.4中所示。
这些位点没有一个已经被在多肽亚基上精确定位过，然而我们有些关于单独的亚基所扮演的角色的大概信息。
β与β′亚基一起构成活性中心，他们的序列与真核RNA聚合酶的最大和亚基的序列有关（see第二十八章），这表明所有RNA聚合酶有一些共同的特征，β亚基可以和模板DVA，产物RNA，底物核苷酸交叉连接，rPOB的突变会影响到转录的每一个阶段,rpoC的突变能证明β′也与所有转录阶段有关系。
图11.10:
真菌RNA聚合酶有4种类型的亚单位:
αββ’在不同的细菌种类中拥有一定的大小,但是σ变化范围较广
RNApolymerasepassesthroughseveralstepspriortoelongation.Aclosedbinarycomplex闭合的二元复合体isconvertedtoanopenform开放状态andthenintoaternarycomplex三元复合体.
全酶
RNA、DNA和核心酶
DNA和全酶
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WearenowinapositiontodescribethestagesoftranscriptionintermsoftheinteractionsbetweendifferentformsofRNApolymeraseandtheDNAtemplate.TheinitiationreactioncanbedescribedbytheparametersthataresummarizedinFigure9.9:
我们现在是处于根据不同的RNA聚合酶与DNA不同的相互作用来描绘转录阶段的情况下，起始反应可由Figll.12中所示参数来描述。
反应化合物反应描述酶状态
DNA结合平衡常数全酶
↓KB=106-109M-1封闭的二元复合物
DNA融合速度常数
↓K2=10-3-10-1sec-1开放的二元复合物
失败的起始速度常数
↓K1约10-3sec-1三元复合物
σ因子解离启动子消除时间
>1-2secRNA合成开始
Δ全酶与启动子之间的作用从形成闭合的二元复合物开始。
“闭合”意为DNA仍是双螺旋形式，因为闭合二元复合物的形成是可逆的，这个反应通常由平衡常数来描述，的值域很广。
Δ与酶结合的序列中的一块小区域DNA被溶解后，闭合复合物便转化为开放复合物，形成开放复合物的一系列反应叫做紧密结合，对于强启动子，这个转化是可逆的，所以此反应也由速率常数来表示（K2），这个反应速度很快。
Δ下一步是插入头两个核苷酸，然后在他们中间形成磷酸二酯键，这一步产生包括RNA。
DNA和酶的三元复合物，反应由k1来描述，k1比k2还要大，接下来无须酶的移动核苷酸便加到RNA链上直到生成9个碱基的RNA链。
所有的碱基都结合上之后，酶会释放RNA链，这个过程包括如果产生了失败的起始，则酶会重新开始合成，失败的起始为起始时只合成了2-9个碱基的寡核苷酶链。
Δ起始成功后，酶释放σ因子并转化为核心酶·DNA·内在RNA的三元复合物，这个过程一个重要的参数是一个聚合酶需要多少时间离开启动子使另一个聚合酶可以开始。
这个参数叫做启动子脱离时间，它的最小时间～2S，使得最大频率为每秒<1个，然后酶会沿着模板移动，RNA链延长到10个以列个碱基。
图11.12:
RNA聚合酶经过几个步骤延伸,一个封闭的二元复合物被转化成为一个开放的形式然后变
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