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核酸化学翻译

成纤维生长因子-21通过激活AMPK–SIRT1–PGC-1α信号通路调节能量代谢

成纤维细胞生长因子-21已经被证实是一种潜在的代谢调节因子。

对经饮食诱导或遗传的肥胖的糖尿病啮齿类和恒河猴施用重组成纤维细胞生长因子-21后，其表现出了很强的抗高血糖和降低甘油三酯并减轻体重的作用。

尽管成纤维细胞生长因子-21在调节葡萄糖、脂质和能量平衡中发挥了重要的作用，但是成纤维细胞生长因子作为一种代谢调节因子的作用机制仍然不是很清楚。

本实验证明了，成纤维细胞生长因子-21是通过激活AMP激活蛋白激酶（AMPK）和SIRT1，从而增强了线粒体的氧化能力，对脂肪组织细胞进行能量平衡的调节的。

FGF-21作用于来自OB/OB小鼠的脂肪细胞和白色脂肪组织都增强了AMPK的磷酸化水平。

FGF-21的应用增强了细胞内的NAD+水平，从而激活了SIRT1及对其下游的靶位点进行了脱乙酰基作用，过氧化物酶体增殖子激活受体-γ辅助因子-1α（PGC-1α）和第3位组氨酸。

FGF-21作用脂肪细胞后激活了AMPK和SIRT1，进而增强了线粒体氧化能力，表现为耗氧量、柠檬酸合成酶的活性的增加，以及诱导关键代谢基因的转录与表达。

FGF-21增强线粒体功能的能力需要丝氨酸-苏氨酸激酶11（STK11/LKB1），STK11/LKB1可以激活AMPK.抑制了AMPK,SIRT1和PGC-1α的活性，FGF-21对氧耗和基因表达的影响降低了，这表明FGF-21的调节线粒体功能和增加氧化能力是通过依赖AMPK–SIRT1–PGC1α信号通路的这一机制在脂肪细胞细胞中实现的。

AMP激活蛋白激酶（AMPK）是一个主要能量代谢效应器和主要的代谢平衡的调节因子。

LKB1，一种丝苏氨酸激酶，是激活AMPK的主要调节因子。

LKB1直接对AMPK的第172位的苏氨酸进行磷酸化进而激活AMPK激酶的活力。

LKB1的表达是由运动诱导的，它作为肝脏中葡萄糖生成的关键介质之一。

最近，AMPK被指出，其在治疗二型糖尿病及代谢综合症的基本疗法中，如二甲双胍、噻唑啉二酮类、运动等发挥了重要作用。

AMPK的激活，开启了分解代谢通路，增强氧化代谢和线粒体的生物合成，从而维持了能量平衡。

最近，AMPK被发现通过增加细胞内NAD+水平来增强NAD+依赖的三型脱乙酰化酶SIRT1的活性，从而调节SIRT1下游靶位点的基因的活性。

SIRT1在哺乳动物调节代谢功能和延长寿命中起到了重要作用。

SIRT1的激活同样利于营养物质的选择性利用和通过增强线粒体氧化功能调节能量平衡。

AMPK和SIRT1通过协同作用，对线粒体生物合成，PGC-1α进行调节，从而调节机体对环境和营养的刺激后的能量平衡。

PGC-1α通过与多种转录因子相互作用来刺激线粒体的代谢调节能力。

成纤维细胞生长因子-21已经被证实是一种潜在的代谢调节因子。

对经饮食诱导或遗传的肥胖的糖尿病啮齿类和恒河猴施用重组成纤维细胞生长因子-21后，其表现出了很强的抗高血糖和降低甘油三酯并减轻体重的作用。

最近研究表明，β-klotho,是一种与klotho相似的单次跨膜蛋白，最为一种FGF-21的信号的辅助受体因子来发挥其作用。

由于β-klotho在FGF-21信号中，作为一种关键的辅助因子，所以它的表达使得FGF-21仅在肝脏、胰脏和脂肪细胞组织中特异性表达，因为β-klotho主要在这些部位表达。

最近，FGF-21在肝脏中的作用已被证实，FGF-21在饥饿中对能量平衡起到了重要的调节作用。

FGF-21可通过禁食诱导表达。

在禁食中，肝脏中脂肪氧化、甘油三酯的清除及生酮代谢中，都需要FGF-21的存在。

尽管，FGF-21在肝脏代谢调节中起到了重要的作用，但是我们对于其在脂肪组织中所起到的作用还知道的很少。

此外，FGF-21在调节葡萄糖和能力平衡中的作用机制，我们仍然不清楚。

这里我们证明了FGF-21是在脂肪细胞中，通过LKB1激活来调节AMPK和SIRT1的活性来调节能量消耗的。

FGF-21改变了细胞内NAD+的水平，导致SIRT1的激活，其下游靶基因的脱乙酰基化，即PGC-1αandhistone3（H3）。

这些关键代谢效应器的激活，导致了线粒体氧化功能的增加，从而阐明了FGF-21在代谢调节中的作用。

结果

FGF-21增强了AMPK的活性为了深入研究FGF-21调节能量消耗的作用机制，我们用FGF-21（4.0μg/mL）处理3T3-L1细胞3天，通过Westernblot来分析被激活的AMPK的水平。

FGF-21的作用，使磷酸化的AMPK增加了53%（P<0.05;n=3）,但是AMPK总蛋白（t-AMPK）的水平始终没有改变（Fig.1A）.有趣的是，FGF-21（4.0μg/mLfor3d）作用于分化的人的脂肪细胞后，使得p-AMPK（P<0.05;n=3）有了很大的增加（58%），但是t-AMPK的水平没有改变（Fig.1B）.。

对人脂肪细胞用腺病毒过表达AMPK的alpha2亚单位的副结构域（DN-AMPK）抑制AMPK的活性，消除了FGF-21刺激P-AMPK的增加（Fig.1B）。

Fig.1.FGF-21增强了AMPK的活性。

（A和B）Westernblot和（A）用FGF21（4.0μg/mL）处理3天的3T3-L1细胞中P-AMPK的定量和（B）用FGF21（4.0μg/mL）处理3天的人的脂肪细胞中P-AMPK的定量。

数据是三次单独实验的平均值。

（C和D）是Westernblot和在WAT中（C）p-AMPK和（D）p-ACC，空白对照组，FGF-21处理组，对照处理组中，n=8animals/group.*P<0.05（Student’sttest）.**P<0.01.

为了探索FGF-21在体内是否增加AMPK的活性，我们用渗透泵连续的给ob/ob小鼠灌注重组人FGF-21蛋白来两周。

与以前的报告一致，FGF-21的作用导致了总体重的显著降低（Fig.S1A）,这与10到14天中少量但是显著的摄食量下降伴随着发生（Fig.S1B）。

身体和组织的组成测定发现，FGF-21处理后的动物体中，总的身体中的脂肪的质量和肝脏脂肪的含量都有明显的下降（Fig.S1C）.我们分析对照组和FGF-21实验组老鼠体内的WAT中的P-AMPK的含量时，FGF-21实验组老鼠体内的WAT中的P-AMPK的含量增加了53%，表明增加了AMPK的激活（Fig.1C）.这些数据说明，FGF-21通过激活AMPK来调节能量消耗。

为了确定FGF-21的作用是否不依赖于体重，我们做了对照饲养研究实验来比较对照组和FGF-21处理组的体重。

与之前的研究一致，FGF-21处理的老鼠未禁食的血糖水平被明显降低，而对照组则没有（Fig.S1D）.。

一个口服葡萄糖耐受实验显示，FGF-21处理后可明显提高葡萄糖的耐受（Fig.S1E）并且降低至曲线下的区域为45%（Fig.S1F）.重要的是，FGF-21处理组动物的p-AMPK的水平增加了53%，但是在对照组中则没有（Fig.1C）.此外，FGF-21处理的动物的P-ACC的水平增加了（66%）,它是AMPK下游的一个靶基因（Fig.1D）.这些数据表明FGF-21可以增强细胞内AMPK的激酶的活性。

这些结果说明，FGF-21对能量平衡的影响与AMPK激活是对立的改变体重的。

FGF-21增加NAD+新城代谢和SIRT1的活性现在，已经被证明，AMPK直接通过调节胞内NAD+/NADH的水平来直接激活SIRT1（8）.因为FGF-21增加AMPK的活性，我们猜测FGF-21是否能改变胞内NAD+/NADH的水平。

与我们的假设一致，FGF-21分别使3T3-L1细胞和人脂肪细胞中的NAD+/NADH增加了48%（P<0.05;n=3）和52%（P<0.05,n=3）（Fig.2AandC）.重要的是，NAD+/NADH的水平，在FGF-21处理的ob/ob的WAT中增加了40%（P<0.05,n=8）,但是空白对照组中却没有（Fig.2B）.用DN-AMPK抑制AMPK的活性，降低了FGF-21刺激的NAD+/NADH的增加，说明FGF-21激活AMPK在SIRT1激活的上游。

为了确定FGF-21诱导的升高的NAD+/NADH是否影响SIRT1的活性，我们确定了已知的SIRT1底物的乙酰化作用模型PGC-1αandH3.3T3-L1脂肪细胞被转染进腺病毒表达的shRNA的不含SIRT1的和腺病毒表达的一个Flag–PGC-1α结构。

转染的细胞用FGF21（4.0μg/mL）处理3d。

用FGF-21处理过的3T3-L1脂肪细胞PGC-1α的乙酰化降低了28%（P<0.05;n=3）,.shRNA敲出SIRT1（Fig.2D）的基因，降低了它的影响。

此外，在降低H3的乙酰化水平上（68%;P<0.05;n=8）经过FGF21处理的老鼠要比空白对照组明显

（Fig.2E）.这些数据表明，在体外脂肪细胞中，FGF21改变NAD+代谢水平并且激活了SIRT1a的活性。

总之，这些结果表明FGF-21是通过激活AMPK和SIRT1来控制能量代谢的。

FGF-21增加线粒体基因和蛋白的表达AMPK和SIRT1都是线粒体生物合成的关键调节因子。

为了检验FGF-21在线粒体生物合成和功能中的作用，我们对3T3-L1脂肪细胞进行荧光定量PCR来测定线粒体功能相关基因的表达。

FGF-21处理3T3-L1脂肪细胞后，导致其CPT1a的显著增加（CPT1a是参与游离脂肪酸跨线粒体膜进行脂肪β-氧化），Idh3a增加了1.6倍（是TCA循环的限速步骤），CytC增加了（Fig.S2A）.2.1倍。

此外，这些基因水平上的改变相互关联，增加了CytA蛋白的表达水平（6%;P<0.05;n=3;Fig.3A）.

此外，FGF21处理人的脂肪细胞后，显著增加了与线粒体生物合成、β-脂肪酸氧化，包括CPT1a（45%）,PPARδ（23%）,和PGC-1α（20%）的表达（Fig.S2C）.这些基因表达水平的改变也导致了CytC蛋白的表达水平（P<0.05;n=3）（Fig.3B）.

Fig2.FGF-21增加细胞内的NAD+并且降低H3的乙酰化作用。

（A）NAD+/NADH在3T3-L1脂肪细胞中的水平。

3T3-L1脂肪细胞是经过FGF-21（4.0μg/mL;blackbars）或者PBS空白处理3天。

（B））NAD+/NADH在对照组，FGF-21实验组，和空白组老鼠（N=8只动物/组）的WAT中的水平。

（C））NAD+/NADH在人的脂肪细胞中，用腺病毒表达对照载体和DN-AMPK转染脂肪细胞.转染后的脂肪细胞用FGF21（4.0μg/mL）或者;PBS处理。

（D）Westernblot定量检测3T3-L1细胞中（Ac-PGC-1α）3T3-L1脂肪细胞经过腺病毒表达SIRT1-shRNA和Flag–PGC-1αadipocytes。

Flag–PGC-1α是用表面乙酰化的赖氨酸抗体免疫沉淀和点杂交的。

t-PGC-1α,是总的PGC-1α.（E）Westernblot定量检测在对照组，FGF-21实验组，和空白组老鼠（N=8只动物/组）的WAT中的Ac-H3的水平。

所以的数据都是通过三个独立的实验的平均值得来的。

N=8只/组*P<0.05（学生实验）.

FGF-21曾经被证明其能在体内增加基因的表达。

因此，我们检测了实验组的WAT中线粒体蛋白的表达水平。

FGF-21处理的实验组动物的CytC蛋白的表达水平增加了32%（P<0.05;n=8），在对照组或者对照鼠中，没有改变（Fig.3C）.

FGF-21增强线粒体的氧化能力为了更深入的了解FGF-21对线粒体功能的影响，我们检测了FGF-21处理的3T3-L1细胞中，线粒体酶的活性，主要是检测柠檬酸合酶的活性，它是TCA循环中的一个关键的组成部分。

FGF-21显著增加了柠檬酸合酶的活力，大约增加了1.7倍，表明FGF-21增强了TCA循环的活力。

为了进一步了解FGF-21在增加线粒体氧化功能的能力，我们测定了FGF21处理后的3T3-L1和人的脂肪细胞的氧耗量。

FGF-21增加了基础氧耗量达1.2倍（P<0.05;n=3）并且增加了寡霉素处理后的3T3-L1细胞的氧耗量达1.3倍（P<0.05;n=3;Fig.3E）.FCCP是一种化学耦合器，它能废除呼吸链和氧化磷酸化系统之间的联系，并且最大化的增加线粒体的呼吸能力。

FGF-21处理后的3T3-L1细胞中，显著增强了FCCP刺激氧耗的能力，分别增加了1.9和1.7倍（P<0.01;n=3），表明FGF-21增加了氧耗，并且增强了氧化能力（Fig.3EandF）.。

FGF-21在对线粒体功能的影响时，需要LKB1,AMPK,andSIRT1的帮助为了确定FGF-21诱导的对线粒体功能的刺激是否需要AMPK，我们有新病毒表达DN-AMPK来转染人的脂肪细胞。

用DN-AMPK抑制AMPK的活性，降低了FGF-21刺激增加CPT-1aandPGC-1α基因表达和增加氧耗的能力（Fig.4B）.

因为LKB1调节AMPK的活性，我们通过使用慢性病毒表达shRNA而不表达LKB1和对照shRNA来预测FGF-21在线粒体功能的作用是否也需要LKB1。

含LKB1-shRNA的慢病毒转导后的PBS和FGF-21处理后的脂肪细胞LKB1mRNA的水平增加了大于70%（Fig.4C）.FGF21显著增强了在基础水平上的氧耗率（1.3-fold;P<0.01;n=3）和FCCP的处理（1.4-fold;P<0.001;n=3）（Fig.4D）.

因为AMPK激活SIRT1，我们接下来要探讨AMPK下游的SIRT1是否介导FGF-21对线粒体功能的影响

用腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞表达SIRT1-shRNA或者对照shRNA.这些细胞是经过FGF21（4.0μg/mL）处理3天。

在PBS-andFGF21处理后的3T3-L1脂肪细胞中SIRT1mRNA水平被SIRT1-shRNA降低了大于60%。

FGF21的作用显著增加了在基础水平上的氧耗率（1.5-fold;P<0.05;n=3），同样的效果也表现在寡霉素处理的细胞中（1.4-fold;P<0.05;n=3）和FCCP（1.7-fold;P<0.01;n=3）处理的细胞中（Fig.4F）.FGF21诱导氧耗量的增加的能力在用shRNA敲出的SIRT1基因后有所降低（Fig.4F）.总之，结果证明FGF-21是通过依赖LKB1-,AMPK-,andSIRT1通路来增强线粒体功能的。

Fig3.为FGF-21在（A）FGF-21处理后的3T3-L1细胞和（B）人脂肪细胞，空白，PBS处理，背景空白，FGF-21处理中增加线粒体蛋白的表达和功能CytC蛋白水平的结果分析。

（C）CytC蛋白的水平在对照组,FGF21处理的实验组，和空白组老鼠的WAT中（D）CS的活性FGF-21处理的3T3-L1的脂肪细胞.（E）氧耗量在3T3-L1细胞和（F）人的脂肪细胞用PBS（whitebars）或FGF21（blackbars）.数据是三次独立实验的平均值.*P<0.05;**P<0.01（Student’sttest）.

Fig.4.FGF21effectsinadipocytesrequireAMPKactivity.（A）Geneexpressioninhumanadipocytesinfectedwithadeno-virusexpressingDN-AMPKorGFP（Ctrl）andtreatedwithPBS（whitebars）orFGF21（blackbars）.（B）OxygenconsumptioninhumanadipocytesinfectedwithadenovirusexpressingDN-AMPKorGFP（Ctrl）andtreatedwithPBS（whitebars）orFGF21（blackbars）.（C）GeneexpressioninhumanadipocytesinfectedwithlentivirusexpressingshRNAagainstLKB1orcontrolshRNA（Ctrl）andtreatedwithPBS（whitebars）orFGF21（blackbars）.（D）Oxygenconsumptionin3T3-L1adipo-

cytesinfectedwithlentivirusexpressingshRNAagainstLKB1orcontrolshRNA（Ctrl）andtreatedwithPBS（whitebars）orFGF21（blackbars）.（E）GeneexpressioninhumanadipocytesinfectedwithadenovirusexpressingshRNAagainstSIRT1orcontrolshRNA（Ctrl）andtreatedwithPBS（whitebars）orFGF21（blackbars）.（F）Oxygenconsumptionin3T3-L1adipo-cytesinfectedwithadenovirusexpressingshRNAagainstSIRT1orcontrolshRNA（Ctrl）andtreatedwithPBS（whitebars）orFGF21（blackbars）.Dataareaveragesofthreeindependentexperiments.Allgene-expressiondataarequantitativeRT-PCRs,normalizedtothehousekeepinggene,TATAboxbindingpro-tein.*P<0.05;**P<0.01（Student’sttest）.***P<0.001.

FGF21介导的影响线粒体功能上需要PGC-1α因为AMPK和SIRT1都调节PGC-1α表达和活性，我们通过定量PCR来鉴定FGF-21处理的3T3-L1脂肪细胞中PGC-1α的增加。

有趣的是，经过处理的细胞中，FGF21并没有表现出增加PGC-1α的mRNA的表达（Fig.5A）.可是，我们发现FGF21通过对SIRT1的去乙酰化来调节PGC-1α的活性（Fig.2D）.为了验证FGF-21调节线粒体的功能是否需要PGC-1α,我们完成了3T3-L1细胞中shRNA敲出研究。

在经过PGC-1α–shRNA转染的3T3-L1脂肪细胞与空白相比PGC-1α的mRNA水平降低了大于70%在3T3-L1脂肪细胞中（Fig.5A）.敲除了PGC-1α降低了FGF-21在CTP-1a和CytC基因表达上的影响，完全抑制了FGF21诱导的氧耗量的在基础水平上，与寡霉素和FCCP处理的结果同（Fig.5B）。

因此，我们的结果显示，FGF-21在调节线粒体功能的综合作用中需要PGC-1α.。

Fig.5.FGF21effectsinadipocytesrequirePGC-1α.（A）PGC-1αexpressionin3T3-L1adipocytesinfectedwithshRNA-cytomegalovirus（CMV）（Ctrl）orshRNA–PGC-1αadenovirusandtreatedwithPBS（whitebars）orFGF21（blackbars）.DatashownarefromquantitativeRT-PCRs,normalizedtothehousekeepinggene,TATAboxbindingprotein.（B）Oxygenconsumptionin3T3-L1adipocytesinfectedwithshRNA-CMV（Ctrl）orshRNA–PGC-1αadenovirusandtreatedwithPBS（whitebars）orFGF21（blackbars）.Dataareaveragesofthreeindependentexperiments.*P<0.05;**P<0.01（Student’sttest）.（C）SchematicdiagramshowingFGF21activationofAMPKviaLKB1,whichindirectlyactivatesSIRT1byincreasingthecellularNAD+/NADHratio.Thepathwayconvergesonreg-ulationofPGC-1αactivityand,ultimately,onmitochondrialoxidativefunction.

讨论

这里我们证实了FGF21能通过增强线粒体的功能和效率来调节能量的自我平衡，这是通过在体内外的实验中增强AMPK和SIRT1实现的。

在图5C中我们的数据提供了FGF21的工作模型。

FGF21通过LKB1增加了AMPK的磷酸化水平。

AMPK的激活导致了细胞内NAD+水平的增加，又激活了SIRT1随后影响了多种代谢通路。

这里我们调查了调节线粒体氧化功能的通路。

结果显示FGF21在增加线粒体功能上的效果是通过PGC1-ɑ介导的。

再FGF21治疗的脂肪细胞中，AMPK和SIRT1的活化集中增强了线粒体的氧化功能，包括氧耗量的增加，柠檬酸合成酶的活性以及一些关键代谢基因的诱导，这些基因包括CPT1ɑ和CytC。

通过显性失活和shRNA腺病毒和慢病毒来抑制LKB1，AMPK和SIRT1的活性弱化了FGF-21在氧耗量和基因表达方面的作用，显示FGF-21是通过依赖于AMPK和SIRT1的机制来调节线粒体功能和增加氧容量。

在体内外实验中我们都观察到FGF-21对AMPK和SIRT1的作用，证明这些作用很可能直接与体重和肥胖的变化有关而非间接地。

Ｗａｎｇ等人已经证实，在脂肪形成过程中，PPARγ的配体结合域的７个螺旋对于PPARγ对内源性配体的应答是必须的，同样对于一些小分子的表达也是必须的如ＦＧＦ２１。

这些小分子基因的表达式受SIRT1抑制的，使SIRT1抑制能够产生与PPARγ配体相同的作用效果。

有趣的是，我们的结果还证实了，在用FGF-21治疗肥胖的过程中抑制了PPARγ的表达增强了AMPK和SIRT1的活性，很有可能SIRT1抑制FGF-21的表达在脂肪形成过程中是必要的，但是在成熟的脂肪细胞中FGF-21能增强SIRT1